單核細(xì)胞移動抑制因子對大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷保護(hù)作用研究

丁華敏,秦春霞,馬凱源,孫莉莉，章越凡，李鐵軍,

(1.上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院藥劑科,上海 200125；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012)

顱腦損傷(TBI)是創(chuàng)傷中常見的病癥之一，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，TBI發(fā)病率位于各類創(chuàng)傷之首，有著較高的病殘率和病死率，嚴(yán)重影響人們的身體健康與生活質(zhì)量。而隨著社會交通的發(fā)展，TBI發(fā)病率也在逐年攀升。研究證明，TBI誘發(fā)的水腫、炎癥和氧化應(yīng)激等復(fù)雜的反應(yīng)會進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞損傷。目前，在臨床中缺乏治療TBI的藥物，至今30多個III期前瞻性臨床試驗(yàn)均未能獲得令人滿意的結(jié)果，無一種藥物具有確切的臨床療效[1]。

單核細(xì)胞遷移抑制因子(monocyte locomotion inhibitory factor，MLIF)是由溶組織內(nèi)阿米巴產(chǎn)生的一種熱穩(wěn)定性化合物[2](相對分子質(zhì)量583000)。體內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn)，MLIF可以發(fā)揮抗炎和免疫保護(hù)作用，對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)損傷、心肌缺血、腦缺血及癡呆具有良好的保護(hù)作用。Zhang等[3]證實(shí)MLIF通過與核糖體蛋白翻譯延長因子eEF1A1結(jié)合而發(fā)揮作用。其中，MLIF與eEF1A1結(jié)構(gòu)域的區(qū)段1(domain1)結(jié)合，抑制腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，升高eNOS的表達(dá)量，改變內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而發(fā)揮保護(hù)作用。MLIF使體循環(huán)中NO含量和脂質(zhì)過氧化物的水平降低，iNOS基因表達(dá)降低，同時MLIF提高IL-10和TGF-β的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)MLIF在腦缺血損傷方面能夠發(fā)揮顯著的保護(hù)作用，MLIF可以降低大鼠/小鼠腦缺血模型中腦梗死面積，能夠抑制細(xì)胞黏附因子發(fā)揮保護(hù)血管的作用，并且可抑制MPO、TNF-α、IL-1β的過量表達(dá)。提示MLIF可能具有顱腦損傷保護(hù)作用[5]。本實(shí)驗(yàn)采用液壓沖擊法建立大鼠顱腦損傷模型，觀察MLIF對大鼠顱腦創(chuàng)傷的保護(hù)作用，探索MLIF可能的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為其預(yù)防與治療顱腦損傷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

MLIF(杭州中肽生化有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(MDA)活性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；水合氯醛、4%多聚甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

健康成年SD大鼠，雄性，清潔級，體重250～300 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司。實(shí)驗(yàn)前，動物房適應(yīng)飼養(yǎng)1周，室溫(25±2)℃，相對濕度40%～70%，自由進(jìn)食和飲水。所有動物實(shí)驗(yàn)過程均符合實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求。

1.3 儀器與設(shè)備

ALC-FP6型動物液壓沖擊顱腦損傷儀(上海奧爾科特生物科技有限公司)；FA1104型電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；腦立體定位儀(瑞沃德生命科技有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠顱腦創(chuàng)傷模型的制備

參照Mcintosh等[6]的實(shí)驗(yàn)方法，采用液壓沖擊法建立大鼠顱腦創(chuàng)傷模型。大鼠稱重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥于手術(shù)臺上，大鼠頭部固定于腦立體定位儀上。大鼠頭頂部去毛，碘酒消毒頭皮。沿正中矢狀線剪開長約1.5 cm的頭皮切口，分離骨膜，暴露顱骨。腦立體定位儀定位選取右側(cè)顱頂冠狀縫后2 mm、矢狀縫旁開2 mm處，用牙科鉆磨開一直徑為5 mm的圓形骨窗，保持硬腦膜的完整。將自制打擊管用牙科水泥粘接固定于圓形骨窗上，待打擊管固定牢固后，用37℃生理鹽水將打擊管注滿。待大鼠恢復(fù)角膜反射或夾尾反射后，將打擊管與液壓沖擊儀端口連接，調(diào)整液壓沖擊儀(強(qiáng)度為2.026×105Pa)進(jìn)行打擊。然后取下打擊管，消毒、縫合頭皮，將大鼠放回籠中飼養(yǎng)。打擊后瞬間，大鼠出現(xiàn)四肢抽搐，同時有數(shù)秒的呼吸抑制現(xiàn)象，表明打擊造模成功。假手術(shù)組僅剪開頭皮，分離骨膜，磨出骨窗，不進(jìn)行液壓沖擊，其余步驟與模型組相同。

2.2 腦組織含水量測定

2.2.1不同給藥劑量下大鼠腦組織含水量測定

實(shí)驗(yàn)大鼠分為5組：假手術(shù)組、模型組、MLIF低、中、高劑量組(0.33、1、3 mg/kg)。假手術(shù)組、模型組給予等體積的生理鹽水。顱腦創(chuàng)傷后30 min內(nèi)完成第1次尾靜脈注射給藥。創(chuàng)傷后24 h，水合氯醛麻醉大鼠處死，迅速斷頭取腦，濾紙吸干表面水分，用天平精密稱取濕重，置于110℃烘箱中烘烤24 h至恒重，稱取干重。參考Elliot公式計(jì)算：腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

2.2.2不同給藥時間點(diǎn)大鼠腦組織含水量測定

實(shí)驗(yàn)大鼠分為3組：假手術(shù)組、模型組、MLIF(1 mg/kg)組。顱腦創(chuàng)傷后30 min內(nèi)完成第1次給藥，創(chuàng)傷后每天尾靜脈注射給藥1次，連續(xù)7 d。假手術(shù)組、模型組給予等體積的生理鹽水。分別于顱腦創(chuàng)傷后1、3、7 d，取出腦組織，測定腦組織含水量。

2.3 血清中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量檢測

大鼠分組及給藥方法同“2.2.2”項(xiàng)。分別于顱腦創(chuàng)傷后1、3、7 d，大鼠取血后離心，分離血清。按照SOD和MDA試劑盒說明書檢測兩者水平。

2.4 腦組織病理學(xué)檢查

大鼠分組及給藥方法同“2.2.2”項(xiàng)。分別于顱腦創(chuàng)傷后1、3、7 d，大鼠用10%水合氯醛麻醉，用生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注后，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中固定24 h。石蠟包埋切片，行HE染色和尼氏染色，觀察腦組織神經(jīng)元細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 MLIF對顱腦創(chuàng)傷大鼠的保護(hù)作用

3.1.1不同給藥劑量對腦創(chuàng)傷大鼠腦組織含水量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦創(chuàng)傷后腦含水量顯著增加(P<0.01)，見圖1。MLIF低、中、高劑量組(0.33、1、3 mg/kg)腦含水量與模型組相比明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。MLIF中劑量組(1 mg/kg)腦水腫程度減輕效果最好，故實(shí)驗(yàn)選用MLIF 1 mg/kg劑量進(jìn)行氧化應(yīng)激水平和病理學(xué)研究。

圖1 不同劑量MLIF對顱腦創(chuàng)傷大鼠腦組織含水量 的影響(-x±s，n=12)**P<0.01，與模型組比較；##P<0.01，與假手術(shù)組比較

3.1.2MLIF對大鼠腦創(chuàng)傷不同時間點(diǎn)腦組織含水量的影響

分別于大鼠在腦創(chuàng)傷后1、3、7 d斷頭取腦，創(chuàng)傷后1 d，模型組大鼠腦含水量顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；與模型組比較，給予MLIF(1 mg/kg)組大鼠腦含水量顯著降低(P<0.01)。創(chuàng)傷后3 d，模型組腦含水量到達(dá)一個高峰，顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；MLIF(1 mg/kg)組大鼠腦含水量明顯低于模型組(P<0.01)。創(chuàng)傷后7 d，模型組與MLIF(1 mg/kg)組大鼠腦含水量均下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖2。

圖2 大鼠顱腦創(chuàng)傷后不同時間點(diǎn)腦 含水量變化(%)(-x±s，n=8)**P<0.01，與模型組比較；##P<0.01，與假手術(shù)組比較

3.2 MLIF對腦創(chuàng)傷大鼠血清中SOD和MDA水平的影響

MLIF對顱腦創(chuàng)傷大鼠血清中SOD和MDA含量的影響結(jié)果見圖3。

圖3 MLIF對顱腦創(chuàng)傷大鼠血清中SOD和MDA含量 的影響(-x±s，n=8) A.大鼠血清SOD水平；B.大鼠血清MDA水平*P<0.05， **P<0.01，與模型組比較；##P<0.01，與假手術(shù)組比較

創(chuàng)傷后1 d，模型組大鼠血清中SOD含量顯著降低，與假手術(shù)組比較(P<0.01)；與模型組比較，MLIF (1 mg/kg)組大鼠血清中SOD含量明顯升高(P<0.05)。創(chuàng)傷后3 d，模型組大鼠血清中SOD含量顯著低于與假手術(shù)組(P<0.01)；MLIF(1 mg/kg)組大鼠血清中SOD含量顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。創(chuàng)傷后7 d，模型組與MLIF (1 mg/kg)組大鼠血清中SOD含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MDA檢測水平方面，創(chuàng)傷后1 d，模型組大鼠血清中MDA含量顯著升高，與假手術(shù)組比較(P<0.01)；MLIF (1 mg/kg)組大鼠血清中MDA含量較模型組明顯降低(P<0.01)。創(chuàng)傷后3 d，模型組大鼠血清中MDA含量明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)；MLIF (1 mg/kg)組大鼠血清中MDA含量顯著降低，與模型組比較(P<0.05)。創(chuàng)傷后7 d，模型組與MLIF (1 mg/kg)組大鼠血清中MDA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 MLIF對腦創(chuàng)傷大鼠腦組織病理損傷的影響

HE染色結(jié)果如圖4所示。假手術(shù)組：腦組織皮層結(jié)構(gòu)正常，未見出血、水腫及損傷，各細(xì)胞層次清楚，排列整齊有序，神經(jīng)元核仁清晰，無血管擴(kuò)張現(xiàn)象。模型組：創(chuàng)傷后1 d，創(chuàng)傷灶及其周邊組織發(fā)生明顯水腫，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞胞體輕微腫脹，可見細(xì)胞核固縮或破碎。創(chuàng)傷后3 d，腦創(chuàng)傷灶及其周邊組織水腫加重，神經(jīng)細(xì)胞腫脹進(jìn)一步加深，胞漿濃染，細(xì)胞核固縮及缺失，炎性細(xì)胞浸潤。創(chuàng)傷后7 d，神經(jīng)細(xì)胞腫脹明顯減輕，正常細(xì)胞數(shù)量稍有增多。MLIF(1 mg/kg)組：創(chuàng)傷后1 d，創(chuàng)傷區(qū)域組織較模型組水腫程度明顯減輕，神經(jīng)細(xì)胞腫脹減少。創(chuàng)傷后3 d，創(chuàng)傷及周圍組織仍有水腫，但較模型組明顯減輕。部分空泡中央細(xì)胞缺失，核固縮程度稍有好轉(zhuǎn)。創(chuàng)傷后7 d，水腫顯著減輕，神經(jīng)細(xì)胞腫脹好轉(zhuǎn)。

圖4 HE染色觀察各組大鼠腦組織病理學(xué)變化(400×)

3.4 MLIF對腦創(chuàng)傷大鼠腦組織神經(jīng)元存活的影響

神經(jīng)組織的基本組成成分主要包括神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。而尼氏體為神經(jīng)元合成蛋白質(zhì)的主要場所，因此與神經(jīng)元的功能發(fā)揮關(guān)系密切。當(dāng)各種誘發(fā)因素導(dǎo)致神經(jīng)元受損害變性時，則會通過尼氏體的形狀、大小和數(shù)量表現(xiàn)出來。課題組分別對顱腦創(chuàng)傷后1、3、7 d大鼠大腦皮層神經(jīng)元進(jìn)行尼氏染色，觀察腦組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)的改變。從圖5可以看出，假手術(shù)組：皮層區(qū)神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，排列整齊，尼氏小體數(shù)量較多，染色均勻，清楚可見。模型組：神經(jīng)元細(xì)胞大量減少，同時可見壞死、核固縮，神經(jīng)元排列紊亂、無層次感。MLIF(1 mg/kg)組：神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯增加，正常形態(tài)細(xì)胞較模型組稍多，神經(jīng)元損傷較模型組輕。

4 討論

嚙齒動物模型在TBI研究中最為常見[7]。目前，顱腦創(chuàng)傷主要有4個具體的動物模型廣泛用于研究：流體沖擊傷害(FPI)模型、受控皮質(zhì)影響(CCI)損傷模型、重物下降沖擊加速度損傷模型和爆炸傷模型。FPI模型復(fù)制臨床TBI而無顱骨骨折。FPI可以復(fù)制顱內(nèi)出血、腦腫脹和進(jìn)行性灰質(zhì)損害，這些都是人類TBI的病理生理學(xué)標(biāo)志。

腦水腫是臨床常見的病癥，水腫的形成主要是由于血管外液體積聚和水代謝紊亂。目前，腦水腫可以分為兩大類，即細(xì)胞毒性(又稱細(xì)胞性)水腫或血管源性水腫[8]。事實(shí)上，一些研究報(bào)告指出，大腦水腫引起的死亡率可能占總死亡率的一半，年輕人群中 TBI 的患病率更高[9-10]。腦水腫會導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，改變細(xì)胞代謝物濃度，從而改變細(xì)胞生理學(xué)、生物化學(xué)和其他細(xì)胞功能。腫脹不僅涉及細(xì)胞本身而且涉及薄壁組織，從而引起顱內(nèi)壓迅速增加，導(dǎo)致血管壓縮，組織血流減少，進(jìn)而損害大腦正常功能[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，MLIF能夠明顯降低腦含水量，減輕腦水腫，從而發(fā)揮對顱腦創(chuàng)傷的保護(hù)作用。

圖5 尼氏染色觀察各組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)(400×)

氧化應(yīng)激增加是影響創(chuàng)傷后損傷的另一個關(guān)鍵因素，因?yàn)榇竽X對游離的自由基高度敏感[12]。在TBI之后，自由基過量產(chǎn)生的幾個潛在來源包括：線粒體呼吸鏈、兒茶酚胺氧化、膜磷脂分解、氧化酶活化、浸潤嗜中性粒細(xì)胞、在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外抗氧化防御系統(tǒng)受到攻擊。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激是引起TBI后繼發(fā)性損傷級聯(lián)反應(yīng)的主要原因。而氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD和MDA的含量則能反映機(jī)體氧化應(yīng)激的水平[13]。

課題組采用大鼠液壓沖擊法制備大鼠顱腦創(chuàng)傷模型，給予MLIF干預(yù)，結(jié)果顯示，MLIF能夠降低腦創(chuàng)傷大鼠腦組織含水量，減輕腦水腫；MLIF可以提高SOD活性，減少M(fèi)DA含量，抑制腦損傷氧化應(yīng)激反應(yīng)；并且保護(hù)腦組織神經(jīng)元受損，對腦組織病理損傷有明顯的改善作用；實(shí)驗(yàn)表明，MLIF對顱腦創(chuàng)傷具有保護(hù)作用。對于MLIF保護(hù)顱腦創(chuàng)傷的具體作用環(huán)節(jié)和主要作用靶點(diǎn)尚不清楚，還有待深入研究。