發(fā)酵飼料分析檢測技術(shù)

陳影 盧宗梅 張琳 徐曉然 王梅 佟毅

摘? ? ? 要：近年來，生物飼料研究與應(yīng)用已經(jīng)成為飼料行業(yè)研究的熱點(diǎn);其中發(fā)酵飼料中的發(fā)酵混合飼料，涉及到單菌種發(fā)酵和多菌種發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)品成分復(fù)雜。國家或行業(yè)正在積極制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)中需要明確常規(guī)指標(biāo)，還需要對其酸度、有機(jī)酸、益生菌、蛋白質(zhì)、糖類化合物等有益處指標(biāo)和霉菌等有害指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)控。

關(guān)? 鍵? 詞：發(fā)酵飼料;常規(guī)指標(biāo);酸度;益生菌

中圖分類號：O652? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A? ? ? ?文章編號： 1671-0460（2019）09-2060-04

Abstract： In recent years， the research and application of biological feed has become a hot spot in feed industry. The fermented mixed feed in the fermented feed involves single-species fermentation and multi-species fermentation， and the ingredients of the fermented product are complex. Their relevant standards are being actively developed. The standards need to specify general indicator. They also need to specify the acidity， organic acids， probiotics， proteins， sugars and other beneficial indicators， as well as harmful indicators including molds.

Key words： Fermented feed; General indicators; Acidity; Probiotics

近年來，生物飼料研究與應(yīng)用已經(jīng)成為飼料行業(yè)研究的熱點(diǎn)?！掇r(nóng)業(yè)部“十三五”規(guī)劃》也明確提出生物飼料產(chǎn)業(yè)對促進(jìn)農(nóng)副資源飼料化與高效利用、推動飼料配方體系的變革、改善動物生產(chǎn)性能、降低養(yǎng)殖成本、實(shí)現(xiàn)從減抗到無抗養(yǎng)殖、減排環(huán)保等具有重要意義。

生物飼料是未來發(fā)展方向，目前我國從事生物飼料行業(yè)的企業(yè)數(shù)量已經(jīng)有1 000多家，微生物飼料添加劑和酶制劑產(chǎn)量已經(jīng)超過20萬t，發(fā)酵飼料產(chǎn)品產(chǎn)量110多萬t，增幅超過20%。國家對于發(fā)酵飼料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與控制，也在不斷的規(guī)范發(fā)展。生物飼料領(lǐng)域第1個團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T /CSWSL 001—2018《生物飼料產(chǎn)品分類》于2018 年1 月1 日發(fā)布，《發(fā)酵飼料技術(shù)通則》、《飼料原料釀酒酵母培養(yǎng)物》、《飼料原料釀酒酵母發(fā)酵白酒糟》和《飼料添加劑植物乳桿菌》4 項(xiàng)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)于2018 年9 月7 日發(fā)布，對規(guī)范我國生物飼料產(chǎn)業(yè)自律性和行業(yè)健康發(fā)展意義重大。

1? 飼料原料

1.1? 發(fā)酵飼料

《飼料原料目錄》中含有12類：谷物及其加工產(chǎn)品，油料籽實(shí)及其加工產(chǎn)品，豆科作物籽實(shí)及其加工產(chǎn)品，塊莖、塊根及其加工產(chǎn)品，其它籽實(shí)、果實(shí)類產(chǎn)品及其加工產(chǎn)品，飼草、粗飼料及其加工產(chǎn)品，其它植物、藻類及其加工產(chǎn)品，乳制品及其副產(chǎn)品，陸生動物產(chǎn)品及其副產(chǎn)品，魚、其它水生生物及其副產(chǎn)品，礦物質(zhì)，微生物發(fā)酵產(chǎn)品及副產(chǎn)品。

生物飼料[1]，總體來講，要使用在我們允許的飼料目錄和添加劑里的原料，通過生物工程技術(shù)，進(jìn)行處理，包括發(fā)酵飼料、酶解飼料、菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料和生物飼料添加劑。

使用《飼料原料目錄（2013）》和《飼料添加劑品種目錄（2013）》等國家相關(guān)法規(guī)允許使用的飼料原料和微生物，通過發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)、含有微生物或其代謝產(chǎn)物的單一飼料和混合飼料。

鑒于生物飼料添加劑種類繁多，本文僅就發(fā)酵飼料的檢測技術(shù)進(jìn)行綜述。

1.2? 常規(guī)檢測指標(biāo)

《GB/T 6435飼料水分的測定》、《GB/T 12456 食品中總酸的測定》、《GB/T 6432 飼料中粗蛋白測定方法》、《GB/T 643飼料中粗脂肪的測定》、《GB/T 6434 飼料中粗纖維的含量測定過濾法》、《GB/T 6438 飼料中粗灰分的測定》、《GB/T 18246飼料中氨基酸的測定》、《GB/T 22492 大豆肽粉》、《GB/T 6439 飼料中水溶性氯化物的測定》、《GB/T 13885 飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉和鋅含量的測定》、《GB/T 20806飼料中中性洗滌纖維（NDF）的測定》、《NY/T 1459 飼料中酸性洗滌纖維的測定》、《GB/T 17817飼料中維生素A的測定 高效液相色譜法》、《GB/T 20194動物飼料中淀粉含量的測定 旋光法》。

1.3? 衛(wèi)生指標(biāo)

《GB 13078 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》、《GB/T 13079 飼料中總砷的測定》、《GB/T 13080飼料中鉛的測定》、《GB/T13092 飼料中霉菌總數(shù)測定方法》、《GB/T17480 飼料中黃曲霉毒素B1的測定方法》、《GB/T 30956 飼料中DON測定》、《GB/T 28716 飼料中玉米赤霉烯酮的測定》、《GB/T 18869 飼料中大腸菌群的測定》。

1.4? 微生物指標(biāo)

《GB/T20191 飼料中嗜酸乳桿菌的微生物學(xué)檢驗(yàn)》、《GB/T26428 飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》、《 NY/T 2131飼料添加劑枯草芽孢桿菌》、《NY/T 1461飼料微生物添加劑地衣芽孢桿菌》、《NY/T 1969飼料添加劑產(chǎn)朊假絲酵母》、《GB/T 22547飼料添加劑 飼用活性干酵母》、《GB 4789.2食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》。

1.5? 規(guī)則規(guī)范

《飼料原料目錄》、《飼料添加劑品種目錄》、《飼料添加劑安全使用規(guī)范》、《JJF1070定量包裝商品凈含量計(jì)量檢驗(yàn)規(guī)則》、《定量包裝商品計(jì)量監(jiān)督管理辦法》、《GB 10648 飼料標(biāo)簽》、《GB/T 14699.1 飼料采樣》、《GB/T 16764配合飼料企業(yè)衛(wèi)生規(guī)范》、《GB/T 10647飼料工業(yè)術(shù)語》、《GB/T 20195 動物飼料 試樣的制備》、《GB/T 18823飼料檢測結(jié)果判定的允許誤差》。

1.6? 延伸檢測指標(biāo)

《GB/T 5009.157食品中有機(jī)酸的測定》、《NY/T 2796水果中有機(jī)酸的測定 離子色譜法》、《GB/T 23881飼用纖維素酶活性的測定 濾紙法》、《NY/T 912 飼料添加劑 纖維素酶活力的測定分光光度法》、《 GB/T 28715 飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定 分光光度法》、《NY/T 1372-2007 飼料中三聚氰胺的測定》。

2? 關(guān)鍵檢測項(xiàng)目

2.1? 酸度

2.1.1? 分類

可以采用化學(xué)滴定法和液相色譜法測定?；瘜W(xué)滴定法測定的是游離酸，結(jié)果以乳酸計(jì)（游離酸中乳酸占主導(dǎo)）;液相色譜法測定的是游離酸與有機(jī)酸鹽，結(jié)果是以游離酸含量計(jì)。

如果液相色譜法存在分離度低的情況時(shí)，可以用生物傳感分析儀等其他方法[2]對乳酸和乙酸進(jìn)行測定。

2.1.2? 化學(xué)滴定法

（1）樣品處理：取有代表性樣品至少200 g，放入粉碎機(jī)粉碎，使其能完全通過40目篩孔，充分混合。稱取1～2 g試樣，精確至0.000 1 g，置于100 mL燒杯中，加入100 mL無二氧化碳水，加入轉(zhuǎn)子，在磁力攪拌器上攪拌10 min，使試樣中的有機(jī)酸全部溶解于溶液中。

（2）測定過程

方法一：待測定溶液中加入0.2 mL 1%的酚酞指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至微紅色30 s不褪色。記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

方法二：用pH值指示終點(diǎn)， 0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定控制pH在8.0～10.0之間。記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

（3）結(jié)果處理

根據(jù)酸堿中和原理和化學(xué)反應(yīng)的計(jì)量關(guān)系，計(jì)算氫離子含量，結(jié)果以乳酸計(jì)。計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。同一樣品兩次測定結(jié)果之差，不得超過兩次測定平均值的2%。

2.1.3? 液相色譜法

有機(jī)酸的測定方法有離子色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法等[2];HPLC法具有方法簡單，分析速度快，靈敏度高的特點(diǎn)[3]。

因飼料原料與發(fā)酵產(chǎn)物成分的復(fù)雜性，導(dǎo)致組分分離度低，造成測定結(jié)果偏高的現(xiàn)象。此時(shí)可以用兩種色譜柱分別進(jìn)行檢測，并進(jìn)行對比。 一種方法是用C18柱（GB/T 5009.157食品中有機(jī)酸的測定），還可以采用有機(jī)酸氫柱進(jìn)行分析，參數(shù)如下：

色譜柱：Aminex HPX-87H， 300 mm×7.8 mm;

保護(hù)柱： Micro-Guard Cation H cartridge，30×4.6 mm;

流動相： 0.005 mol/L H2SO4;

溫? 度： 65 ℃;

流? 速：0.6 mL/min;

進(jìn)樣量： 15μL;

檢測器： 示差折光檢測器;

分析時(shí)間： 30 min。

2.1.4? 生物傳感分析儀法

SBA-40D型生物傳感分析儀利用酶促反應(yīng)來進(jìn)行定量分析，測定的關(guān)鍵傳感器是固定化酶和H2O2電極復(fù)合傳感器。

樣品經(jīng)稀釋到合適的濃度范圍，用進(jìn)樣針從進(jìn)樣口注入反應(yīng)池內(nèi)，由反應(yīng)池?cái)嚢柘到y(tǒng)混勻?；靹虻臉悠吠高^固定化酶傳感器的支撐膜，在酶的催化下發(fā)生上式所示的生化反應(yīng)，產(chǎn)生H2O2。因?yàn)榉磻?yīng)池恒體積，每次進(jìn)樣量也固定，所以反應(yīng)池內(nèi)樣品濃度與進(jìn)樣樣品濃度是固定的比例關(guān)系。酶反應(yīng)放出的H2O2透過酶膜的內(nèi)層在鉑金電極表面失去電子還原成H2O，鉑電極獲得電子產(chǎn)生電流信號，該電流信號與H2O2的濃度成比例，而H2O2濃度與底物濃度成線性比例關(guān)系。通過比較被測物和標(biāo)準(zhǔn)樣品產(chǎn)生的H2O2量，就可計(jì)算出被測樣品中底物的含量。

分析過程基于以下生化反應(yīng)（表1）：

2.2? 益生菌

枯草芽孢桿菌和乳酸菌、酵母菌有區(qū)別，它在發(fā)酵飼料中存在營養(yǎng)體與芽孢體。如果測定樣品中芽孢體可全部參照國家標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理方法，如果測定樣品中的總數(shù)，則不能將樣品80 ℃水溶處理，因?yàn)闋I養(yǎng)體在此條件下能被滅活。

單一微生物的計(jì)數(shù)方法均可參照國家標(biāo)準(zhǔn)，但對于添加多種微生物的發(fā)酵飼料，由于微生物之間的相互作用，造成平板上菌落類型多、計(jì)數(shù)低的情況，進(jìn)而對質(zhì)量無法進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。因此根據(jù)微生物特性，對樣品進(jìn)行預(yù)處理和選擇合適的培養(yǎng)基，能準(zhǔn)確檢測益生菌數(shù)量。

發(fā)酵飼料中枯草芽孢桿菌用水稀釋后在NA平板上涂布，嗜酸乳桿菌用50 mg/L 納他霉素溶液稀釋后在MRS平板上涂布[4]，產(chǎn)朊假絲酵母菌用水稀釋后在孟加拉紅平板上涂布（圖1-3）。

2.3? 蛋白質(zhì)

2.3.1? 分類

含氮物質(zhì)，分為無機(jī)氮和有機(jī)氮。有機(jī)氮可分為水溶性有機(jī)氮和水不可溶性有機(jī)氮，也可分為酸溶性有機(jī)氮和酸不溶性有機(jī)氮。在飼料發(fā)酵過程中，關(guān)注的指標(biāo)是無機(jī)氮、水溶性有機(jī)氮、酸溶性有機(jī)氮、游離氨基酸、總氨基酸。

2.3.2? 無機(jī)氮

無機(jī)氮是非蛋白氮，其含量的高低影響飼料中粗蛋白的含量。樣品不需要消解，可直接測定或用水或酸溶解后測定清液。

2.3.3? 有機(jī)氮

水溶性有機(jī)氮：精確稱取一定量的樣品（40目通過率100%），用水溶解，混勻并靜置5 min，過濾，去除初濾液，濾液作為待測液。樣品消解后測定總氮，減去水溶性無機(jī)氮。

酸溶性有機(jī)氮：精確稱取一定量的樣品（40目通過率100%），用15%的三氯乙酸溶液溶解，混勻并靜置5 min，過濾，去除初濾液，濾液作為待測液。樣品消解后測定總氮，減去酸溶性無機(jī)氮。

2.3.4? 氨基酸

游離氨基酸：精確稱取一定量的樣品（40目通過率100%），用pH=2.2的檸檬酸鈉緩沖溶液溶解混勻并靜置5 min，過濾，去除初濾液，濾液作為待測液用氨基酸分析儀進(jìn)行測定。

總氨基酸：不同的氨基酸采用不同的消解方法。酸水解測定賴氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸。堿水解測定色氨酸。氧化水解測定蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸。

2.3.5? 肽

肽=酸溶蛋白-游離氨基酸。

2.4? 碳水化合物

同蛋白質(zhì)，存在還原糖、可溶性總糖、淀粉之分。最主要是根據(jù)試驗(yàn)或生產(chǎn)需要選擇測定合適的檢測項(xiàng)目。

在發(fā)酵飼料生產(chǎn)過程中，微生物需要利用可溶性還原糖或可溶性多糖通過酶解作用轉(zhuǎn)化的可溶性還原糖;因此在制定發(fā)酵飼料配方時(shí)，需要考慮提供的糖能否滿足微生物的生長代謝需求，進(jìn)而才能得到需要的代謝產(chǎn)物。而在最終的發(fā)酵飼料產(chǎn)品中，因涉及到發(fā)酵飼料如何在日糧中添加的問題，比較關(guān)注對飼料中最終存在的還原糖、淀粉等。

3? 結(jié) 論

發(fā)酵飼料的檢測項(xiàng)目，首先是衛(wèi)生指標(biāo)，必須符合國家標(biāo)準(zhǔn);其次是理化指標(biāo)，需根據(jù)生產(chǎn)廠家的質(zhì)量目標(biāo)而定;這兩類項(xiàng)目需要在企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中明確標(biāo)注。最后是宣傳指標(biāo)，可對有益營養(yǎng)成分或產(chǎn)品的亮點(diǎn)指標(biāo)如氨基酸、酶活力、有機(jī)酸等進(jìn)行介紹，可附有第三方檢測機(jī)構(gòu)出具的檢測報(bào)告作為證明。

發(fā)酵飼料的檢測方法，主要依據(jù)相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但并不是全部參照方法，需要結(jié)合樣品的實(shí)際特性和需求進(jìn)行選擇。

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