環(huán)境微生物快速鑒定與檢測技術(shù)研究進(jìn)展

摘 ?要：微生物廣泛分布于水、空氣、土壤等多種環(huán)境介質(zhì)中，并在其中發(fā)揮重要作用。當(dāng)今微生物分析標(biāo)準(zhǔn)主要方法仍是傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，然而，培養(yǎng)法存在培養(yǎng)周期長、特異性差、敏感度不高、無法檢測活的非可培養(yǎng)態(tài)細(xì)菌^[1]。如何準(zhǔn)確、快速、有效地對不同環(huán)境介質(zhì)中微生物進(jìn)行鑒定與監(jiān)測，已經(jīng)成為國內(nèi)外微生物研究領(lǐng)域的熱點。本文綜述目前環(huán)境領(lǐng)域的微生物鑒定與監(jiān)測技術(shù)，對不同方法進(jìn)行比較分析，旨在分析各種方法的利弊，為有效獲取微生物監(jiān)測數(shù)據(jù)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：環(huán)境;微生物;鑒定;監(jiān)測

中圖分類號：Q938?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ?文章編號：1671-2064（2019）16-0000-00

1 微生物定性定量分析

用于微生物定性定量分析方法包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、熒光定量PCR（qPCR）、數(shù)字PCR（dPCR）和熒光原位雜交（FISH）等。

1.1 PCR

常規(guī)的PCR主要是基于溫度變化時DNA鏈“變性-復(fù)性-延伸”的原理，通過設(shè)計特異性的引物，對目標(biāo)微生物的特征基因片段進(jìn)行擴增，從而判定樣品中是否含有某類微生物及其濃度。PCR擴增的終產(chǎn)物可根據(jù)后續(xù)電泳條帶位置和亮度進(jìn)行定性和半定量分析。

1.2 qPCR

熒光定量PCR技術(shù)在PCR體系中加入熒光探針或熒光染料，利用熒光信號變化實時監(jiān)測PCR擴增過程中每一輪循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行相對和絕對定量。優(yōu)點是靈敏度更高，特異性更強，實現(xiàn)實時定量分析。Knappik等比較細(xì)菌培養(yǎng)法和qPCR等方法在檢測老撾土壤和水體中類鼻疽伯克霍爾德桿菌的差異^[2]。結(jié)果表明對于土壤和水體樣品，經(jīng)富集培養(yǎng)后使用qPCR法的樣品陽性檢出率顯著高于單獨培養(yǎng)法和單獨qPCR法。

1.3 dPCR

qPCR依賴擴增曲線Ct值定量，受不同樣品間擴增效率影響較大，而dPCR不依賴于Ct值即可進(jìn)行定量。原理是將DNA樣本溶液隨機分配到大量獨立反應(yīng)單元，在每個反應(yīng)單元進(jìn)行PCR擴增，根據(jù)泊松公式通過統(tǒng)計反應(yīng)單元熒光信號來定量DNA。Doi等比較使用液滴數(shù)字PCR（ddPCR）和qPCR技術(shù)檢測池塘中侵入性藍(lán)鰓太陽魚的環(huán)境DNA（eDNA）^[3]。表明使用ddPCR比qPCR有更高的檢出率，ddPCR對水體中存在的有機質(zhì)PCR抑制物有更好的抵抗性能，在eDNA檢測方面比熒光定量PCR更具優(yōu)勢。

1.4 FISH

FISH利用非放射性熒光物質(zhì)標(biāo)記的DNA或RNA序列作為探針，按照堿基互補原則，與待測樣品的DNA或RNA進(jìn)行特異性結(jié)合，再通過熒光顯微鏡等觀察研究微生物特定核苷酸序列的存在、數(shù)目和定位^[4]。FISH具有快速、可原位和定量分析等優(yōu)點，但由于細(xì)菌普遍存在的自發(fā)熒光現(xiàn)象可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果^[5]。

2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析的方法較多，比較常見的有傳統(tǒng)變性梯度凝膠電泳（DGGE）、末端限制性酶切片長度多態(tài)性（T-RFLP）等方法。近年來，高通量測序技術(shù)（High Thoughput Sequencing）迅猛發(fā)展，逐漸成為微生物群落結(jié)構(gòu)分析的主要研究手段。

2.1 DGGE

DGGE技術(shù)是在普通凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的DNA分離技術(shù)，最早由Lerman等提出^[6]。主要原理是堿基序列存在差異的DNA在含不同濃度變性劑的聚變稀酰胺凝膠中解鏈行為不同，根據(jù)電泳遷移速率的變化，可以將片段大小完全相同、僅堿基組成不同的DNA片段分開。經(jīng)DGGE變性分離的DNA條帶割膠回收后可以進(jìn)行圖譜聚類分析或序列分析^[7]。在微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性分析研究中，普遍采用PCR-DGGE是先將提取的樣品DNA進(jìn)行PCR擴增后，再進(jìn)行DGGE分離、測序。DGGE也存在如下缺點：

1. 實驗步驟較為繁瑣，摸索最適實驗條件耗時較長;
2. 由于16SrDNA不同拷貝之間的多態(tài)性，易導(dǎo)致對種群細(xì)菌豐度的高估;
3. 只有占群落細(xì)菌數(shù)量一定比例的類群才能被DGGE檢測;
4. 對DGGE條帶中微生物分類鑒定還需要進(jìn)行條帶切割、PCR擴增、分子克隆并測序，由于分辨率低，所割取的亮帶常包含兩種以上微生物^[8]。

2.2 T-RFLP

利用T-RFLP技術(shù)分析微生物群落，首先確定目標(biāo)DNA片段，根據(jù)目標(biāo)基因上的保守區(qū)域設(shè)計一對引物，其中一個引物的5末端用熒光物質(zhì)標(biāo)記。然后提取待測樣品總DNA，經(jīng)PCR擴增后，擴增產(chǎn)物的一端帶有這種熒光標(biāo)記物。再利用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化PCR擴增產(chǎn)物，獲得長短不一的限制性片段（T-RFs），通過DNA測序儀對末端帶有熒光標(biāo)記物的片段進(jìn)行檢測。由于核苷酸序列具有多態(tài)性，不同長度的末端限制性片段可代表不同的微生物，而相同長度的末端限制性片段則代表至少一種微生物的存在，因此T-RFLP技術(shù)可以用來反映微生物菌落組成的情況^[9]。T-RFLP技術(shù)具有分辨率高、簡單快速、易于實現(xiàn)自動化等特點。但T-RFLP實驗過程中影響因素眾多，樣品總DNA提取、PCR條件優(yōu)化以及限制性內(nèi)切酶的選擇均對結(jié)果產(chǎn)生影響^[10]。此外，T-RFLP圖譜中每個T-RFs可能不止對應(yīng)一個菌種，易造成對細(xì)菌種群多樣性的低估^[11]。

儲昭瑞等通過對SILVA（R108） SSU Ref數(shù)據(jù)庫中400條厭氧氨氧化菌16S rRNA基因序列的分析^[12]，建立了厭氧氨氧化菌特異性T-RFLP方法。該方法能夠有效、穩(wěn)定地應(yīng)用于環(huán)境樣品中厭氧氨氧化菌群落組成的快速分析。Aida等使用T-RFLP和高通量測序技術(shù)在上升流厭氧污泥床反應(yīng)器處理城市污水過程中研究厭氧硫氧化和微生物多樣性的關(guān)系^[13]。

2.3 高通量測序

最早的第一代測序（First Generation Sequencing， FGS）技術(shù)由Wu等提出^[14-16]。Margulies等在Nature發(fā)表“Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors”一文^[17]，標(biāo)志著高通量測序技術(shù)時代的到來。又稱第二代測序（NGS）技術(shù)，該技術(shù)一次可對上百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，通量高，信息量大。

目前高通量測序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第三代（TGS）。最大特點是單分子測序技術(shù)（SMS），測序無需經(jīng)過PCR擴增過程。Harrs等在Science首次報道他們開發(fā)的真正單分子測序技術(shù)（TSMS）^[18]，原理是在隨機打斷的待測DNA樣品片段末端添加poly（A），然后與檢測芯片的poly（T）雜交、定位，并逐一加入熒光標(biāo)記的末端終止子，洗滌、采集熒光信號后，切開熒光染料和抑制基團，再洗滌、加帽，摻入下一個核苷酸，進(jìn)行下一輪反應(yīng)，最終獲得完整的序列信息。其后，Pacific Biosciences 公司推出了單分子實時技術(shù)（SMRT），該方法在聚合反應(yīng)的同時就可以讀取測序產(chǎn)物，其測序速度快，并且具有讀數(shù)超長的優(yōu)點^[19]。目前關(guān)于高通量測序技術(shù)的研究層出不窮，如何降低測序成本，快速對海量測序數(shù)據(jù)信息進(jìn)行分析是今后的研究重點。

參考文獻(xiàn)

[1]Salma M.， Rousseaux S.， Sequeira-Le Grand A.， et al. Characterization of the Viable but Nonculturable （VBNC） State inSaccharomyces cerevisiae[J].Plos one.2013，8（10）：e77600.

[2]Knappik?M.， Dance D A B.， Rattanavong S.， et al. Evaluation of Molecular Methods to Improve the Detection ofBurkholderia pseudomalleiin Soil and Water Samples from Laos[J].Applied and Environmental Microbiology.2015，81（11）：3722-3727.

[3]Doi H.， Takahara T.， Minamoto T.， et al. Droplet Digital Polymerase Chain Reaction （PCR） Outperforms RealTime PCR in the Detection of Environmental DNA from an Invasive Fish Species[J].Environmental Science & Technology.2015，49（9）：5601-5608.

[4]李冰冰，肖波，李蓓等.FISH技術(shù)及其在環(huán)境微生物監(jiān)測中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)，2007，17（5）：94-97.

[5]陳瑛，任南琪，李永峰等.微生物熒光原位雜交（FISH）實驗技術(shù)[J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，40（4）：546-549.

[6]Lerman L S.， Fischer S G.， Hurley I.，et al.Sequence-determined DNA Separations[J].Annual Review of Biophysics and Bioengineering.1984，13：399-423.

[7]盧永，陳秉娟，申世峰等.PCR-DGGE在水處理微生物群落多樣性分析中的應(yīng)用[J].化學(xué)與生物工程.2009，26（5）：55-59.

[8]張珍妮，吳曉芙，陳永華等.DGGE技術(shù)在環(huán)境微生物多樣性研究中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報.2009，（12）：48-52.

[9]羅劍飛，林煒鐵，任杰等.T-RFLP技術(shù)及其在硝化細(xì)菌群落分析中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報.2008，35（3）：456-461.

[10]羅佳捷，李麗立，張彬等.T-RFLP技術(shù)及其在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī).2009，36（7）：75-78.

[11]余素林，吳曉磊，錢易等.環(huán)境微生物群落分析的T-RFLP技術(shù)及其優(yōu)化措施[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報.2006，12（6）：861-868.

[12]儲昭瑞，李相昆，孟令威等.T-RFLP技術(shù)在厭氧氨氧化菌群結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用[J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報.2013，45（2）：26-30.

[13]Aida AA.，Kuroda K.，Yamamoto M.，Nakamura A.，Hatamoto M.，Yamaguchi T. Diversity Profile of Microbes Associated with Anaerobic Sulfur Oxidation in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor Treating Municipal Sewage[J].Microbes and Environments.2015，30（2）：157-163.

[14]Wu R.，Kaiser A D.Structure and Base Sequence in the Cohesive Ends of Bacteriophage Lambda DNA[J].Journal of Molecular Biology.1968，35（3）：523-537.

[15]Wu R.Nucleotide Sequence Analysis of DNA.?I.?Partial Sequence of the Cohesive Ends of Bacteriophage Lambda and 186 DNA[J].Journal of Molecular Biology.1970，51（3）：501-521.

[16]Wu R.，Taylor E. Nucleotide Sequence Analysis of DNA.?II. Complete Nucleotide Sequence of the Cohesive Ends of Bacteriophage Lambda DNA[J].Journal of Molecular Biology.1971，57（3）：491-511.

[17]Margulies M.， Egholm M.， Altman W E.， et al. Genome Sequencing in Microfabricated High-density Picolitre Reactors[J].?Nature.2005，437（7057）：376-380.

[18]Harris T D.， Buzby P R.， Babcock H.， et al. Single-molecule DNA Sequencing of a Viral Genome[J]. Science. 2008，320（5872）：106-109.

[19]Eid J.， Fehr A.， Gray J.， et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules[J]. Science.2009，323（5910）：133-138.

收稿日期：2019-06-26

作者簡介：吳根英（1986—），女，浙江龍泉人，碩士，工程師，研究方向：環(huán)境保護。