Xpert MTB/RIF在脊柱結(jié)核快速診斷及利福平耐藥性檢測(cè)的應(yīng)用分析

饒敬澄 蔡玉強(qiáng)(通訊作者) 曹廣如 楊志花

( 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱外科 ， 貴州 遵義 563000 )

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis、complex，簡(jiǎn)稱結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核菌)所引起以肺部為主的人類多器官系統(tǒng)的慢性感染性疾病，可累及全身多個(gè)器官系統(tǒng)。世界衛(wèi)生組織2017年度報(bào)告顯示[1]，2016年全球有1040萬(wàn)人患有結(jié)核病，約有630萬(wàn)新結(jié)核病例，結(jié)核病在發(fā)展中國(guó)家和落后國(guó)家的發(fā)生率明顯高于發(fā)達(dá)國(guó)家。骨關(guān)節(jié)結(jié)核是常見(jiàn)的繼發(fā)性肺外結(jié)核，其中脊柱結(jié)核占50%，多發(fā)于青壯年，可導(dǎo)致脊柱后凸畸形、神經(jīng)功能損害，常需手術(shù)治療[2]。臨床上結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要是涂片抗酸染色鏡檢和結(jié)核分枝桿菌羅氏固體培養(yǎng)。但是涂片抗酸染色鏡檢陽(yáng)性率低、操作過(guò)程復(fù)雜、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求性高；結(jié)核分枝桿菌羅氏固體培養(yǎng)存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)(4-8周)、僅能檢測(cè)活菌進(jìn)而導(dǎo)致培養(yǎng)陽(yáng)性率低、污染率高等缺點(diǎn)。這些因素造成了臨床上無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，延長(zhǎng)了患者的住院時(shí)間，脊柱結(jié)核并發(fā)癥發(fā)生率增高。近年來(lái)，分子生物學(xué)診斷技術(shù)在臨床上得到了迅猛的發(fā)展，線性探針、多重PCR、基因芯片、半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR(GeneXpert MTB/RIF)被廣泛運(yùn)用于結(jié)核病的診斷中。GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)是由美國(guó) Cepheid公司研發(fā)，使用實(shí)時(shí)PCR，整合并自動(dòng)進(jìn)行樣品純化、核酸擴(kuò)增、單一或復(fù)雜樣品中的目標(biāo)序列測(cè)定，整個(gè)過(guò)程在密閉的試劑盒中進(jìn)行，可同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性。由于GeneXpert MTB/RIF的敏感性和特異性較高[3]、操作過(guò)程簡(jiǎn)單、可在2小時(shí)內(nèi)完成整個(gè)檢測(cè)，故WHO于2011年推薦用于結(jié)核病的診斷[4]。

資料與方法

1 一般資料：本研究收集2016年12月-2018年8月在貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱外科手術(shù)治療的臨床診斷為脊柱結(jié)核的29例患者，其中男15例、女14例，平均年齡為(45±17.13)歲。病變節(jié)段累計(jì)頸椎1例、胸椎11例、胸腰段5例、腰椎7例、骶椎5例。每例患者取4份術(shù)區(qū)病灶組織(膿液、干酪樣組織、死骨、肉芽組織)分別行病理組織學(xué)檢查、結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)、GeneXpert檢測(cè)，對(duì)于結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性者行藥物敏感性試驗(yàn)。

2 方法

2.1 樣品處理：(1)膿液的處理。將膿液轉(zhuǎn)移至錐形離心管內(nèi)，3500g離心15分鐘，棄上清液，加入2ml樣本處理液(SR)在漩渦振蕩器上振蕩，使沉淀物和樣本處理液充分混勻。(2)干酪、肉芽及死骨組織的處理。將組織加入2mlPBS緩沖液，應(yīng)用無(wú)菌剪刀將其剪碎后充分研磨，直至獲得均質(zhì)懸浮液，取1ml混懸液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌錐形管內(nèi)，加入2ml樣本處理液(SR)。使用渦旋振蕩器振蕩10秒，室溫靜置10分鐘，再繼續(xù)振蕩10秒，室溫靜置5分鐘。

2.2 涂片抗酸染色鏡檢：涂片自然干燥后，放置在染色架上，加熱固定(5秒內(nèi)將玻片經(jīng)火焰加熱4次)，滴加石碳酸復(fù)紅染液覆蓋玻片，保持染色5 分鐘，水洗。滴加酸性酒精溶液蓋滿玻片，脫色1分鐘，如有必要流水洗去脫色液后再次脫色，水洗。滴加亞甲基藍(lán)復(fù)染液，染色30秒，水洗，待玻片干燥后鏡檢。結(jié)果判定按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)制訂的實(shí)驗(yàn)室檢查規(guī)程進(jìn)行[5]。

2.3 結(jié)核分枝桿菌羅氏固體培養(yǎng)：將1-2倍的4%NaOH溶液加入到處理后的術(shù)區(qū)標(biāo)本中，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩30秒直至標(biāo)本充分液化，室溫靜置15分鐘，用無(wú)菌吸管吸取2-3滴接種至酸性羅氏培養(yǎng)基上，均勻接種至酸性培養(yǎng)基斜面的上、中部，擰緊螺旋蓋，將其置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在接種第3天、第7天觀察培養(yǎng)情況，此后每周觀察1次，直至第8個(gè)周末，記錄相關(guān)結(jié)果[6]。

2.4 結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)(比例法)：用滅菌的接種環(huán)刮取一環(huán)培養(yǎng)基上的單克隆菌落，磨菌器研磨后與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎鼙葘?duì)并制成1 mg/mL菌懸液，梯度稀釋為10-2 mg/mL和10-4mg/mL2個(gè)濃度，最后用劃線法均勻接種至含有濃度為40 ug/mL利福平培養(yǎng)基和作為對(duì)照的中性改良羅氏培養(yǎng)基表面，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4周，觀察結(jié)果[6]。

2.5 GeneXpert檢測(cè)：在Xpert MTB/RIF檢測(cè)匣上標(biāo)記患者姓名及實(shí)驗(yàn)室編號(hào)，不能標(biāo)記在檢測(cè)匣正面標(biāo)識(shí)碼及蓋子上。打開檢測(cè)匣蓋子，用試劑盒內(nèi)提供的專用無(wú)菌移液管吸取2ml處理后的樣本，由檢測(cè)匣的加樣孔緩慢加入，以免形成氣溶膠，若產(chǎn)生氣泡應(yīng)使用無(wú)菌移液管將氣泡全部吸走。關(guān)閉檢測(cè)匣的蓋子，其余液化樣品保存在4°冰箱中以備重復(fù)檢測(cè)使用。結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)結(jié)果判讀：Ct值≤38時(shí)為陽(yáng)性，>38則為無(wú)效。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)3種試驗(yàn)方法所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Kappa一致性檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果：29例標(biāo)本中，22例經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為脊柱結(jié)核，7例非脊柱結(jié)核。XpertMTB/RIF試驗(yàn)、結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表1。XpertMTB/RIF檢測(cè)的靈敏度為95.45%(21/22)，特異性為85.71%(6/7)，假陽(yáng)性率為14.29 % (1/7)，假陰性率為4.5%(1/22)；結(jié)核菌培養(yǎng)法的靈敏度為40.9%(9/22)，特異性為 100%(7/7)，假陽(yáng)性率為0%(0/7)，假陰性率為59.09%(13/22)；結(jié)核菌涂片法的靈敏度為 31.8%(7/22)，特異性為100%(7/7)，假陽(yáng)性率為0%(0/7)，假陰性率為 68.18%(15/22)。結(jié)核菌培養(yǎng)法與涂片抗酸染色法檢測(cè)結(jié)果比較，Kappa值為0.314，一致性一般，P值為0.086>0.05，2種方法不存在顯著一致性；GeneXpert與涂片抗酸染色法檢測(cè)結(jié)果比較，Kappa值為0.184，一致性較差，P值為0.087>0.05，2種方法不存在顯著一致性；GeneXpert與結(jié)核菌培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果比較，Kappa值為0.250，一致性一般，P值為0.042<0.05，2種方法存在顯著一致性。

表1 3種方法檢測(cè)結(jié)果比較

表2 Xpert MTB/RIF與比例法藥敏試驗(yàn)RFP耐藥性比較

討 論

目前脊柱結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是病理組織學(xué)診斷，本研究中臨床診斷脊柱結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)為：(1)既往有肺結(jié)核和其他肺外結(jié)核病史，患者有胸背部疼痛、消瘦、低熱、神經(jīng)功能缺陷，經(jīng)驗(yàn)性抗結(jié)核治療有效；(2)CT、MRI等影像學(xué)表現(xiàn)符合脊柱結(jié)核；(3)血沉、C反應(yīng)蛋白等實(shí)驗(yàn)室檢查不同程度增高。本研究以病理組織學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)比較XpertMTB/RIF、結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)這3種方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌效能，發(fā)現(xiàn)結(jié)核菌涂片陽(yáng)性率低、操作步驟繁瑣；結(jié)核菌培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性需要4周，培養(yǎng)陰性需要8周，耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法滿足臨床快速診斷的需求，且本研究中結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性率僅為40.9%(9/22)，因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)層厚，對(duì)營(yíng)養(yǎng)基、培養(yǎng)成分要求高，營(yíng)養(yǎng)成分難以進(jìn)入脂質(zhì)層；而XpertMTB/RIF具有很高的靈敏度和特異度、檢測(cè)時(shí)間短、對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高、操作簡(jiǎn)便易行，從樣品處理到得出結(jié)果僅需2.5小時(shí)，可達(dá)到臨床上早期快速診斷MTB和檢測(cè)利福平耐藥性，改善患者預(yù)后。XpertMTB/RIF技術(shù)以rpoB 基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)引物探針選擇性覆蓋 rpoB基因利福平耐藥決定區(qū) 81bp 核心區(qū)，用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿和利福平耐藥情況[7]。目前，耐多藥結(jié)核分枝桿菌在臨床上的發(fā)生率越來(lái)越高，早期明確結(jié)核分枝桿菌是否對(duì)利福平耐藥可優(yōu)化患者的化療方案、避免脊柱結(jié)核并發(fā)癥進(jìn)一步加重，改善患者預(yù)后[8]。在本研究經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診的脊柱結(jié)核患者中仍有1例GeneXpert顯示為MTB陰性，這可能與術(shù)前大量使用抗結(jié)核藥物、術(shù)區(qū)病灶標(biāo)本采集不當(dāng)、標(biāo)本處理或貯存不當(dāng)、起始標(biāo)本濃度不夠有關(guān)。有1例XpertMTB/RIF顯示利福平耐藥，而比例法藥敏試驗(yàn)顯示利福平敏感，這可能是由于培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群包括耐藥菌落和敏感菌落，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中在刮取結(jié)核分枝桿菌菌落時(shí)取到了敏感菌落。在比例法藥敏試驗(yàn)和GeneXpert結(jié)果出現(xiàn)差異時(shí)，應(yīng)以GeneXpert結(jié)果為準(zhǔn)，同時(shí)對(duì)樣本重新進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)。XpertMTB/RIF技術(shù)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果并不一定意味著活性結(jié)核分枝桿菌存在，但可據(jù)此初步推定存在MTB和利福平耐藥性。

綜上，GeneXpert MTB/RIF對(duì)脊柱結(jié)核的檢測(cè)優(yōu)于結(jié)核菌涂片和結(jié)核菌培養(yǎng)。GeneXpert MTB/RIF在脊柱結(jié)核早期快速診斷及利福平耐藥性檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用價(jià)值，值得臨床推廣。