淺談漆酶-介體系統(tǒng)在染料降解中的應(yīng)用研究＊

劉友勛，張 坤，宋相儒，陳瑩瑩，黃 娟

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 435003）

1 染料廢水的現(xiàn)狀

染料是指能在水溶液或在其他介質(zhì)中，使纖維或其他基質(zhì)染成各種鮮明而堅(jiān)牢色澤的有機(jī)化合物。含染料廢水對環(huán)境有很大影響，極低濃度的染料排入受納水體就會(huì)造成強(qiáng)烈的視覺沖擊和美學(xué)損害，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的染料在環(huán)境中有較長的滯留期，會(huì)對人類健康造成嚴(yán)重的危害。而中國染料工業(yè)、紡織、印染業(yè)發(fā)達(dá)，含染料廢水排放量大、污染面廣，每年有超過1.6×109t的廢水未經(jīng)任何處理而直接排入自然水體，給整個(gè)水生生態(tài)系統(tǒng)帶來破壞性后果。目前，對染料廢水的處理已成為中國廢水治理的一個(gè)焦點(diǎn)，但高效、低成本的處理技術(shù)還較少，因此，研究和發(fā)展新型、低成本和高效的去除染料污染物技術(shù)對保護(hù)環(huán)境和人類健康具有重要意義。

2 染料廢水不同處理方法

染料污染物去除的方法主要有物理法（吸附、膜技術(shù)等）、化學(xué)法（催化氧化法、電化學(xué)氧化法、臭氧氧化法等）及生物降解法（活性污泥、細(xì)菌、真菌及藻類等），這些傳統(tǒng)去除技術(shù)各有特點(diǎn)和缺點(diǎn)。相對于物理、化學(xué)處理方法，生物處理方法具有成本低、不產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)，因此，利用環(huán)境生物技術(shù)降解環(huán)境污染物日益引起人們的關(guān)注，尤其是生物酶催化技術(shù)。在眾多的生物酶中，對白腐菌產(chǎn)生的漆酶研究和應(yīng)用最為廣泛[1]。

3 漆酶處理染料廢水的研究

漆酶是一種多銅離子蛋白，能催化多種酚類底物，以氧分子作為電子受體，產(chǎn)生的副產(chǎn)物只有水，對環(huán)境友好。由于漆酶的底物范圍很寬廣，能降解環(huán)境中多種有機(jī)污染物，在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域受到極大關(guān)注。真菌漆酶的氧化還原電位一般比較低（0.5～0.8 V），只能氧化降解氧化還原電勢低的酚類結(jié)構(gòu)底物，而不能氧化降解氧化還原電勢高的非酚類底物。但研究發(fā)現(xiàn)在加入一些被稱為漆酶介體的小分子化合物后，能夠顯著促進(jìn)漆酶對非酚類底物的催化作用，還能大大提高對酚類底物的催化效率，從而進(jìn)一步擴(kuò)大漆酶底物的范圍[2]。這些介體本身也是漆酶底物，起電子傳遞中間體的作用，使電子在酶和底物之間轉(zhuǎn)移。

目前，合成及天然的介體有100多種，研究表明，合成介體的效率要高于天然介體，其中最常用的合成介體是2，2-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）和 1-羥基苯并三唑（HBT）等[3]。各種來源的漆酶都可以快速地將ABTS氧化成ABTS+中間體，進(jìn)而氧化底物。正是由于介體的發(fā)現(xiàn)，使得漆酶和其介體構(gòu)成的催化系統(tǒng)（LMS）具有強(qiáng)大催化能力，并進(jìn)一步促進(jìn)了漆酶的廣泛使用，目前LMS在造紙工業(yè)、有機(jī)合成、生物傳感器和環(huán)境處理等多個(gè)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[4]。盡管以真菌漆酶為主的LMS系統(tǒng)有很強(qiáng)的催化能力和廣闊的應(yīng)用前景，但對于LMS的大規(guī)模應(yīng)用還存在一些問題：①漆酶受到環(huán)境因子影響，如高溫、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等可導(dǎo)致酶蛋白變性；②多數(shù)真菌漆酶的催化活性最適pH值在酸性范圍，在中性或堿性條件下則活性低或沒有活性；③可溶性小分子介體的二次污染和重復(fù)使用性；④由于漆酶分離和介體合成成本較高，直接導(dǎo)致LMS應(yīng)用成本高而難以大規(guī)模應(yīng)用。

采用一定載體以合適方式將酶固定化被認(rèn)為是提高酶穩(wěn)定性和解決酶重復(fù)使用的有效方法。酶固定方法有包埋法、結(jié)合法、吸附法及交聯(lián)法，固定化酶方法的選擇取決于載體性質(zhì)、酶的種類、成本、使用目的和過程的復(fù)雜程度[5]。多數(shù)真菌漆酶的最適pH值在酸性范圍且不耐高溫，而挖掘新的漆酶資源是解決這一難題的有效途徑。近年來發(fā)現(xiàn)芽孢外衣殼蛋白（CοtA）具有多銅離子氧化酶的活性，能氧化多數(shù)真菌漆酶的典型底物如ABTS、丁香醛連氮和愈創(chuàng)木酚等，被認(rèn)為是一種細(xì)菌漆酶[6]。更重要的是，這種細(xì)菌漆酶催化活性最適pH在中性或堿性，甚至在高堿性pH也保留較高的活性，同時(shí)在寬廣的pH范圍（4～11）內(nèi)都能保持較高的穩(wěn)定性，這表明細(xì)菌漆酶不僅能用于真菌漆酶不適用的堿性環(huán)境，還具有一定的酸堿耐受性[6]。溫度穩(wěn)定性結(jié)果顯示，CοtA在80℃高溫能保持2 h的酶活性，證明CοtA也是一種熱穩(wěn)定蛋白，這可能因?yàn)镃οtA是一種芽孢外衣殼蛋白[6]。與真菌漆酶類似，細(xì)菌漆酶對環(huán)境污染物染料有一定的降解作用。細(xì)菌漆酶在環(huán)境處理應(yīng)用中具有兩大優(yōu)勢：①細(xì)菌漆酶具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、酸堿耐受性，在中性或堿性有較好的活性；②細(xì)菌基因更易于克隆表達(dá)而有利于獲得大量基因工程化的酶，從而降低酶使用成本。

許多學(xué)者認(rèn)為，細(xì)菌漆酶有可能取代真菌漆酶而應(yīng)用于各種領(lǐng)域[6]。但細(xì)菌漆酶的氧化能力較真菌漆酶低，如何提高細(xì)菌漆酶催化能力是其應(yīng)用中需要解決的問題。借鑒真菌漆酶的介體作用，可在細(xì)菌漆酶的催化反應(yīng)中加入介體來提高其催化能力，然而有關(guān)細(xì)菌LMS的應(yīng)用研究報(bào)道還較少。漆酶的大部分催化反應(yīng)是在溶液中完成的，如果大量使用可溶性合成介體，由于合成介體具有潛在的環(huán)境毒性，其使用后難以回收，廢棄后會(huì)造成環(huán)境二次污染；如果催化反應(yīng)完成后的介體能進(jìn)行回收和重復(fù)使用，則這個(gè)問題迎刃而解。解決這一問題的一個(gè)思路是將介體小分子連接或吸附到固體材料中，使介體固定化，從而易于回收且能夠重復(fù)使用。固定介體的方法主要采取吸附和共價(jià)連接兩種方法，吸附方法雖然簡單但易導(dǎo)致介體的滲漏；采用共價(jià)連接方法，雖然復(fù)雜但可避免介體的滲漏。

4 共固定化LMS降解染料的研究

雖然LMS在環(huán)保等領(lǐng)域應(yīng)用前景好，但可溶性的酶和介體分子使用后不易回收重復(fù)利用，導(dǎo)致其成本高，難以大規(guī)模應(yīng)用。少數(shù)學(xué)者已考慮到將酶和介體進(jìn)行共固定化[7]，如采用自由基聚合等方式使漆酶和介體共固定在一起，但SUN等報(bào)道采用自由基聚合的共固定化LMS凝膠需要較長的時(shí)間才能完成對孔雀綠染料的脫色作用[7]，這表明與自由酶和介體分子組成的LMS相比，這種共固定方式的LMS存在催化效率低的問題。其中一個(gè)原因可能是酶和介體共固定化之后，LMS和底物之間存在較大傳質(zhì)阻力；另外一個(gè)原因是酶和介體被固定化后，彼此之間變成了剛性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致介體不能像游離分子那樣進(jìn)出酶活性中心，同時(shí)由于分子結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致介體和酶分子的催化活性中心契合程度減弱，介體分子傳遞電子的能力也大大降低，進(jìn)而導(dǎo)致LMS催化效率降低。如何解決這些問題？我們以前的研究顯示，將介體（ABTS）共價(jià)修飾到氨基化SiO2納米粒子上，可有效利用SiO2納米和酶之間的良好生物相容性，同時(shí)在振蕩狀態(tài)下納米級別的顆粒對反應(yīng)的過程中的傳質(zhì)影響較小，可以大大改善固定化LMS催化效率[8]。根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以猜想到用于固定化中連接介體的“接頭分子”的結(jié)構(gòu)類型和長度等會(huì)影響到介體分子與酶分子活性中心之間的作用，因此“接頭分子”結(jié)構(gòu)對固定化LMS催化效率的影響有必要深入研究。另外，酶固定化后剛性結(jié)構(gòu)也可能會(huì)影響酶和介體的結(jié)合，可以通過采用不同的酶固定化方式，盡量減少其不利影響。

5 結(jié)束語

漆酶是一種多銅離子蛋白，能催化多種酚類底物，以氧分子作為電子受體，產(chǎn)生的副產(chǎn)物只有水，對環(huán)境友好，在染料等污染物降解上有很大的應(yīng)用前景。由漆酶組成漆酶-介體系統(tǒng)，可以有效解決因漆酶氧化還原電勢低造成的難題，加速對污染物的降解。雖然LMS在環(huán)保等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛，但可溶性的酶和介體分子使用后不易回收重復(fù)利用，導(dǎo)致其成本高，難以大規(guī)模應(yīng)用。漆酶和介體進(jìn)行共固定化是解決這個(gè)難題的重要途徑，但如何使二者有效地共固定還需要進(jìn)一步研究。