烏梅提取物對(duì)特發(fā)性高鈣尿大鼠腎結(jié)石形成和腎功能的影響及作用機(jī)制

楊敏，李家兵，劉貴喜，孫懿，羅成君

腎結(jié)石是泌尿系統(tǒng)的常見疾病，按結(jié)石成分劃分，臨床上以草酸鈣結(jié)石最為常見，不僅會(huì)引起腎絞痛、血尿等癥狀，還會(huì)對(duì)腎功能產(chǎn)生影響[1-2]。目前，腎結(jié)石的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，也缺乏有效的預(yù)防及藥物治療手段。烏梅由薔薇科植物梅的干燥成熟果實(shí)加工得到，富含檸檬酸、蘋果酸、丁二酸等有機(jī)酸成分，不僅能夠在結(jié)石形成過程中與鈣離子螯合、降低結(jié)石形成的風(fēng)險(xiǎn)，還能通過抗炎、抗氧化等方式發(fā)揮組織及細(xì)胞保護(hù)作用[3-4]。特發(fā)性高鈣尿大鼠的特征是血清鈣正常，但腎小管對(duì)鈣重吸收存在障礙并造成尿鈣增加，進(jìn)而容易自發(fā)形成腎結(jié)石，是目前用于研究腎結(jié)石理想的動(dòng)物模型。為了明確烏梅提取物對(duì)腎結(jié)石形成的預(yù)防和治療價(jià)值，本研究以特發(fā)性高鈣尿大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，具體分析了烏梅提取物對(duì)大鼠腎結(jié)石形成及腎功能的影響及機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物：特發(fā)性高尿鈣大鼠24只及健康清潔級(jí)SD大鼠12只購(gòu)自四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[許可證SYXK(川)2019-217]，均為雄性，體質(zhì)量220～250 g，飼養(yǎng)環(huán)境22～26℃、濕度40%～60%，自由攝食飲水。(2)試驗(yàn)試劑：烏梅提取物購(gòu)自Sigma公司，炎性細(xì)胞因子及8-羥基脫氧鳥苷(8-OHDG)的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)公司，丙二醛(MDA)的硫代巴比妥酸檢測(cè)試劑盒及總抗氧化力(T-AOC)的比色法試劑盒購(gòu)自南京建成研究所，基因mRNA表達(dá)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根公司。(3)儀器設(shè)備：全自動(dòng)生化分析儀為美國(guó)愛德士公司生產(chǎn)，型號(hào)Catalyst Dx。顯微鏡為Nikon公司生產(chǎn)，型號(hào)E200。超聲儀為VisualSonics公司生產(chǎn)，型號(hào)Vevo。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2018年1—12月于西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。健康清潔級(jí)SD大鼠12只作為對(duì)照組， 特發(fā)性高尿鈣大鼠24只按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組12只和干預(yù)組12只。模型組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，給予生理鹽水2 ml灌胃，1次/ d，連續(xù)28 d；干預(yù)組給予0.15 g/ml 烏梅提取物溶液2 ml灌胃，1次/ d，連續(xù)干預(yù)28 d。

1.3 觀察指標(biāo)與方法 干預(yù)28 d后處死大鼠，留取血液標(biāo)本10 ml，離心得血清在-80℃保存。大鼠開腹后解剖腎臟，等分為2份，1份用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，蠟塊在陰涼處保存；另1份用液氮冷凍后在-80℃冰箱保存。

1.3.1 腎功能測(cè)定：取-80℃保存的血清標(biāo)本，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血肌酐(SCr)及尿素氮(BUN)含量。

1.3.2 草酸鈣結(jié)晶量評(píng)分[3]：取石蠟包埋的腎臟組織，制作石蠟切片后進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察每個(gè)高倍視野下草酸鈣結(jié)晶的數(shù)量。視野內(nèi)無結(jié)石、結(jié)晶為1分，結(jié)石、結(jié)晶<3個(gè)為2分，結(jié)石、結(jié)晶3～5個(gè)為3分，結(jié)石、結(jié)晶6～10個(gè)為4分，結(jié)石、結(jié)晶>10個(gè)為5分。

1.3.3 炎性因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定：取液氮冷凍的腎臟組織適量，加入磷酸鹽緩沖液后對(duì)組織進(jìn)行超聲勻漿， 離心取上層澄清液體后采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定白介素-1β(IL-1β)、高遷移率族蛋白B1(HMGB-1)、趨化因子配體2(CCL-2)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、8-OHDG的含量，采用硫代巴比妥酸法試劑盒測(cè)定MDA含量，采用比色法試劑盒測(cè)定T-AOC含量。

1.3.4 BMP2通路基因測(cè)定[5]：取石蠟包埋的腎臟組織，采用石蠟包埋組織切片總RNA提取試劑盒提取組織總RNA，采用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，所用引物分別為BMP2、MSX2、RUNX2、Osx的特異性引物，根據(jù)擴(kuò)增后儀器上顯示的擴(kuò)增曲線計(jì)算基因的mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 3組腎功能指標(biāo)及草酸鈣結(jié)晶量評(píng)分比較 SCr、BUN含量及腎臟組織草酸鈣結(jié)晶量評(píng)分比較，模型組大鼠高于對(duì)照組，而干預(yù)組大鼠低于模型組(P均<0.01)，見表1。

2.2 3組腎組織炎性細(xì)胞因子比較 腎臟組織IL-1β、HMGB-1、CCL-2、MCP-1含量比較，模型組大鼠明顯高于對(duì)照組，而干預(yù)組低于模型組(P均<0.01)，見表2。

2.3 3組腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 模型組大鼠腎臟組織MDA、8-OHDG的含量明顯高于對(duì)照組，T-AOC含量低于對(duì)照組；而干預(yù)組大鼠腎臟組織MDA、8-OHDG的含量低于模型組，T-AOC的含量高于模型組 (P均<0.01)，見表3。

2.4 3組腎組織BMP2通路基因表達(dá)比較 大鼠腎臟組織BMP2、MSX2、RUNX2、Osx的mRNA表達(dá)水平比較，模型組明顯高于對(duì)照組，干預(yù)組低于模型組(P均<0.01)，見表4。

3 討 論

草酸鈣結(jié)石是最常見的腎結(jié)石類型，鈣鹽過飽和沉積是腎結(jié)石形成的重要病理生理基礎(chǔ)，特發(fā)性高尿鈣大鼠腎小管對(duì)鈣的重吸收存在障礙、尿鈣明顯增加，容易在腎臟內(nèi)出現(xiàn)鈣鹽過飽和并出現(xiàn)結(jié)石，因而特發(fā)性高尿鈣大鼠也是研究腎結(jié)石常用的動(dòng)物模型[6]。本研究以特發(fā)性高尿鈣大鼠作為模型組，通過觀察腎臟組織中草酸鈣結(jié)晶數(shù)量及血清中腎功能指標(biāo)的變化可知，模型組大鼠腎臟組織中草酸鈣結(jié)晶量評(píng)分及SCr、BUN含量明顯高于對(duì)照組，提示特發(fā)性高尿鈣大鼠腎臟內(nèi)大量草酸鈣結(jié)晶、結(jié)石形成且腎功能發(fā)生了一定損害，血液中SCr及BUN含量升高。

表1 3組大鼠血清腎功能指標(biāo)及腎臟組織中草酸鈣結(jié)晶量評(píng)分比較

表2 3組大鼠腎臟組織炎性細(xì)胞因子比較

表3 3組大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

表4 3組大鼠腎臟組織BMP2通路基因表達(dá)比較

目前臨床上腎結(jié)石尚缺乏有效的藥物治療或預(yù)防手段，主要采用體外震波碎石、經(jīng)皮腎鏡取石等外科手段進(jìn)行治療。烏梅提取物通過有機(jī)酸的協(xié)同作用來螯合鈣離子、抑制草酸鈣結(jié)晶形成、防止鈣鹽飽和析出、預(yù)防結(jié)石形成。本研究使用烏梅提取物來對(duì)特發(fā)性高尿鈣大鼠腎結(jié)石進(jìn)行預(yù)防和治療，結(jié)果表明，干預(yù)組大鼠腎臟組織中草酸鈣結(jié)晶量評(píng)分及SCr、BUN含量明顯低于模型組，提示烏梅提取物對(duì)特發(fā)性高尿鈣大鼠的腎結(jié)石形成具有抑制作用，同時(shí)也能改善因結(jié)石沉積所引起的腎功能損害。

草酸鈣結(jié)晶及結(jié)石在腎臟內(nèi)的聚集會(huì)持續(xù)刺激腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生激活，進(jìn)而引起腎功能發(fā)生損害[7-9]。IL-1β、HMGB-1、CCL-2、MCP-1等炎性細(xì)胞因子的大量釋放是炎性反應(yīng)激活的特征，IL-1β、HMGB-1具有促炎活性，能夠介導(dǎo)炎性的級(jí)聯(lián)放大，CCL-2、MCP-1具有趨化活性、能夠介導(dǎo)炎性細(xì)胞在腎結(jié)石周圍組織的浸潤(rùn)[10-12]。氧自由基的大量生成是氧化應(yīng)激激活的特征，通過引起局部組織結(jié)構(gòu)的氧化損傷來導(dǎo)致腎功能異常，同時(shí)伴有氧化產(chǎn)物MDA、8-OHDG生成增多及抗氧化指標(biāo)T-AOC的下降[13-14]。本研究對(duì)上述炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的分析顯示：模型組大鼠腎臟組織中IL-1β、HMGB-1、CCL-2、MCP-1、MDA、8-OHDG的含量明顯高于對(duì)照組，T-AOC的含量明顯低于對(duì)照組；而干預(yù)組大鼠腎臟組織中IL-1β、HMGB-1、CCL-2、MCP-1、MDA、8-OHDG的含量明顯低于模型組，T-AOC的含量明顯高于模型組，提示特發(fā)性高尿鈣大鼠的腎臟組織中炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)過度激活，烏梅提取物則能顯著抑制炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)。

腎臟局部草酸鈣結(jié)石或結(jié)晶的持續(xù)刺激是引起炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)激活的重要因素，而BMP2信號(hào)通路在組織鈣化、礦化中起到重要作用。白栩搏[15]的動(dòng)物研究證實(shí)，BMP2信號(hào)通路的過度激活參與了特發(fā)性高尿鈣大鼠腎結(jié)石的形成。本研究對(duì)特發(fā)性高尿鈣大鼠腎臟內(nèi)BMP2通路基因表達(dá)的分析顯示：模型組大鼠腎臟組織中BMP2、MSX2、RUNX2、Osx的mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。這一結(jié)果與白栩搏[15]的研究一致，表明BMP2信號(hào)通路的過度激活與特發(fā)性高尿鈣大鼠腎結(jié)石的形成密切相關(guān)。MSX2、RUNX2是BMP2下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過靶向啟動(dòng)Osx的表達(dá)來參與骨形成、組織鈣化的調(diào)控。在烏梅提取物干預(yù)后觀察到，干預(yù)組大鼠腎臟組織中BMP2、MSX2、RUNX2、Osx的mRNA表達(dá)水平明顯低于模型組，提示烏梅提取物對(duì)特發(fā)性高尿鈣大鼠腎臟中BMP2通路的激活具有抑制作用。

綜上所述，烏梅提取物對(duì)特發(fā)性高鈣尿大鼠腎結(jié)石形成及腎功能均具有改善作用，同時(shí)也能抑制腎臟組織中炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及BMP2通路的激活，這也可能是烏梅提取物改善腎結(jié)石形成及腎功能的相關(guān)分子機(jī)制。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

楊敏：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、整體實(shí)施及論文寫作；李家兵：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)及論文審校；劉貴喜：負(fù)責(zé)動(dòng)物的干預(yù)及取材；孫懿、羅成君：負(fù)責(zé)指標(biāo)檢測(cè)和數(shù)據(jù)錄入