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    miR-218和Survivin基因/蛋白在喉癌中的表達(dá)及其與喉癌化療敏感性的關(guān)系

    2019-11-29 03:03:26要兆旭馮志星彭麗娜韓海平赫莉楊雪
    疑難病雜志 2019年11期
    關(guān)鍵詞:研究

    要兆旭,馮志星,彭麗娜,韓海平,赫莉,楊雪

    喉癌是頭頸部較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,多發(fā)于50~70歲男性。在我國(guó),喉癌的發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì),其治療方法以手術(shù)切除為主,聯(lián)合術(shù)前或術(shù)后化療、放療等綜合治療[1]。但由于個(gè)體差異大,化療的療效尚不確定,所以,如何選擇合適的生物學(xué)指標(biāo)預(yù)測(cè)化療的療效受到研究者們的重視。微小核糖核酸-218(miR-218)是一種小分子非編碼RNA,在胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達(dá)降低[2-4],其低表達(dá)與腫瘤患者預(yù)后不良相關(guān),可作為疾病診治和預(yù)后判斷的生物學(xué)指標(biāo)。存活素(Survivin)是凋亡抑制蛋白家族中結(jié)構(gòu)獨(dú)特的新成員,具有較強(qiáng)的抗凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn),Survivin在膀胱癌、胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤中升高[5-7],參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程,是潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)[8]。下調(diào)Survivin表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性[9]。有研究報(bào)道,miR-218可通過(guò)下調(diào)Survivin表達(dá)調(diào)控宮頸癌腫瘤細(xì)胞克隆形成、遷移和侵襲從而抑制宮頸癌的發(fā)展進(jìn)程[10]。目前,miR-218是否也通過(guò)調(diào)控Survivin表達(dá)參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展,以及二者表達(dá)與喉癌敏感性的相關(guān)研究還較少。本研究選取85例喉癌患者為研究對(duì)象,于治療前取各患者喉癌活檢組織標(biāo)本,探討miR-218和Survivin表達(dá)與喉癌化療敏感性的關(guān)系,為喉癌化療療效的預(yù)測(cè)提供一定的理論依據(jù),報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 選取2011年2月—2015年8月邯鄲市中心醫(yī)院耳鼻喉頭部外科收治首次確診為喉癌患者85例為研究對(duì)象,其中男68例,女17例,年齡30~85(63.17±8.25)歲;吸煙者54例,未吸煙者31例;腫瘤直徑>3 cm者43例,≤3 cm者42例;按照TNM分期:Ⅰ期23例,Ⅱ期32例,Ⅲ期24例,Ⅳ期6例;依據(jù)腫瘤分化程度:高分化26例,中分化35例,低分化24例;按照病理類型:鱗癌81例,腺癌4例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例,未轉(zhuǎn)移者49例。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并心臟、腎、肝等器官疾病患者;(2)合并糖尿病患者;(3)合并自身免疫疾病、精神病患者。以同期本院病理科30例正常喉黏膜組織石蠟切塊作為對(duì)照,其中男23例,女7例,平均年齡(62.15±7.39)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),全部受試者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 Trizol試劑購(gòu)自上?;鄯f生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司;免疫組化檢測(cè)試劑均購(gòu)自于武漢博士德公司。TP600型PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自日本 Takara公司;LC 480型Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。

    1.3 miR-218和Survivin mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction,RT-qPCR)技術(shù)檢測(cè)miR-218和Survivin mRNA表達(dá),按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取標(biāo)本組織中總RNA,用DEPC處理過(guò)的超純水溶解。分光光度計(jì)檢測(cè)RNA溶液在260 nm和280 nm處吸光值(A),計(jì)算RNA的濃度和純度,A260/A280比值>1.8可用于檢測(cè)miR-218和Survivin mRNA表達(dá)。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。miR-218上游引物5' -ACACTCCAGCTGGGTT-3' ,下游引物5' -TGGTGTCGTGGAGTCG-3' ;Survivin上游引物5' -AAGAGGCGGCAACAGATT-3' ,下游引物5' -GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3' ;U6上游引物5' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3' ,下游引物5' -AACGCTTCACGAATTTG-3' ;β-actin上游引物5' -CCTGTACGCCAACACAGTGC-3' ,下游引物5' -ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3' 。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min后,95℃30 s, 60℃30 s,72℃30 s,總計(jì)40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法,分別以U6和β-actin為內(nèi)參計(jì)算miR-218和Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

    1.4 Survivin蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法Envision二步法,嚴(yán)格按照產(chǎn)品操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。Survivin蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì),小部分定位于細(xì)胞核。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。(1)按陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比計(jì)分:<10%(0分),10%~25%(1分),26%~50%(2分),>50%(3分);(2)按染色強(qiáng)度計(jì)分:無(wú)色(0分),淡黃色(1分),棕黃色(2分)和棕褐色(3分)。取2項(xiàng)結(jié)果的乘積,≤3分為Survivin蛋白陰性表達(dá),>3分為Survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

    1.5 化療方法 喉癌組患者均于術(shù)后4~6周開(kāi)始化療,順鉑20~25 mg/m2靜脈滴注,每天1次,共3 d;甲酰四氫葉酸鈣100 mg靜脈滴注,每天1次,共5 d; 5-氟尿嘧啶靜脈滴注500~750 mg/m2,每天1次,共5 d;平陽(yáng)霉素8 mg溶于20 ml生理鹽水靜脈注射,每天1次,共4 d。每月循環(huán)1次,共3個(gè)月。

    1.6 療效判斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)改良的實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(mRECIST)進(jìn)行療效評(píng)估[11],分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進(jìn)展(PD)。CR:所有目標(biāo)病灶消失,無(wú)新病灶出現(xiàn),腫瘤標(biāo)志物水平正常,并維持4周;PR:所有目標(biāo)病灶的長(zhǎng)徑總和減少≥30%,并維持4周;PD:所有目標(biāo)病灶的長(zhǎng)徑總和增加≥20%,并且長(zhǎng)徑總和增加的絕對(duì)值超過(guò)5 mm,或者有新病灶出現(xiàn),或者病灶數(shù)量增加;SD變化介于PR和PD之間。術(shù)后輔助化療敏感類包括CR和PR患者,不敏感類包括SD和PD患者。

    2 結(jié) 果

    2.1 miR-218和Survivin mRNA表達(dá)比較 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,喉癌組織中miR-218表達(dá)顯著降低(1.06±0.18 vs. 0.62±0.17,t=12.003,P<0.01),Survivin mRNA表達(dá)顯著升高(1.08±0.21 vs. 1.72±0.24,t=12.953,P<0.01),見(jiàn)圖1。

    注:與對(duì)照組比較,aP<0.01

    圖1 喉癌組織與正常喉組織miR-218和Survivin mRNA表達(dá)比較

    2.2 Survivin蛋白表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果顯示Survivin主要定位于細(xì)胞質(zhì),胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng),喉癌組陽(yáng)性顆粒較多,對(duì)照組則陽(yáng)性表達(dá)很少(圖2見(jiàn)封3)。喉癌組織中Survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為45.88%(39/85),對(duì)照組Survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為16.67%(5/30)。與對(duì)照組比較,喉癌組織中Survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高(χ2=8.012,P<0.05)。

    2.3 miR-218和Survivin mRNA表達(dá)與喉癌患者臨床病理特征的關(guān)系 以喉癌組患者 miR-218和Survivin mRNA表達(dá)的平均數(shù)0.31、 0.86為分界點(diǎn),將85例患者分為miR-218低表達(dá)組42例、miR-218高表達(dá)組43例;Survivin低表達(dá)組46例、Survivin高表達(dá)組39例。miR-218和Survivin mRNA表達(dá)均與腫瘤直徑大小、TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05),而與喉癌患者性別、年齡、是否吸煙及病理類型無(wú)關(guān)(P>0.05),見(jiàn)表1。

    2.4 miR-218和Survivin mRNA表達(dá)的相關(guān)性 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),癌基因Survivin是miR-218的下游潛在作用靶點(diǎn)之一[12]。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,喉癌組織中miR-218和Survivin mRNA表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.534,P<0.05),見(jiàn)圖3。

    注:A.miR-218和Survivin mRNA互補(bǔ)序列;B.喉癌組織中miR-218和Survivin mRNA表達(dá)相關(guān)性

    圖3 miR-218和Survivin mRNA表達(dá)相關(guān)性

    2.5 miR-218和Survivin mRNA表達(dá)與喉癌化療敏感性的關(guān)系 經(jīng)過(guò)3個(gè)月治療后,CR、PR、SD和PD患者分別有20例、41例、17例和7例。miR-218高表達(dá)患者中對(duì)化療敏感人數(shù)占總化療敏感人數(shù)的59.02%,低表達(dá)患者占40.98%,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Survivin高表達(dá)患者中對(duì)化療敏感人數(shù)占總化療敏感人數(shù)的37.70%,低表達(dá)患者占62.30%,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與化療不敏感患者相比,化療敏感患者miR-218表達(dá)顯著升高(P<0.05),Survivin表達(dá)顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表2、圖4。

    注:與化療不敏感患者比較,aP<0.05

    3 討 論

    喉癌是常見(jiàn)的影響患者健康的頭頸部惡性腫瘤。化療在惡性腫瘤的治療中起重要作用,化療療效依賴于腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性[13]。導(dǎo)致化療失敗的原因比較復(fù)雜,涉及到多種機(jī)制,如某些影響細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡的基因分子可影響腫瘤化療的敏感性[14]。尋找準(zhǔn)確、快速和靈敏的生物學(xué)指標(biāo)預(yù)測(cè)不同喉癌患者對(duì)化療的敏感性,依據(jù)化療敏感性的不同制定不同的化療方案,使患者從中受益意義重大。

    miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA,通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控RNA表達(dá),參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的調(diào)控過(guò)程。近年來(lái)研究表明,miR-218作為基因表達(dá)調(diào)控因子,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中miR-218表達(dá)水平顯著低于癌旁組織,其低表達(dá)與腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān),miR-218低表達(dá)患者5年總生存率明顯低于高表達(dá)患者,可作為胃癌患者的預(yù)后生物標(biāo)志物。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn),喉鱗狀細(xì)胞癌組織miR-218表達(dá)顯著低于相鄰正常組織,其過(guò)表達(dá)可顯著抑制喉鱗狀癌細(xì)胞的增殖和侵襲,是喉鱗狀細(xì)胞癌患者潛在的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示,喉癌組織中miR-218表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低,miR-218低表達(dá)與腫瘤直徑大小、TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,提示miR-218表達(dá)在喉癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。化療敏感的患者miR-218表達(dá)水平顯著高于化療不敏感患者,提示miR-218表達(dá)越高,對(duì)化療敏感性越強(qiáng),療效越好。

    準(zhǔn)確預(yù)測(cè)miRNA的靶基因并正確認(rèn)識(shí) miRNA及其靶基因的相互作用是研究miRNA在疾病中作用機(jī)制的關(guān)鍵[17-20]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),Survivin是miR-218的靶基因,miR-218可通過(guò)下調(diào)Survivin表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等。農(nóng)朝贊等[21]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-218的人鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞增殖受到抑制,Survivin蛋白表達(dá)降低,miR-218可能通過(guò)下調(diào)Survivin表達(dá)誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。萬(wàn)軍等[12]研究發(fā)現(xiàn),食管癌組織miR-218表達(dá)顯著降低,Survivin表達(dá)顯著升高,miR-218轉(zhuǎn)染人食管癌TE-1細(xì)胞后,可顯著降低細(xì)胞內(nèi)Survivin mRNA和蛋白表達(dá)水平,提示食管癌中miR-218可能通過(guò)下調(diào)Survivin表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。Survivin是抗凋亡家族蛋白中抗凋亡作用最強(qiáng)的因子,可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡、影響腫瘤血管生成等。Shi等[22]研究發(fā)現(xiàn)喉鱗狀細(xì)胞癌組織Survivin mRNA表達(dá)較癌旁組織顯著升高,Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)Survivin可顯著提高Hep-2細(xì)胞的相對(duì)存活率。Wen等[23]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染p-siRNA survivin后的喉癌Hep-2細(xì)胞增殖明顯受到抑制,抑制率高達(dá)79%,流式細(xì)胞術(shù)顯示Survivin沉默可顯著抑制體外和體內(nèi)Hep-2的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。本研究結(jié)果顯示,喉癌組織中Survivin mRNA和蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著升高,Survivin mRNA高表達(dá)患者腫瘤直徑大、TNM分期高、分化程度低及淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移,提示Survivin參與喉癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,是潛在的治療靶點(diǎn)?;熋舾械幕颊逽urvivin mRNA表達(dá)水平顯著低于化療不敏感患者,提示Survivin表達(dá)水平越低,對(duì)化療敏感性越強(qiáng),療效越好。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,喉癌組織miR-218和Survivin mRNA呈明顯負(fù)相關(guān),提示喉癌組織中miR-218可能也通過(guò)下調(diào)Survivin表達(dá)抑制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。

    表1 miR-218和Survivin mRNA表達(dá)與喉癌患者臨床病理特征關(guān)系

    表2 miR-218和Survivin表達(dá)與化療敏感性分析 [例(%)]

    綜上所述,喉癌組織中miR-218和Survivin均表達(dá)異常,與喉癌化療敏感性相關(guān),可作為預(yù)測(cè)化療療效的生物學(xué)指標(biāo)。喉癌組織中miR-218可能通過(guò)調(diào)控Survivin表達(dá)參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。但是,喉癌中miR-218具體如何調(diào)節(jié)Survivin表達(dá)發(fā)揮作用,調(diào)控的信號(hào)通路如何,還有待進(jìn)一步深入研究。

    利益沖突:無(wú)

    作者貢獻(xiàn)聲明

    要兆旭:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫(xiě);馮志星:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;彭麗娜、韓海平:實(shí)施研究過(guò)程,資料搜集整理,論文修改;赫莉:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;楊雪:課題設(shè)計(jì),論文撰寫(xiě)

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