新城疫病毒昌吉株F基因的生物信息學(xué)特征分析

馬吉強(qiáng)，劉建華

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830002

禽新城疫（ND）是由禽新城疫病毒（NDV）引起的一種度接觸性急性傳染病，NDV是禽副黏病毒Ⅰ型（Pigeonparamyxovirus1，PPMV-1）為唯一的成員，也是家禽養(yǎng)殖戶的頭號“殺手”[1]。其癥狀主要以呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的病變?yōu)樘卣?，且傳播迅速快，發(fā)病率與死亡率高[2]。新城疫病毒F基因的遺傳變異與新城疫病毒的變異和流行具由密切的相關(guān)性，是NVD分子流行病學(xué)研究的首選基因。先前的學(xué)者多以NDVF基因全長序列來分析分子進(jìn)化關(guān)系，但隨著生物信息學(xué)的不斷深入研究，有學(xué)者[3,4]發(fā)現(xiàn)NDVF基因的第1～374位核苷酸序列，在同源性、分子進(jìn)化分析、流行病學(xué)調(diào)查等方面與全長序列完全一致。

本研究通過F基因的第1～374位核苷酸設(shè)計一對特異性引物，使用RT-PCR擴(kuò)增、測序及序列分析，分析NDV-CJ株的同源性、分子進(jìn)化及其氨基酸的理化特性、蛋白質(zhì)結(jié)果特點，同時分析了分離株NDV-CJ株F基因的分子特征，為昌吉地區(qū)新城疫病毒的流行特點及預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌（毒）株和質(zhì)粒

新城疫病毒分離株NDV-CJ株由本實驗室分離鑒定保存，大腸桿菌（Escherichiacoli，E.coli）DH5α，pMD18-T載體均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

1.2 主要試劑

DL-2000DNAMarker、2×PCRMix、1×TAE電泳緩沖液、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、基因組DNA提取試劑盒、pMD19-T載體和SolutionⅠ連接酶均購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，諾維森生物公司；LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基及LB選擇性固體培養(yǎng)基（Amp）均由本實驗室自制。

1.3 NDV-CJ株的F基因RT-PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank及國內(nèi)外已公布的F基因序列（登錄號：A03663.1），采用Primer5.0設(shè)計了1對NDV的F基因序列特異性引物，用于實驗室快速檢測NDV：上游引物F1：5’-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3’，下游引物F2：5’-GGAGGATGTTGGCAGCAT-3’。預(yù)期擴(kuò)增NDV的F基因片段大小為364 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

無菌取新鮮接種的雞胚尿囊液（JIF），使用病毒全基因組RNA提取試劑盒提取NDV-CJ的總RNA。按照清除基因組DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。通過對NDV F基因克隆以檢測NDV-CJ株，PCR反應(yīng)體系為20 μL，如下表1所示：反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性5 min，35個循環(huán)（95°C變性10 s，55°C退火30 s，72°C延伸90 s），72°C延伸10 min，4°C保存待用。

表1 PCR反應(yīng)體系的組成

1.4 目的片段的載體構(gòu)建

配置1%瓊脂糖凝膠，取上述獲得的PCR產(chǎn)物5 μL，以100 V的電壓進(jìn)行電泳20 min左右。將目的條帶切下后，按照瓊脂糖回收試劑盒說明書將目的片段回收。并與pMD18-T載體，充分混合均勻后，置4°C條件連接過夜。所使用的連接體系（10 μL）為：目的條帶回收產(chǎn)物5 μL、SolutionⅠ5 μL、pMD19-T載體0.5 μL。電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定，將鑒定為陽性的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后送華大基因（北京）科技有限公司測序。

1.5 序列分析

通過BLAST將NDV的F基因的測序拼接結(jié)果后，采用Mgea6.0軟件構(gòu)建不同來源的NDV的F基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用生物信息學(xué)分析軟件（見表3-2所示）分析其編碼蛋白的基本理化性質(zhì)、疏水性、可溶性、結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、信號肽、亞細(xì)胞定位、磷酸化位點、糖基化位點、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)等。

表2 蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)預(yù)測相關(guān)軟件網(wǎng)站

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

將NDV-CJ分離毒接種雞胚后收集的新鮮尿囊液提取病毒總RNA后，經(jīng)過清除DNA和反轉(zhuǎn)錄等步驟的處理，使用RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得約364 bp特異性條帶，與預(yù)期相符。即說明現(xiàn)有條件下本研究設(shè)計的F基因引物具有良好的特異性（見圖1所示)。

圖1 NDV-CJ F基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物重組質(zhì)粒的鑒定

將PCR產(chǎn)物經(jīng)經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得與預(yù)期相符的特異性條帶，切膠后使用瓊脂糖回收試劑盒回收目的片段，使用SolutionⅠ將回收的目的條帶連接到pMD19-T載體上，再經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、菌液PCR驗證等，提取質(zhì)粒后再次PCR擴(kuò)增得到了約364 bp特異性條帶（見圖2所示），與預(yù)期相符。即說明成功將目的基因連接到pMD18-T載體上，且在導(dǎo)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中。

圖2 菌液PCR鑒定結(jié)果

2.3 F基因序列分析

經(jīng)測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本實驗使用的F基因特異性引物擴(kuò)增處NDV-CJ分離毒的F基因，片段大小為364 p，與預(yù)期相符。并采用DNAMAN軟件推導(dǎo)出其氨基酸的序列，由121個氨基酸組成。在NCBI在線Blast分析發(fā)現(xiàn)，與NDV的強(qiáng)毒株具有高同源性，且屬于VII型，其典型特征明顯：存在特征性氨基酸分別為K（第81位）和V（第101位），其他分型的NDV在第81位和第101位的氨基酸分別為R和I。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

為了研究NDV-CJ的F基因序的分子進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA6.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），利用自舉分析（Bootstrap，1000次重復(fù))檢驗各分支的置信度，構(gòu)建該基因及GenBank中檢索到的15株NDV的F基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖3可知，分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與種屬有密切關(guān)系，而與病毒的來源關(guān)系不大。本實驗分離獲得NDV-CJ屬于VII分型，與Y98和TW/2000分離株遺傳進(jìn)化關(guān)系較為接近，均屬于VIId分型。

圖3 F基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 F蛋白的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測

2.5.1 F蛋白理化性質(zhì)

ExPASY在線ProtParam工具分析NDV-CJ分離毒F蛋白的理化性質(zhì)，預(yù)測顯示該蛋白分子質(zhì)量約為12.83kD，其分子式為C561H953N163O166S6，理論等電點（PI）為10.12；由121個氨基酸組成，其中亮氨酸（Leu）最高（9.9%），正電荷殘基數(shù)（Arg,Lys）16個、負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp,Glu）7個（見表3所示)。在哺乳動物體外培養(yǎng)的細(xì)胞中理論半衰期為30 h；脂溶指數(shù)為101.57，總平均疏水性為0.056，不穩(wěn)定指數(shù)為48.14。

表3 F蛋白氨基酸組成

2.5.2 F蛋白氨基酸序列的疏水性分析

應(yīng)用ProtScale在線軟件預(yù)測表明，沿著F蛋白的肽鏈走向，親/疏水性氨基酸均有分布，在第23位氨基酸處有最大疏水值為2.944，在第112位氨基酸處有最小疏水值均為-2.578，說明F蛋白有較強(qiáng)的疏水區(qū)域，該蛋白多肽鏈大部分區(qū)域分值為正值，說明該蛋白為疏水性蛋白（見圖4所示）；SOSUI在線軟件預(yù)測NDV-CJF蛋白的可溶性，顯示該蛋白屬于可溶性蛋白。

圖4 NDV-CJF蛋白疏水性分析

2.5.3 F蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測

在線軟件預(yù)測NDV-CJF蛋白，分析發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)。SignalP5.0Server在線軟件預(yù)測該蛋白具有信號肽序列，具體序列：MGPRPSTKNPVPMMLTVRVALVLSCICPANS，說明F蛋白可能在跨膜運輸中有信號識別作用；剪切位點位于第31～32位氨基酸，表明成熟肽始于第31位氨基酸（見圖5所示）。TargetP1.1程序預(yù)測F蛋白亞細(xì)胞定位，分析顯示分泌信號通路位點(SP)可能性為0.839，其他位點可能性為0.025，說明該蛋白屬于分泌蛋白。

圖5 NDV-CJF蛋白的信號肽預(yù)測

2.5.4 F蛋白磷酸化和糖基化預(yù)測

采用NetPhose3.1Server在線軟件預(yù)測NDVCJF蛋白的磷酸化位點，顯示當(dāng)潛在磷酸化位點的閾值為0.5時，F(xiàn)蛋白存在16個潛在的磷酸化位點，其中包括7個絲氨酸（Ser）位點、8個蘇氨酸（Thr）位點和1個酪氨酸（Tyr）位點（見圖6所示），且該蛋白可能有 PKC、PKA、unsp、cdc2、INSR、DNAPK、ATM、CKⅠ、p38MAPK等9種保守性蛋白激酶位點。采用NetNGlyc1.0Server預(yù)測F蛋白蛋白糖基化位點時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)蛋白含有1個糖基化位點，NRTL峰為0.7610（見圖7所示)。

圖6 NDV-CJF蛋白磷酸化位點預(yù)測

圖7 NDV-CJF蛋白糖基化位點預(yù)測

2.5.5 F蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPMA軟件對新疆分離株F蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有42個α-螺旋（34.71%）、2個β-轉(zhuǎn)角(1.65%)、53個無規(guī)則卷曲（43.80%）和24個延伸鏈（19.83%）（見圖8所示）。以SWISS-MODEL預(yù)測得到F蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型（見圖9所示），該模型以第38～105位氨基酸殘基建模的單鏈空間構(gòu)型，與模板序列1g5g.1(3.30?)的相似度為0.51%[5]，序列一致性為91.11%。

圖8 NDV-CJF蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖9 NDV-CJF蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討論

隨著生物信息學(xué)的不斷深入研究以及技術(shù)方法的不斷更新，對序列分析及分子進(jìn)化樹的更加全面及針對性。目前F基因被廣泛應(yīng)用于NDV的快速診斷，沈志強(qiáng)等[6]在2003年通過RT-PCR擴(kuò)增了F基因第1～374位核苷酸，通過與標(biāo)準(zhǔn)弱毒株（Clone30株）和我國標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株（F48E9株）序列的同源性對比及F基因裂解位點氨基酸，判斷分離株屬于強(qiáng)毒株，且結(jié)果也與毒力測定結(jié)果相一致。吳楊通過對分離株F基因與選取的38株NDV構(gòu)建分子進(jìn)化樹，獲得了分離株的基因分型，同時了解了該分離株與近年流行株具有較近的遺傳距離。本研究設(shè)計了一對F基因特異性引物（預(yù)期擴(kuò)增目的片段364 bp），經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增、測序及構(gòu)建分子進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)NDV-CJ株屬于VIId基因分型，且與疫苗株（LaSota/46株）遺傳距離較遠(yuǎn)，與Y98和TW/2000分離株遺傳進(jìn)化關(guān)系較為接近。表明該規(guī)?；B(yǎng)殖雞場的新城疫病毒并不是疫苗免疫所引起，而是通過其他途徑感染了近年來流行的的強(qiáng)毒株。

NDV的融合蛋白（F）具有使病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，使病毒穿入宿主細(xì)胞膜的作用[7]。故F蛋白裂解位點區(qū)氨基酸的組成和排列順序不同，決定了新城疫病毒的毒力差異。故本研究針對F基因（364 bp）基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測，結(jié)果表明F蛋白是一種偏堿性（PI理論值為10.12）、不穩(wěn)定（不穩(wěn)定指數(shù)為48.14,＜40為穩(wěn)定蛋白）和可溶性蛋白質(zhì)。F蛋白在哺乳動物體外培養(yǎng)的細(xì)胞中半衰期長達(dá)30 min，表明該蛋白質(zhì)可能含有信號肽序列并屬于分泌蛋白。信號肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白含有信號肽序列：MGPRPSTKNPVPMMLTVRVALVLSCICPANS（剪切位點位于第31～32位氨基酸）；亞細(xì)胞定位預(yù)測分析表明該蛋白屬于分泌型蛋白。表明了蛋白質(zhì)半衰期的長短在信號肽引導(dǎo)亞細(xì)胞定位中具有差異性，其結(jié)果與賈浩等[8]研究結(jié)論相一致。

蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋化學(xué)鍵能高，不易變形，可塑性低，起穩(wěn)定蛋白骨架作用；β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲易變形，可塑性高，存在蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)等特點，利于與抗體結(jié)合，成為抗原表位的的可能性較大[9]。本研究采用在線生物信息學(xué)軟件對F基因氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)相關(guān)的預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白二級結(jié)構(gòu)含有34.71%α-螺旋和43.80%無規(guī)則卷曲，且該蛋白三級結(jié)構(gòu)也是以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主構(gòu)成三維空間結(jié)構(gòu)。綜上結(jié)果所述，表明該蛋白具有穩(wěn)定蛋白骨架作用，又具有較高的可塑性，有抗原表位的可能，這些結(jié)果為F基因第1～374位核苷酸可以與全長序列功能相當(dāng)提供了堅實的理論依據(jù)。