天麻姜制前后對小鼠宏觀行為和腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響※

李曉芳 葉偉 梁文琴 張霞 范暉 李清 葉慧 陳婷 葉喜德*

（1 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，江西 南昌 330006；2 江西景德鎮(zhèn)中醫(yī)院藥劑科，江西 景德鎮(zhèn) 333000；3 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004）

天麻（Gastrodia elata Blume），又名赤劍、明天麻、定風(fēng)草等，是一種名貴中藥，以春、冬兩季采挖，春季采挖者名春麻，冬季采挖者名冬麻，但冬麻質(zhì)量較好。天麻經(jīng)采集過后，除去須根，洗凈，再依法進(jìn)行炮制?，F(xiàn)代天麻炮制方法主要是潤制和蒸制切薄片法，姜天麻制法早在清代《幼幼集成》中就有記載［1］，但該法局限于常規(guī)炙法，研究也只限于形狀鑒別，未進(jìn)行深入研究。本文中的姜天麻，是基于江西“建昌幫”特色炮制法，該藥幫為我國南方古藥幫和中藥炮制重要流派之一，常以“樟幫”合稱為“江西藥幫”［2］。采用姜汁炮制天麻，目的是增強(qiáng)天麻止痛、抗眩暈之效。前期研究基礎(chǔ)表明，天麻經(jīng)姜制后，其主要成分天麻素發(fā)生了變化［3］。因此，本研究擬從動物宏觀行為學(xué)結(jié)合腦組織形態(tài)，通過比較天麻姜制前后不同炮制品之間的差異，考察姜制對天麻的影響，從而為深入開展姜天麻藥效試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物 昆明種小鼠SPF級40只，體重18～22 g，雄性，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK（魯）2014-0007。

1.2 藥材與試劑5-HT（PAA808G01，cloud-clone Corp.）；聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG（SV0002，博士德）；5%BSA封閉液（SW3015，Solarbio）；DAB顯色試劑盒（CW0125，CWBIO）；中性樹脂（CW0136，CWBIO）；蘇木素染色（AR1180-1，博生德生物）鮮榨生姜汁 生天麻藥液 姜制天麻藥液、0.9%的生理鹽水、4%多聚甲醛、4%戊巴比妥鈉（上海榕柏生物技術(shù)有限公司）。天麻、生姜購于江西省樟樹中藥材市場，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)教授龔千鋒鑒定為天麻藥材。

1.3 儀器 電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A）；熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9054，山東博科生物科技有限公司）；顯微鏡（CX41，OLYMPUS）；切片機(jī)（BQ-318D，伯納）；移液槍（Research plus 0.5～10μL，eppendorf）；移液槍（Research plus 20～200μL，eppendorf）；高壓鍋（YS20ED，蘇泊爾）等鼠籠6個 型號：M1規(guī)格290×178×160 mm六個刻度飲水瓶；電子秤CP214奧豪斯儀器上海有限公司產(chǎn)品；墊料；電煎藥砂鍋（金成白瓷砂鍋潮州市潮安區(qū)彩塘鎮(zhèn)煌達(dá)五金廠JC-35B）；101-1A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海滬粵命科學(xué)儀器有限公司；828L福意聯(lián)恒溫冰箱（2～20℃，青海海爾股份有限公司）；蒸制容器（電飯鍋廉市博鴻電器廠CFXB30）；電子天平cp214奧豪斯儀器（上海衡平儀器儀表廠產(chǎn)品）；眼科剪、鑷子、棉球等常規(guī)實(shí)驗(yàn)器材。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 炮制品制備 生天麻：取天麻原藥材200 g，除去殘莖雜質(zhì)并用清水清洗干凈，均勻攤開平放于蒸架上，再將蒸架放在盛有適量水的蒸制容器內(nèi)，隔水蒸制，利用水蒸氣將天麻蒸至徹底軟透無白心，隨即將其取出，趁熱切成薄片，然后將薄片均勻攤開放至于托盤上，將托盤放入40℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，取出備用。

姜天麻：取制備出的生天麻100 g，另取姜汁12.5 mL，基于江西“建昌幫”炮制方法，將生姜汁倒在已制備好放在燒杯中的生天麻，加少量的蒸餾水使姜汁的液面高于生天麻，燒杯口套上保鮮膜，浸泡過夜。待生姜汁被吸干后，將其取出，均勻攤開擺放于托盤中放入20℃烘箱中烘干即可，待用。

2.2 藥液制備 生天麻藥液：稱取已經(jīng)制備好的生天麻20 g，放入已經(jīng)清洗干凈的電飯煲中，加入適量水浸沒生天麻，放置浸泡30 min后開始煎煮，煎煮20～25 min后倒出煎煮液，再加入適量水進(jìn)行第2次煎煮。將2次煎煮液合并即得生天麻藥液。

姜天麻藥液：稱取已經(jīng)制備好的姜天麻20 g，放入已清洗干凈的電飯煲中，加入適量水浸沒姜天麻，浸泡30 min后開始煎煮，煎煮20～25 min后倒出煎煮液，再加入適量水進(jìn)行第2次煎煮。將2次煎煮液合并即得姜天麻藥液。

鮮生姜汁：稱已洗凈的鮮生姜5 g，用紗布包著放入研缽中用缽杵完全搗碎，盡可能倒出全部姜汁，按照姜汁與水的比例1∶4加水稀釋，生姜汁都是現(xiàn)榨現(xiàn)用，保證其新鮮度不受到影響。

2.3 動物分組與給藥 昆明種SPF級雄性小鼠40只，體質(zhì)量（20±2）g，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為空白組、生天麻組、姜制天麻組、生姜組，給藥組按0.1 mL/g的劑量灌胃給藥，空白組給予等量生理鹽水，用苦味酸對每個籠中的小鼠進(jìn)行標(biāo)記。各組小鼠于同一環(huán)境條件下，室內(nèi)為22～26℃，保持周邊安靜，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

藥液預(yù)處理將制備好的藥液和生理鹽水，從冰箱中取出后，放至常溫。姜汁為臨時壓榨，按1∶4的比例加水稀釋，備用。

給藥：將飼養(yǎng)后的小鼠，按照0.1 g/mL濃度灌胃給藥，灌胃結(jié)束后將小鼠放回?fù)Q好干凈的墊料籠子中，每組投放100 mL水，并做好飲水記錄。食物投放量為100 g，每天查看，并做好記錄食物和水的消耗量，每隔5 d，分別對各組小鼠稱重，以便觀察其體重變化。連續(xù)灌胃30 d。記錄實(shí)驗(yàn)過程中小鼠體重、飲水量、飲食量、毛發(fā)以及大便色質(zhì)的變化。

2.4 腦組織樣品制備 方法：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，依照如下方法進(jìn)行解剖：（1）小鼠稱重，每組小鼠腹腔注射4%戊巴比妥鈉（0.0025 mL/g）進(jìn)行麻醉；（2）將麻醉小鼠置于手術(shù)臺上，剪掉毛發(fā)，解剖小鼠，鑷子提起心臟尖端，注射器刺破心尖部進(jìn)針約0.5 cm，并切開右耳；（3）用生理鹽水進(jìn)行灌注，直至右側(cè)耳廓流出的液體為無色，同時小鼠肝臟蒼白，停止灌注；（4）采用4%多聚甲醛進(jìn)行灌流至小鼠肢體突然緊張，尾部卷曲，即可；（5）用剪刀剪開顱骨，取下小鼠完整大腦；（6）將大腦放入準(zhǔn)備好的多聚甲醛中固定2～4 h，然后移到30%蔗糖中放在4℃的冰箱中過夜。

2.5 免疫組化及染色 主要步驟：（1）烤片：組織切片入放入65℃烤箱中烤2 h；（2）脫蠟：切片在二甲苯放置10 min；（3）水化：將切片依次放入95%、80%的乙醇和純化中水各3 min；（4）抗原修復(fù)：將切片加入抗原修復(fù)液（檸檬酸緩沖液），高壓鍋加熱到自動放氣，自然冷卻，棄去抗原修復(fù)液，用PBS淋洗，加入新鮮配制的3%雙氧水，室溫孵育10 min，PBS充分淋洗；（5）非特異性封閉：PBS浸洗玻片3次，吸干組織周圍的PBS，滴加5%BSA，37℃封閉30 min；（6）免疫反應(yīng)：用吸水紙吸掉組織周圍的封閉液，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗5-HT（10μg/mL），放入濕盒中，4℃孵育過夜；（7）顯色復(fù)染。

3 結(jié)果

3.1 天麻姜制前后對小鼠宏觀行為學(xué)的影響 各組實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)環(huán)境相同，以便排除外在因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。各組試驗(yàn)小鼠在毛發(fā)、糞便和活動量等方面差異明顯。在便質(zhì)方面，與空白組相比，姜制天麻和生姜組小鼠的糞便較為干燥，天麻組小鼠糞便較順滑、潮濕；在活動量方面，與空白組相比，生天麻組的小鼠較安靜、無異常興奮狀態(tài)，生姜組和姜制天麻組的小鼠呈現(xiàn)好動狀態(tài)，喂藥時較反抗。說明姜制天麻會影響小鼠代謝功能，提示以姜為輔料，來炮制天麻，會對天麻的藥性產(chǎn)生一定影響；從觀察天數(shù)的平均飲水量上看，與空白組相比，姜天麻組和生姜組飲水量明顯增加，生天麻組增加并不明顯。提示天麻經(jīng)辛溫之生姜炮制后，有可能使藥材性能發(fā)生改變。飲水量逐漸增加，說明隨著溫性藥材用量加大，可能會對體內(nèi)的陰液產(chǎn)生影響，從而出現(xiàn)口渴癥狀。見表1、圖1。

表1 天麻姜制前后對小鼠宏觀行為學(xué)的影響

圖1 不同組別飲水量變化情況

3.2 小鼠腦組織顯微圖 空白組中神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核呈圓形，胞漿豐富、均勻淡染。

與空白組相比，天麻組組和生姜組小膠質(zhì)細(xì)胞，明顯變小、增多，排列更趨密集。姜天麻組的神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞尤為突出，且神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則、染色質(zhì)均勻分布、細(xì)胞器豐富。但隨著給藥時間的延長，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，形態(tài)不規(guī)則化，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生腫脹、部分細(xì)胞有凋亡的趨勢，見圖2～5。

圖2 空白組（×400）

圖3 天麻組（×400）

圖4 姜天麻組（×400）

圖5 生姜組（×400）

3 討論

中藥炮制方法是我國歷史悠久的制藥技術(shù)，中藥經(jīng)過加工炮制以后，勢必會影響到藥物性能，進(jìn)而影響藥效作用，而炮制的主要目的是減毒增效［4］。天麻為平性藥材，味甘，入肝經(jīng)，具有平抑肝陽、熄風(fēng)止痙之功。為臨床常用中藥，在用治偏頭痛方面，效果顯著?，F(xiàn)代研究表明［5］，頭痛病因較多，既有內(nèi)因，也有外感受寒致使毛血管收縮、肌肉痙攣等原因引起。而改善微循環(huán)，增加血液流變學(xué)，是現(xiàn)代研究緩解頭痛的主要途徑［6］。本研究采用辛溫之生姜為輔料，來炮制性平之天麻，其機(jī)理就是基于“姜制溫散”原理，通過改變藥物性能，使其轉(zhuǎn)溫；從現(xiàn)代機(jī)理角度，通過輔料生姜擴(kuò)張血管，改善血液流變學(xué)，以達(dá)到增強(qiáng)天麻鎮(zhèn)靜止痛作用。

研究通過觀察小鼠行為學(xué)基本特征和變化，來推測藥性變化。結(jié)果表明，小鼠在給予天麻不同炮制品時，各組別小鼠的糞便、活動量、毛發(fā)和飲水量相應(yīng)的發(fā)生了改變。在于空白組相比，姜制天麻組較天麻組，呈現(xiàn)的熱性表征較為明顯。毛發(fā)較為干枯，小鼠活動量或抗拒食物相應(yīng)發(fā)生變化。天麻組小鼠則相對安靜，無異常興奮性現(xiàn)象發(fā)生。在飲水量方面，姜制天麻可能組小鼠稍有增多，說明姜制影響天麻藥物性能，這種變化是否與天麻鎮(zhèn)靜止痛作用相關(guān)，還有待進(jìn)一步闡明。

同時，通過觀察受試小鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)一步弄清姜制天麻炮制前后變化差異。腦組織形態(tài)中小膠質(zhì)細(xì)胞，是腦組織中一種免疫細(xì)胞，對外界刺激敏感性較大。小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦組織損害的“信號彈”［7］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在受到攝入物影響時，小膠質(zhì)細(xì)胞是系統(tǒng)中最早發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞類型，也是一些受體和分泌物的主要儲庫，通過吞噬作用和分泌作用進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞［8］。

在腦組織顯微圖中發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，姜天麻、生姜和天麻組的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了變化，姜天麻組增加較為明顯。小膠質(zhì)細(xì)胞增多可以更好地保護(hù)神經(jīng)元；同時小膠質(zhì)細(xì)胞的增多說明腦組織中微環(huán)境產(chǎn)生了變化。但隨著給藥的時間延長，部分細(xì)胞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其形態(tài)出現(xiàn)了不規(guī)則化，小膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，形態(tài)發(fā)生了變化。根據(jù)上面種種表明姜制天麻炮制前后對小鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。

可見，考察動物宏觀行為學(xué)和腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，是考察藥物炮制前后藥性差異的重要因素，希望本研究可為深入研究天麻奠定基礎(chǔ)。