鹽脅迫對小麥根系氧化損傷及細(xì)胞程序性死亡的影響

李有芳，王石平，丁金金，李衛(wèi)華

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，對我國農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的價(jià)值[1]。近年來，隨著土壤鹽漬化的加重，農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)不斷下降。根系作為植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，其正常的生理代謝直接影響作物的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。鹽脅迫下植物根系最先感知逆境脅迫信號并做出相應(yīng)的生理代謝反應(yīng)[3]。因此，探究鹽脅迫下，植物根系的生理變化對開展小麥耐鹽育種和栽培具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用耐鹽性不同的小麥(TriticumaestivumL.)品種新春11號(高耐鹽)、新春29號(中耐鹽)、新春6號(鹽敏感)為供試材料，由石河子大學(xué)麥類作物研究所提供。

1.2 根尖培養(yǎng)與鹽處理

選取大小一致，籽粒飽滿的小麥種子100粒，用1‰氯化汞消毒5 min后，用去離子水清洗3次，均勻排布在發(fā)芽盒中，放置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)根系長度達(dá)到3～4 mm時(shí)，用300 mmol·L-1的NaCl對供試小麥進(jìn)行脅迫處理，以蒸餾水作對照(CK)，每個(gè)處理3次重復(fù)，處理液每天更換1次，處理7 d后結(jié)束。

1.3 根長與干、鮮重的測定

在NaCl處理后第3、第5、第7天取樣，每個(gè)處理取10株小麥幼苗測定其根長與干、鮮重，重復(fù)3次，具體參考弋良朋等[14]的方法。

1.4 根尖細(xì)胞活性氧及抗氧化酶活性的測定

1.5 根尖伊文思藍(lán)(Evans Blue)染色

取NaCl處理0、4、8和12 h后的根尖，染色具體參照Young等[18]方法。將樣品置于0.1%的Evans Blue的水溶液中浸染2 min，取出根尖，純凈水清洗表面藍(lán)色染液，光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。

1.6 DNA提取和電泳檢測

用植物基因組DNA提取試劑盒EasyPure Plant Genomic DNA Kit提取NaCl處理0、4、8和12 h后的根尖細(xì)胞DNA，核酸蛋白分析儀(NanoDrop，USA)檢測基因組DNA的純度和濃度。3.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行DNA片段化檢測，硝酸銀染色觀察。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010和SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對小麥根長及根系生物量的影響

正常生長條件下隨著生長發(fā)育的不斷推進(jìn)，小麥的根長逐漸增長，三品種間無明顯差別。鹽脅迫大大減緩了小麥根系伸長生長。由圖1A可見，鹽脅迫處理后各時(shí)期小麥的根長顯著低于對照。鹽脅迫對根長的影響在品種間存在顯著差異。鹽處理7 d后，新春29號的根長顯著高于新春6號和新春11號。鹽處理后，小麥根系鮮重和干重與對照相比顯著下降(圖1B)。在處理7 d后，新春11號和新春29號根鮮重顯著大于新春6號。隨著脅迫時(shí)間的延長，根系干重逐漸增加(圖1C)。三個(gè)品種中，鹽處理和對照間根系干重存在明顯差異。鹽處理3 d和5 d后，新春6號根系干重與新春11號和新春29號差異顯著，而鹽處理7 d后三品種間無顯著差異。這些結(jié)果表明，鹽處理后期耐鹽品種新春11號、新春29號的根系繼續(xù)生長，相比新春6號受到鹽脅迫的影響較小。

2.2 鹽脅迫對小麥根尖活性氧含量的影響

2.3 鹽脅迫對小麥根尖抗氧化酶活性的影響

鹽脅迫后各小麥品種的根尖SOD活性呈單峰曲線變化，在鹽處理后30 min左右達(dá)到最高水平，而對照變化平穩(wěn)(圖3A)。脅迫開始后鹽處理相比對照均顯著上升，鹽脅迫120 min后與對照相近。小麥SOD最大活性以新春29號最高，新春6號最低，三個(gè)品種間差異均顯著。在受到鹽脅迫后，三個(gè)品種APX活性均迅速上升，也在30 min左右達(dá)到最大值，隨后開始不斷下降，最終均降至低于對照組。鹽處理后新春6號APX活性快速升高，顯著高于新春29號和新春11號(圖3B)。這些結(jié)果說明，在受到鹽脅迫后，小麥根系抗氧化酶的活性最初會有所上調(diào)，達(dá)到一定水平后開始下調(diào)，但不同酶活性下調(diào)的幅度不同。

圖柱上不同字母代表處理間差異顯著(P<0.05)。XC6：新春6號；XC11：新春11號；XC29：新春29號。圖2、圖3同。

Different letters above columns mean significant differences among the treatments at 0.05 level.XC6：Xinchun 6;XC11:Xinchun 11;XC29:Xinchun 29.The same in figures 2 and 3.

圖1 鹽脅迫對小麥根長及根系干重和鮮重的影響

Fig.1 Effect of salt stress on length，dry weight and fresh weight of wheat root

圖2 鹽脅迫對小麥根尖活性氧含量的影響

圖3 鹽脅迫對小麥根尖抗氧化酶活性的影響

2.4 鹽脅迫對小麥根尖細(xì)胞活性的影響

Evans Blue染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照條件下除細(xì)胞間隙有未洗干凈的染液外，小麥根尖細(xì)胞未被染色，形態(tài)結(jié)構(gòu)良好；而鹽處理的根尖部分細(xì)胞被染成藍(lán)色，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長，被染色細(xì)胞數(shù)目逐步增多(圖4)。鹽處理4 h后已經(jīng)發(fā)生細(xì)胞程序性死亡；鹽處理8 h后，根尖中相當(dāng)一部分細(xì)胞被染成藍(lán)色，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間隙增大；鹽處理12 h后，整個(gè)根尖藍(lán)色程度明顯加深。鹽脅迫12 h后，新春6號根尖被染色的細(xì)胞較多，新春29號次之，新春11號根尖染色細(xì)胞最少，說明在鹽脅迫下，根尖細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，而新春11號的細(xì)胞活性強(qiáng)于新春29號和新春6號，表現(xiàn)出較好的耐鹽性。

2.5 鹽脅迫對根尖細(xì)胞DNA降解的影響

經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，鹽脅迫后小麥根尖DNA出現(xiàn)斷帶現(xiàn)象(圖5)。不同耐鹽品種的DNA斷裂情況存在差異。鹽敏感品種新春6號和中等耐鹽品種新春29號在鹽處理4 h左右發(fā)生DNA片段化，耐鹽品種新春11號在鹽脅迫8 h發(fā)生DNA片段化。對于同一品種，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長，DNA斷裂程度加重。

3 討 論

根系的總根長和鮮、干重能夠反映植物根系生長發(fā)育的好壞。翁亞偉等研究表明，鹽脅迫下小麥的總根長及干物質(zhì)重均顯著下降[19]。本研究中耐鹽性不同的三個(gè)小麥品種，在受到鹽脅迫后，根長和鮮、干重均顯著下降，和對照相比根系生長受到抑制，生長速度減慢。耐鹽品種新春11號受到鹽脅迫的抑制作用小于鹽敏感品種新春6號。

A1～D1分別為新春6號CK、NaCl處理4 h、8 h、12 h；A2～D2分別為新春29號CK、NaCl處理4 h、8 h、12 h；A3～D3分別為新春11號CK、NaCl處理4 h、8 h、12 h。

A1-D1:Root tips of Xinchun 6 under CK and 4 h,8 h and 12 h after NaCl treatment；A2-D2:Root tips of Xinchun 29 under CK and 4 h,8 h and 12 h after NaCl treatment；A3-D3:Root tips of Xinchun 11 under CK and 4 h,8 h and 12 h after NaCl treatment.

圖4 鹽脅迫誘導(dǎo)小麥根尖細(xì)胞程序性死亡的光學(xué)顯微鏡觀察

Fig.4 Light microscopic observation of programmed cell death induced by salt stress in wheat root tip cells

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量3000，1：新春6號對照，2：新春6號鹽處理4 h，3：新春6號鹽處理8 h，4：新春6號鹽處理12 h；5：新春29號鹽處理12 h，6：新春29號鹽處理8 h，7：新春29號鹽處理 4 h，8：新春29號對照，9：新春11號對照 10：新春11號鹽處理 4 h，11：新春11號鹽處理8 h，12：新春11號鹽處理12 h。

M:DNA marker 3000,1:Xinchun 6 CK,2:Xinchun 6 under NaCl treatment for 4 h,3:Xinchun 6 under NaCl treatment for 8 h,4:Xinchun 6 under NaCl treatment for 12 h,5:Xinchun 29 under NaCl treatment for 12 h,6:Xinchun 29 under NaCl treatment for 8 h,7:Xinchun 29 under NaCl treatment for 4 h,8:Xinchun 29 under CK,10:Xinchun 11 under NaCl treatment for 4 h,11:Xinchun 11 under NaCl treatment for 8 h,12:Xinchun 11 under NaCl treatment for 12 h.

圖5 小麥根尖基因組DNA片段化檢測

Fig.5 Detection of wheat root tip genomic DNA fragmentation

細(xì)胞程序性死亡是一個(gè)完全由自身基因調(diào)控的過程，隨著人們對植物程序性死亡研究的深入，發(fā)現(xiàn)PCD現(xiàn)象在植物中廣泛存在[25]。Katsuhara[26]發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫下大麥根尖分生組織發(fā)生細(xì)胞程序性死亡，可觀察到典型的PCD形態(tài)和生化特征。寧順斌等[27]對鹽脅迫下玉米、水稻和煙草等植物根尖分生組織細(xì)胞形態(tài)和生化變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)根尖細(xì)胞原生質(zhì)體皺褶、形態(tài)不規(guī)則、核物質(zhì)濃縮、DNA片段化等現(xiàn)象。本試驗(yàn)中通過伊文思藍(lán)染色，隨著脅迫時(shí)間延長，染色加深，根尖細(xì)胞開始死亡；聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果則直觀地表現(xiàn)了鹽脅迫后小麥根尖PCD的發(fā)生。

本研究結(jié)果表明，鹽脅迫誘導(dǎo)小麥根尖活性氧含量積累，抗氧化酶活性增強(qiáng)。隨著鹽脅迫時(shí)間的延長，抗氧化酶活性開始降低，直到與對照相近，造成活性氧的積累，促使小麥根尖發(fā)生細(xì)胞程序性死亡，且耐鹽性小麥比敏感型小麥啟動細(xì)胞程序性死亡要晚一些。