小麥抗赤霉病鑒定及其抗病基因的檢測

徐婷婷，王永軍，狄佳春，孫蘇陽，蔡士賓，汪巧玲，鄒淑瓊，朱 銀，楊 欣，顏 偉

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點實驗室，江蘇南京 210014；2.江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇淮安 223001)

小麥赤霉病主要是由禾谷鐮孢菌引起的一種小麥真菌病害，廣泛發(fā)生在世界潮濕和半潮濕地區(qū)，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。小麥感染赤霉病后表現(xiàn)病癥為小麥根腐、苗枯、莖腐、稈腐和穗腐，除此以外，麥穗和籽粒被病菌侵染后，還會產(chǎn)生真菌毒素，嚴(yán)重危害人畜安全[1-3]。我國小麥赤霉病重發(fā)區(qū)域主要集中在長江中下游冬麥區(qū)和東北東部春麥區(qū)。隨著氣候變化和耕作制度的改變，小麥赤霉病的發(fā)病區(qū)域已蔓延到黃淮麥區(qū)、北方麥區(qū)[4]。目前為止，控制赤霉病的主要方式有藥劑防治和依賴抗病品種為基礎(chǔ)的綜合防治技術(shù)，在長江中下游麥區(qū)取得了一定成效。黃淮麥區(qū)長期以來缺少選擇壓力，生產(chǎn)品種基本不抗赤霉病，隨著氣候和耕作栽培方式的變化，黃淮麥區(qū)已經(jīng)逐漸成為小麥赤霉病發(fā)生的主要區(qū)域之一。小麥揚花期的雨水是誘發(fā)小麥赤霉病的主要氣象因子，抽穗揚花期的降水往往使藥物防治喪失最佳的防治時機，而且化學(xué)防治還會對土壤和水體環(huán)境造成污染。因此，篩選抗性資源，挖掘抗性基因，通過品種改良提高品種抗性是控制黃淮麥區(qū)小麥赤霉病危害的最為經(jīng)濟(jì)有效的方式。

目前為止，育種家已經(jīng)挖掘并培育了一些優(yōu)良抗性小麥品種，比如蘇麥3號、望水白、揚麥系列、寧麥系列品種等，主要集中在長江中下游麥區(qū)及雨水相對較多的南方地區(qū)，其中對蘇麥3號、望水白、寧7840等抗性資源，研究應(yīng)用最為廣泛。研究表明，寄主對赤霉病的抗性分為：I型抗性(抗侵染)、II型抗性(抗擴展)、III型抗性(抗DON毒素)和對赤霉病的基礎(chǔ)抗性[2,5]。蘇麥3號和望水白均具有抗侵染性和抗擴展性，望水白受侵染后DON毒素積累少。但由于抗源品種農(nóng)藝性狀較差，在育種中作為抗性親本直接利用難度較大[6]。近年來，已有大量的小麥抗赤霉病QTLs被報道，主要是參與II型抗性的位點。位于蘇麥3號3BS染色體上的Fhb1，是一個主效QTL，已得到廣泛利用[7]，既抗擴展又抗毒素積累[8-10]；Fhb2位于6BS染色體上，是一個抗擴展基因，定位在Xgwm133～Xgwm644區(qū)間內(nèi)[11-12]；Fhb5A是一個抗侵染基因，位于5A 染色體上[13]；Fhb7A位于第7染色體上，是一個抗擴展基因[14-15]，隨之又在7DL染色體上檢測到一個新的抗赤霉病基因QFhb.cau～7DL[16]；Fhb4與Fhb5是與抗侵染相關(guān)的QTL，分別在4BL與5AS的近著絲粒處，分別定位于Xhbg226～ Xgwm149與Xgwm304 ～ Xgwm415區(qū)間[17-18]。這些抗性QTLs為小麥抗赤霉病分子育種提供了抗性基因來源。

本研究利用單花滴注對107份小麥資源進(jìn)行田間赤霉病抗性鑒定，并選取與抗性QTL穩(wěn)定緊密連鎖的分子標(biāo)記，對供試品種進(jìn)行抗病基因鑒定，探究其抗性水平與抗性類型，為利用分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)方法培育抗赤霉病小麥新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取黃淮麥區(qū)和長江中下游麥區(qū)小麥品種共107份(表1)，其中揚麥16與寧麥13作為中抗對照，淮麥20作為中感對照。蘇麥3號作為SSR分子標(biāo)記的對照品種。

1.2 赤霉病抗性田間鑒定與評價

2017-2018年，將供試小麥材料于11月份在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合基地播種，順序排列，每個品種均種植2行，行長2 m，行距25 cm，每行60株。

赤霉病接種：于小麥揚花期，在穗中部小穗的第1朵小花內(nèi)，用微量進(jìn)樣器注射10 μL分生孢子懸浮液(1×105個·L-1)接種赤霉病菌，每個株系接種20～30個穗子，然后用透明塑料袋將整個麥穗套住保濕，并掛上紙牌標(biāo)明接種日期，保濕72 h后去掉塑料袋。

病情記載：單花滴注21 d后，調(diào)查接種穗子的病情嚴(yán)重度，計算病情指數(shù)。小麥赤霉病嚴(yán)重度分級按《小麥抗赤霉病評價技術(shù)規(guī)范》(NY/T 1443.4-2007)進(jìn)行。

1.3 DNA提取

小麥種子在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽一周，每個品種隨機取10株幼苗，采用CTAB法[19]混合提取植物葉片總DNA，溶解于200 μL TE中，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SSR標(biāo)記與PCR擴增

根據(jù)前人的研究結(jié)果，選取與小麥抗赤霉病QTL(Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb5)相關(guān)的8個分子標(biāo)記(Xumn10、XSTS3B～142；Xgwm133、Xgwm644；Xhbg226、Xgwm149；Xgwm304、Xgwm415)。上述引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)在Tong96G上進(jìn)行，總體積為 10 μL，包括2.0 μL DNA模板(10 ng·μL-1)、2 pmol·μL-1引物1.0 μL，2×Taq PCR Master Mix(0.05 U·μL-1DNA Taq聚合酶，4 mM MgCl2和0.4 mM dNTPs)5 μL和2 μL ddH2O。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃恒溫保存。

1.5 指紋記錄

擴增后的PCR產(chǎn)物中加入TE緩沖液至 24 μL。將待檢測的進(jìn)樣板置于離心機，1 000 r·min-1離心15 s，然后放入ABI 3130 XL DNA 測序儀中進(jìn)行毛細(xì)管電泳。上機、參數(shù)設(shè)計、電泳等按儀器操作指南進(jìn)行。用軟件PRO SIZE 2.0 收集原始數(shù)據(jù)，分析擴增片段峰型，讀取片段數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試小麥品種田間對赤霉病的抗性

接種21 d后調(diào)查結(jié)果顯示，小麥品種間具有不同的赤霉病抗性水平(表1)。對照中抗品種寧麥13和揚麥16的赤霉病嚴(yán)重度為0.70和 0.93，病情指數(shù)分別為17.39和23.15，對照中感品種淮麥20的赤霉病嚴(yán)重度為1.68，病情指數(shù)為41.96。供試品種嚴(yán)重度范圍為0.34～ 3.21，病情指數(shù)范圍為8.62～82.89，呈近正態(tài)分布(圖1)。病情指數(shù)最低為揚富麥101(8.62)，最高為機麥211(82.89)。

根據(jù)病情指數(shù)對供試小麥品種進(jìn)行抗赤霉病分級結(jié)果(表2)顯示，供試品種中病情指數(shù)低于17.39(寧麥13的病情指數(shù))，大田表現(xiàn)抗病(R)的品種只有1份，占全部供試小麥的0.93%；病情指數(shù)高于17.39且低于32.00的中抗(MR)品種有12份，占全部供試品種的11.21%；中感(MS)品種21份，占全部供試品種的19.63%；大多數(shù)為感病品種，占供試品種68.22%。

篩選到的抗赤霉病(R)品種為揚富麥101(揚麥158//鎮(zhèn)麥7853/蘇肯1號)，可以作為抗性親本用于赤霉病抗性育種。12個中抗(MR)品種分別為寧麥13、寧麥資119、濮麥1165、揚麥16、寧麥資68、淮陰2016J025、淮陰2016J050、淮陰2016J068、淮陰2016J087、鄭品麥25、綠雨918、‘08-65’，表現(xiàn)為赤霉病病程進(jìn)展緩慢，赤霉病抗性水平較高(圖2，A-B)；相比較而言，寧麥13、寧麥資119、揚麥16等來自淮南地區(qū)的品種抗性明顯優(yōu)于淮北品種，主要原因可能是長期育種選擇和抗病資源應(yīng)用的結(jié)果。從整體上看，中抗以上品種僅占12.15%，中感及感病材料占87.85%，安麥1350、洛麥27、懷川365、機麥211等來自淮北地區(qū)的品種病情指數(shù)極高，表現(xiàn)出嚴(yán)重的感病性(圖2，C-E)。淮陰2016J025、淮陰2016J050、淮陰2016J068等沿淮地區(qū)新品系抗性得到一定程度改善?？傮w上，淮北地區(qū)小麥品種赤霉病抗性不強，需要加以改良。

2.2 供試小麥品種的抗赤霉病QTL位點鑒定

為了探究抗赤霉病的QTL位點是否存在于供試小麥品種，利用與赤霉病抗性位點連鎖的8個標(biāo)記，對107份供試品種進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3A、表3所示。

檢測到攜帶單個或多個赤霉病抗性基因的小麥品種共有52份，其中，攜帶單個抗性基因Fhb4或Fhb5的小麥品種數(shù)目最多，分別為15份和12份，分別占供試品種的14.02%和11.21%，表明這些小麥品種擁有位于4B或5A染色體的抗侵染性主效QTL位點；而攜帶單個抗擴展基因Fhb1或Fhb2的小麥品種分別有2份和7份；攜帶2個抗性基因(Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4、Fhb1+Fhb5、Fhb2+Fhb4、Fhb2+Fhb5、Fhb4+Fhb5)的小麥品種共有14份，占總供試小麥品種的13.08%；只有2份小麥品種攜帶3個抗性基因(Fhb2+Fhb4+Fhb5)，為淮陰2016J110、淮陰2016J106。

2.3 分子標(biāo)記輔助選擇小麥抗性品種

為了解與抗性QTL位點緊密連鎖的分子標(biāo)記與小麥赤霉病抗性關(guān)系，對攜帶不同抗性基因及其組合的小麥品種的田間抗病級別進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖3B、表3所示。

表1 供試小麥品種(系)及赤霉病抗性鑒定結(jié)果

R：抗；MR：中抗；MS：中感；S：感。

R:Resistance; MR:Moderate resistance; MS:Moderate sensibility; S:Susceptibility.

圖1 供試小麥品種抗赤霉病病情指數(shù)分布

與不攜帶抗性基因的小麥品種相比，攜有單個或多個抗性基因的小麥品種的病情指數(shù)大多較低(圖3B)，降低的病情指數(shù)值范圍為0.61～ 24.53。其中攜有Fhb1、Fhb2及與Fhb1組合(Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4、Fhb1+Fhb5)的小麥品種，其病情指數(shù)均降低，降低值分別為 19.79、23.41、15.83、24.53和0.88，抗性基因效應(yīng)分別為36.08%、42.70%、28.87%、44.73%和1.61%；攜有單個抗侵染基因Fhb4的小麥品種病情指數(shù)降低了11.33，抗性基因效應(yīng)為20.66%。表明攜有赤霉病抗性基因的品種大多數(shù)對赤霉病有抗性。部分含抗性基因的小麥品種的病情指數(shù)下降不多，甚至還有所升高，如：Fhb5、Fhb2+Fhb4、Fhb2+Fhb5、Fhb2+Fhb4+Fhb5等組合(表3)。綜上所述，攜帶抗性基因Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4、Fhb1+Fhb5的小麥品種可以作為抗性育種材料。

對抗性品種的抗譜研究發(fā)現(xiàn)，赤霉病抗性表現(xiàn)為R、MR和MS級別的品種都或多或少攜有抗性位點(表3)。如小麥品種揚富麥101病情指數(shù)為8.62，對赤霉病表現(xiàn)為抗病，其攜有Fhb1和Fhb4基因；對赤霉病抗性表現(xiàn)為中抗的品種，其嚴(yán)重度范圍0.70～1.28，病情指數(shù)范圍17.39～32.00，且這些中抗小麥品種均攜有單個或多個抗性基因，如淮陰2016J087 攜有Fhb1基因，寧麥13、寧麥資68攜有基因Fhb1+Fhb4等。表明揚富麥101、寧麥13、淮陰2016J087、寧麥資68 等抗性種質(zhì)可以作為抗性親本加以利用，并可利用與上述抗性QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。

表2 供試小麥品種的抗赤霉病分類

A：揚麥16；B:揚富麥101；C：淮核13068；D：安麥1350；E：機麥211。

A:Yangmai 16; B:Yangfumai 101; C:Huaihe13068; D:Anmai 1350; E:Jimai 211.

圖2 單花滴注接種后21 d穗子

Fig.2 Spikes of wheat on the 21st day after infection

抗性基因效應(yīng)=(攜帶抗性基因的品種的病性指數(shù)-不含抗性基因品種的病情指數(shù))/不含抗性基因品種的病情指數(shù)×100%

Effect of resistance genes=(DI of variety carrying resistance genes-DI of variety without resistance genes)/DI of variety without resistance genes×100%

圖3 攜帶單個或多個赤霉病抗性基因的小麥品種數(shù)目(A)和抗性基因效應(yīng)(B)

Fig.3 Number of wheat germplasm(A)and effect of resistance genes(B)corresponding to resistance genes

表3 小麥資源的赤霉病抗性QTL統(tǒng)計

3 討 論

隨著氣候和耕作栽培方式的變化，小麥赤霉病逐漸上升為黃淮麥區(qū)的主要病害。黃淮麥區(qū)目前育成和推廣的品種絕大多數(shù)沒有達(dá)到中抗水平，如在黃淮南片區(qū)域進(jìn)行試驗的品種中，中抗品種僅有徐農(nóng)0029、西農(nóng)511和保麥6號，其余品種均為中感或高感品種[20-21]。因此在黃淮麥區(qū)篩選抗赤霉病資源，強化小麥抗病品種選育具有重要的現(xiàn)實意義。

至今為止，位于3B染色體上Fhb1基因是公認(rèn)的用于赤霉病改良的優(yōu)異基因，在小麥抗赤霉病分子標(biāo)記輔助選擇育種中得到了廣泛應(yīng)用[14,22-24]。張 鵬等[25]利用與Fhb1緊密連鎖的SSR標(biāo)記Xgwm493、Xgwm533篩選到含有目標(biāo)基因的品系。張 旭等[26]利用與抗擴展性、抗侵染性和控制低毒素積累的QTL位點緊密連鎖的分子標(biāo)記，檢測到中抗品種寧麥9號擁有抗擴展性主效QTL位點Fhb1和Fhb2。張宏軍等[27]利用Fhb1基因的 KASP 標(biāo)記對攜帶Fhb1基因的寧麥9號等抗性品種與高感品種周麥16矮敗小麥近等基因系構(gòu)建的回交群體進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)回交后代中攜帶Fhb1的家系整體平均病小穗數(shù)低，平均病情指數(shù)低。本研究中，揚富麥101對赤霉病抗性最強，系譜追溯發(fā)現(xiàn)其抗性基因可能來自蘇麥3號和揚麥158。蘇麥3號高抗赤霉病，以其為抗性親本雖然創(chuàng)制了一批抗性較好的材料，但是其農(nóng)藝性狀較差，如植株過高、豐產(chǎn)性差，未能得到大面積使用。揚富麥101攜帶與蘇麥3號相同的抗性基因組合Fhb1+Fhb4，卻沒有蘇麥3號綜合農(nóng)藝性狀不佳的缺陷，可以作為新的抗性親本加以利用。

本研究發(fā)現(xiàn)，攜有Fhb1、Fhb2、Fhb4、Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4、Fhb1+Fhb5、Fhb4+Fhb5抗性基因的小麥品種的病情指數(shù)較不攜帶抗性基因的品種分別降低36.08%、42.07%、20.66%、28.87%、44.73%、1.61%、1.11%，特別是攜有Fhb1及與Fhb1組合的小麥品種(Fhb1+Fhb2、Fhb1+Fhb4)的病情指數(shù)較低，如抗性品種揚富麥101(Fhb1+Fhb4)和中抗品種寧麥13、寧麥資68、淮陰2016J087均攜帶Fhb1基因(表3)，表明Fhb1及其抗性基因組合可以有效提高品種抗性，攜帶該抗性基因的材料可作為抗赤霉病的較好種質(zhì)。

在抗性育種過程中，分子標(biāo)記便于篩選、跟蹤抗性基因，可以大大提高育種效率。小麥赤霉病抗性是受多基因控制的數(shù)量性狀[8-18]，在育種中聚合多個抗性基因，可以較快獲得攜有目標(biāo)基因的育種材料。本研究也發(fā)現(xiàn)，部分分子標(biāo)記陽性的材料抗性水平并不高(表3)，分析可能有以下幾種原因：分子標(biāo)記與抗性基因之間存在一定的遺傳距離，發(fā)生了交換，即篩選僅得到的是標(biāo)記而非基因，可以通過精細(xì)定位克隆相關(guān)抗性基因，選擇與抗性基因共分離的標(biāo)記提高分子標(biāo)記的精度；另一方面相關(guān)材料遺傳背景中可能存在促進(jìn)病害發(fā)生的“感病”基因，基因間的互作，使抗性水平下降。本研究通過單花滴注接種，可以有效提高接種的成功率，但與小麥赤霉病的自然發(fā)生存在差異，不能有效區(qū)分品種間I型抗性的差異，所以在檢測Fhb4、Fhb5基因效應(yīng)時會存在一定的誤差。由于小麥赤霉病抗性是復(fù)雜的數(shù)量性狀，抗性受環(huán)境影響非常大，同時生育期、株高等品種特性也會對抗性產(chǎn)生影響，可以通過控制發(fā)病條件、增加對照和重復(fù)等手段來提高表型鑒定的精度。即使如此，本研究還是利用與抗性QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記檢測到小麥品種的抗性位點，并鑒定出攜有Fhb1和Fhb4基因的小麥抗病品種揚富麥101及攜有單個或多個抗性位點中抗級別小麥品種表明分子標(biāo)記能夠快速鎖定抗性QTL，通過分子標(biāo)記輔助選擇，可以較快獲得攜有目標(biāo)基因的育種材料，大大提高育種效率。