• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    含羞草素對糖尿病大鼠腎臟缺氧損傷及HIF/PHD軸的影響

    2019-11-29 06:00:46李沁蕓李少斌顏曉勇余麗梅楊亦彬
    關(guān)鍵詞:含羞草尿蛋白探針

    湯 蜜,李沁蕓,李少斌,2,顏曉勇,余麗梅,2,楊亦彬,2

    (1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科,貴州 遵義 563099;2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室再生醫(yī)學(xué)科,貴州 遵義 563099)

    近年來大量國內(nèi)外研究強(qiáng)調(diào)了缺氧在慢性腎臟疾病(Chronic kidney disease,CKD)進(jìn)展中的重要性[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)貫穿了糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)發(fā)生發(fā)展的全過程,并認(rèn)為這種狀態(tài)與腎臟微血管病變以及局部新生血管生成密切相關(guān)[3-4]。一般情況下,機(jī)體可通過激活HIF/PHD軸上的缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor,HIF),進(jìn)而激活下游靶基因(血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)等,對缺氧做出適應(yīng)性應(yīng)答。但由于HIF半衰期短,易降解[5],導(dǎo)致機(jī)體對缺氧狀態(tài)下的緩沖儲備能力下降,可能是推進(jìn)DN進(jìn)展的主要原因之一。脯氨酸羥化酶(Proline hydroxylase ,PHD)作為HIF降解反應(yīng)的關(guān)鍵酶,在調(diào)節(jié)HIF/PHD軸的HIF表達(dá)上有重要作用[6]。含羞草素是一種PHD廣泛抑制劑,可通過抑制PHD促進(jìn)HIF表達(dá),改善機(jī)體腎氧平衡。本實(shí)驗(yàn)用含羞草素治療糖尿病大鼠,觀察含羞草素對糖尿病大鼠腎臟缺氧及HIF/PHD軸上的相關(guān)因子(HIF-1α、PHD2、HO-1)表達(dá)的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料 200~240g SD大鼠(由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所提供),3~4月齡;共24只;鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)、含羞草素 (Sigma公司);小鼠抗大鼠HIF-1α單克隆抗體、兔抗大鼠PHD2多克隆抗體(NOVUS 公司);小鼠抗大鼠HO-1單克隆抗體(Abcam 公司);小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(ZSGB-BIO公司);缺氧探針Hypoxyprobe?-1 Kit(HPI公司);RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA引物、擴(kuò)增試劑盒(Sangon Biotech公司);安穩(wěn)血糖儀(Sinocare 公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 造模分組及采樣 本實(shí)驗(yàn)由對照組、糖尿病組以及含羞草素治療組組成。采用腹腔注射STZ(55 mg/kg)模擬糖尿病模型,滿足:連續(xù)3d血糖>16.65 mmol/L、尿量>原尿量150%、尿蛋白排泄量>30 mg/24 h、尿糖強(qiáng)陽性4項(xiàng)即為模型建立成功。對照組則注射同等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。成模8周后,于次日上午9∶00~10∶00經(jīng)腹腔注射含羞草素(50 mg/kg/d,注射劑量為本課題組前期試驗(yàn)得出)作為含羞草素治療組。每組設(shè)12周末、16周末(從注射STZ開始計(jì)算)兩個(gè)觀察時(shí)點(diǎn),每個(gè)時(shí)點(diǎn)每個(gè)組4只大鼠。處死前留取24 h尿,并立即送檢24 h尿蛋白。心尖采血用于血糖檢測,將雙腎切為約3 mm厚的組織片,一部分用于制作石蠟切片;剩余組織裝入1.5 mL E管用于提取RNA;放入-80℃冰箱中長期儲存。

    1.2.2 血糖、尿蛋白 用安穩(wěn)血糖儀檢測各組大鼠血糖,檢驗(yàn)科檢測24 h尿蛋白。

    1.2.3 腎組織常規(guī)病理 腎組織切片經(jīng)10%甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋后,在溫水中展平并用載玻片撈出,晾干后烘箱烤干備用。常規(guī)HE、PAS染色觀察腎臟病理結(jié)構(gòu)。

    1.2.4 腎組織免疫組織化學(xué)染色 取出經(jīng)石蠟包埋后的切片,脫蠟水化,去除內(nèi)源性過氧化物酶,微波爐加熱修復(fù)抗原,山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn),滴加一抗 (抗體稀釋倍數(shù):缺氧探針 1∶100、HIF-1α 1∶100、PHD2 1∶300 、HO-1 1∶100),4℃過夜;滴加二抗, 37℃孵育30 min。PBS沖洗后經(jīng)過顯色、蘇木素復(fù)染、分化、中性樹膠封片后,顯微鏡下觀察,選用全自動圖像分析系統(tǒng) (Image-pro plus 6.0) 測定各組的平均積分光密度值(IOD)。

    1.2.5 Real-Time PCR檢測 冰上提取腎組織總RNA并測定RNA純度及濃度,根據(jù)說明書進(jìn)行20 μL體系的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增,2^(-△△Ct)法分析Ct值并計(jì)算RNA相對表達(dá)量。引物序列:β-actin上游5'- AGCCATGTACGTTAGCCATCC -3',下游5'- C TCTCAGCTGT GGTGGTGAA -3';HIF-1α上游5'-TCAAGTCAGCAACGTGG AAG-3',下游5'-TTCACAAATCA TCACCAAGC-3';HO-1上游5'-C GAAACAAG CAGA ACCC AGT-3',下游5'-TGT GTGGCTGGTGTGTAAGG-3';PHD2上游5'- TGGAGACG GAAGATGTGTGA-3',下游5'- CTTGGGTTCAATG TCAGCAA-3'。

    2 結(jié)果

    2.1 血糖、24 h尿蛋白 與NC組相比,DN組和DL組在兩時(shí)點(diǎn)的血糖、24 h尿蛋白水平均明顯升高(P<0.05)。DL組的血糖較模型組略有升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DL組24 h尿蛋白水平較DN組顯著降低(P<0.05,見表1)。

    時(shí)間血糖(mmol/L)NCDNDL24 h尿蛋白(mg/24 h)NCDNDL12周6.15±3.0235.08±6.92△ 33.57±8.78△ 7.78±2.1247.70±9.63△23.74±7.94△★16周7.98±1.3543.71±4.06△ 50.93±5.31△☆ 7.52±2.4464.22±9.81△☆34.18±8.85△★

    與NC 組比較 ΔP<0.05;與DN 組比較,★P<0.05;與 12周比較,☆P<0.05。

    2.2 腎臟病理 腎臟病理PAS染色顯示NC組的腎臟組織未發(fā)現(xiàn)異常病變。而DN組和DL組均可見不同程度的腎小球增大,系膜基質(zhì)增多、部分腎小管及球囊擴(kuò)張、腎小管上皮細(xì)胞顆粒和空泡變性等病理改變,且DL組的病變相對于DN組有所減輕(見圖1)。

    圖1 大鼠腎組織PAS染色結(jié)果(×400)

    2.3 腎臟缺氧狀況及相關(guān)因子免疫組化

    2.3.1 缺氧探針(HypoxyprobeTM-1) 3組缺氧探針染色均呈陽性,NC組主要集中在髓質(zhì)及皮髓交界,而DN組擴(kuò)大到皮質(zhì)區(qū)。且DN組的陽性著色面積顯著擴(kuò)大(P<0.05),而DL組較DN組顯著縮小(P<0.05,見表2、圖2)。

    時(shí)間NCDNDL12周12.59±0.9727.19±2.33△17.38±1.71△★16周11.30±1.3923.53±1.02△16.18±3.90△

    與NC 組比較,ΔP<0.05;與DN 組比較,★P<0.05。

    2.3.2 HIF-1ɑ、PHD2、HO-1的蛋白及mRNA表達(dá) 3個(gè)指標(biāo)均突出表達(dá)于腎小管。DN組、DL組腎臟HIF-1α、PHD2、HO-1蛋白和mRNA表達(dá)均有不同程度的上調(diào),除DN組16周時(shí)的HO-1蛋白、HIF-1α mRNA以及兩時(shí)點(diǎn)HO-1 mRNA表達(dá)上調(diào)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,其余時(shí)點(diǎn)DN組和DL組的指標(biāo)均顯著高于NC組(P<0.05); DL組兩時(shí)點(diǎn)腎臟HIF-1α、PHD2、HO-1蛋白表達(dá)顯著高于DN組(P<0.05),兩時(shí)點(diǎn)HIF-1α以及16周HO-1 mRNA表達(dá)也顯著高于DN組(P<0.05)(見表3、圖3~6)。

    圖2 大鼠腎組織缺癢探針免疫組比(×400)

    組別HIF-1α蛋白12周16周 PHD2 蛋白12周16周HO-1 蛋白12周16周NC14.21±7.3416.55±7.5224.89±3.8921.97±9.4528.43±8.1326.98±6.46DN88.05±9.07△39.81±6.88△☆89.83±19.98△68.28±20.34△101.60±32.21△49.71±14.45DL127.75±7.02△★ 95.62±12.53△★☆140.84±13.65△★ 121.77±8.37△★145.50±18.25△★129.07±17.85△★ 續(xù)表組別HIF-1α mRNA12周16周PHD2 mRNA12周16周HO-1 mRNA12周16周NC65.74±47.6675.72±32.5466.81±36.8761.83±26.8068.93±35.9065.49±35.02DN135.24±73.58△95.93±29.93200.42±42.28△ 154.35±74.73△120.40±81.9495.01±52.72DL260.20±59.77△★137.00±8.49△★217.11±62.81△191.27±21.34△162.16±31.73168.90±67.84△

    與NC組比較,ΔP<0.05;與DN 組比較,★P<0.05;與12 周比較 ☆P<0.05。

    圖3 大鼠腎組織HIF-1α免疫組比(×400)

    圖4 大鼠PHD2免疫組比(×400)

    圖5 大鼠腎組織HO-1免疫組比(×400)

    圖6 大鼠腎組織β-actin、HIF-1α、PHD2、HO-1的擴(kuò)增、溶解曲線

    3 討論

    近年來,有研究提出“腎組織缺氧是慢性腎臟病(CKD)進(jìn)展到終末期腎病(End-stage renal disease,ESRD)的最終共同途徑”[7]。糖尿病腎病(DN)作為CKD和ESRD最主要的病因,其發(fā)病機(jī)制與腎組織缺氧狀態(tài)也密切相關(guān)[8]。HIF是介導(dǎo)機(jī)體適應(yīng)缺氧最主要的轉(zhuǎn)錄因子,Zhang X等[9]的研究發(fā)現(xiàn)激活HIF能減輕DN中低氧誘導(dǎo)的組織損傷,延緩DN的進(jìn)展。表明HIF可能是DN的潛在治療靶點(diǎn)。

    HIF主要由氧敏感的α亞基和穩(wěn)定表達(dá)的β亞基構(gòu)成。HIF-α家族包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α,其中HIF- 1α是缺氧轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子[10]。在低氧條件下,α亞基(HIF-1α)與β亞基形成具有轉(zhuǎn)錄活性的異二聚體。然后HIF-1α被反式激活并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中以結(jié)合HO-1和VEGF等缺氧反應(yīng)元件(Hypoxia response element,HRE),通過調(diào)控這些基因的表達(dá),維持腎臟血氧平衡[8]。然而在常氧條件下,HIF受到脯氨酸羥化酶(PHD)的調(diào)控,易發(fā)生降解。Bohuslavova R等[11]發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎臟處于低氧狀態(tài)時(shí),HIF不能被充分激活。

    含羞草素是一種從含羞草中提煉出的植物氨基酸,其副作用小,通常作為PHD的抑制劑發(fā)生效應(yīng)[12]。研究表明含羞草素能非選擇性地抑制PHD的所有同種型,使HIF-1a的表達(dá)增加[13]。Schellinger IN等[14]發(fā)現(xiàn)含羞草素可激活CKD大鼠腎臟組織HIF的表達(dá),并能在后期顯著增加VEGF和EPO的表達(dá),通過促進(jìn)新生血管形成對抗缺氧。Müller等[15]發(fā)現(xiàn)在堆積大量糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs)的糖尿病晚期,含羞草素能增加DN大鼠牙髓衍生細(xì)胞的促血管生成能力。鑒于以上研究,本課題組提出含羞草素可能改善糖尿病大鼠腎臟組織缺氧的猜想。

    通過腹腔注射含羞草素干預(yù)糖尿病大鼠,利用缺氧熒光探針法檢測大鼠體內(nèi)的缺氧相關(guān)因子的表達(dá)從而評估各組大鼠腎臟缺氧狀況[16]。發(fā)現(xiàn)DN組和DL組大鼠在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)腎臟組織的缺氧面積均顯著高于NC組(P<0.05),含羞草素治療后顯著減少(P<0.05)。另外,PAS染色結(jié)果顯示:DN大鼠兩時(shí)點(diǎn)的腎臟出現(xiàn)不同程度的腎小球增大、系膜基質(zhì)增多、腎小管擴(kuò)張等病理改變,含羞草素治療后改善。說明糖尿病大鼠腎臟存在缺氧狀態(tài),且含羞草素能一定程度的緩解其缺氧、改善腎組織病理損傷。另外,含羞草素改善腎臟缺氧的同時(shí)(P<0.05),DL組兩時(shí)點(diǎn)腎臟HIF-1α和HO-1的蛋白、mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。由此我們推測含羞草素改善糖尿病大鼠缺氧的作用可能與調(diào)節(jié)HIF-1α下游靶基因HO-1的表達(dá)相關(guān)。Lever等[17]發(fā)現(xiàn)HO-1能減輕DN中由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的血管收縮、腎小球病變以及腎功能降低等損傷,具有腎臟保護(hù)作用。且HO-1的這些作用受到HIF調(diào)控。含羞草素能抑制PHD,上調(diào)HIF-1α的表達(dá),使HIF在機(jī)體缺氧狀態(tài)下被充分激活,HO-1隨之表達(dá)上調(diào),從而發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用[18]。

    然而,含羞草素對HIF-1α的調(diào)節(jié)并不穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)中DL組大鼠HIF-1α的表達(dá)在16周較12周下調(diào),但缺氧現(xiàn)象卻較12周減輕。說明含羞草素雖能緩解腎臟缺氧狀態(tài),但其對HIF的調(diào)節(jié)機(jī)制并不單一[19]。PHD作為HIF降解的關(guān)鍵酶,同時(shí)也是接受低氧調(diào)控的HIF的下游靶基因[20]。盡管PHD在缺氧時(shí)功能低下,但有研究提出即使在缺氧狀態(tài)下,PHD2也能選擇性地促進(jìn)HIF-1α降解[21]。這也解釋了DN組大鼠在氧含量降低時(shí),PHD2的蛋白和mRNA的表達(dá)反而較NC組升高的現(xiàn)象。

    此外,DL組大鼠腎臟的PHD2蛋白和mRNA表達(dá)并未受到抑制,這似乎與含羞草素的作用相矛盾。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在不同的病理生理?xiàng)l件下,不同的PHD亞型調(diào)節(jié)不同的HIF-α亞型且作用強(qiáng)度不同;作為轉(zhuǎn)錄因子,不同的HIF-α亞型也調(diào)控著作用不同甚至功能相反的下游因子的轉(zhuǎn)錄[22]。由此可見,PHD抑制劑通過上調(diào)HIF的表達(dá)從而緩解腎臟缺氧的這一機(jī)制非常復(fù)雜。含羞草素調(diào)控HIF-1α的表達(dá)也可能并非完全通過PHD2這一亞型來完成。另外,HIF雖能有效的改善DN大鼠腎臟缺氧狀態(tài),但HIF的大量激活也會加重腎組織纖維化[23]。結(jié)合本研究16周時(shí)的糖尿病大鼠處于DN的中晚期,使用含羞草素后, HIF-1α被大量激活,促進(jìn)了腎臟組織的纖維化,PHD2在此時(shí)表達(dá)上調(diào)是否歸因于機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng),這需要進(jìn)一步深入研究。

    總之,通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含羞草素可以在一定程度上改善糖尿病大鼠腎臟組織缺氧和病理損傷,且該作用與上調(diào)HIF/PHD軸上的HIF-1α和HO-1的表達(dá)有關(guān)。這為含羞草素用于DN的臨床治療提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

    猜你喜歡
    含羞草尿蛋白探針
    一種病房用24小時(shí)尿蛋白培養(yǎng)收集器的說明
    “登堂入室”鬧笑話
    含羞草
    文苑(2020年4期)2020-05-30 12:35:16
    含羞草為什么害羞?
    含羞草
    尿蛋白(+),警惕妊娠期高血壓疾病
    媽媽寶寶(2017年4期)2017-02-25 07:01:26
    多通道Taqman-探針熒光定量PCR鑒定MRSA方法的建立
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    不同時(shí)段內(nèi)尿蛋白量的變化及其對子癇前期的診斷意義
    透射電子顯微鏡中的掃描探針裝置
    搡老乐熟女国产| 嘟嘟电影网在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 日韩强制内射视频| 久久久久久久午夜电影| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲电影在线观看av| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产成年人精品一区二区| 五月伊人婷婷丁香| 国产真实伦视频高清在线观看| 日本一本二区三区精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| av天堂中文字幕网| 亚洲,欧美,日韩| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 日本av手机在线免费观看| 一级黄片播放器| av一本久久久久| 日韩三级伦理在线观看| videos熟女内射| 国产精品一及| 国产精品综合久久久久久久免费| 成年版毛片免费区| www.av在线官网国产| 国产成人freesex在线| 高清视频免费观看一区二区 | 3wmmmm亚洲av在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 日本午夜av视频| 国产不卡一卡二| 国产一区二区三区av在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲天堂国产精品一区在线| 中文字幕亚洲精品专区| 网址你懂的国产日韩在线| 久久人人爽人人片av| 国产一级毛片在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 最后的刺客免费高清国语| 精品久久久精品久久久| 日日干狠狠操夜夜爽| 2018国产大陆天天弄谢| 26uuu在线亚洲综合色| 亚洲第一区二区三区不卡| 中国美白少妇内射xxxbb| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产在线男女| 午夜视频国产福利| 国产在线男女| 日韩成人伦理影院| 97超碰精品成人国产| 91狼人影院| 欧美激情久久久久久爽电影| h日本视频在线播放| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日本免费在线观看一区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 午夜激情福利司机影院| 精品久久久久久久久av| 亚州av有码| 丰满人妻一区二区三区视频av| 亚洲av.av天堂| 五月玫瑰六月丁香| 日韩av免费高清视频| 久久精品综合一区二区三区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 午夜视频国产福利| 97超碰精品成人国产| 久久久久久久久久久免费av| 全区人妻精品视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 日日摸夜夜添夜夜爱| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 中文资源天堂在线| 2022亚洲国产成人精品| 久久久久久久午夜电影| 国产美女午夜福利| 欧美潮喷喷水| 成人毛片60女人毛片免费| 免费电影在线观看免费观看| 久久午夜福利片| 欧美高清性xxxxhd video| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 黄片无遮挡物在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 美女被艹到高潮喷水动态| 欧美xxⅹ黑人| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 婷婷色综合www| 午夜久久久久精精品| 黄色日韩在线| 精品久久久久久电影网| 亚洲精品影视一区二区三区av| 中文字幕制服av| 大香蕉久久网| 黄片wwwwww| 91久久精品国产一区二区成人| 久久久久久久大尺度免费视频| 一个人看视频在线观看www免费| av播播在线观看一区| av在线天堂中文字幕| 三级毛片av免费| 天堂网av新在线| 精品熟女少妇av免费看| 在线免费观看的www视频| 精品久久久精品久久久| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美三级亚洲精品| 亚洲国产欧美在线一区| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费少妇av软件| 天堂中文最新版在线下载 | 久久精品国产亚洲网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 特级一级黄色大片| 全区人妻精品视频| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲色图av天堂| 国产老妇女一区| h日本视频在线播放| 91狼人影院| 三级经典国产精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久午夜欧美精品| 日日撸夜夜添| 我要看日韩黄色一级片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产在线一区二区三区精| 成年女人在线观看亚洲视频 | 亚洲精品色激情综合| 亚洲四区av| 99久久精品一区二区三区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 99热全是精品| 国产成人freesex在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 嫩草影院入口| 国产 一区 欧美 日韩| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 成人欧美大片| 日韩一本色道免费dvd| 日韩强制内射视频| 国产v大片淫在线免费观看| 国产毛片a区久久久久| 日本wwww免费看| 亚洲精品国产av成人精品| 国产淫语在线视频| 亚洲av中文av极速乱| 听说在线观看完整版免费高清| 成人二区视频| 欧美最新免费一区二区三区| 亚州av有码| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精品一二三| 精品人妻视频免费看| 色播亚洲综合网| 午夜久久久久精精品| 日本黄大片高清| 淫秽高清视频在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产高清有码在线观看视频| 99久久人妻综合| 日本黄大片高清| 国产亚洲最大av| 亚洲成人一二三区av| 网址你懂的国产日韩在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 成人性生交大片免费视频hd| 搞女人的毛片| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲精品日本国产第一区| 午夜视频国产福利| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 天堂网av新在线| 免费高清在线观看视频在线观看| 69人妻影院| 最近最新中文字幕大全电影3| 中文天堂在线官网| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 高清毛片免费看| 国产精品一区二区性色av| 国产视频首页在线观看| 内地一区二区视频在线| 一区二区三区高清视频在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产在线一区二区三区精| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 一级爰片在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 中文在线观看免费www的网站| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲av一区综合| 色尼玛亚洲综合影院| 大话2 男鬼变身卡| 偷拍熟女少妇极品色| 久久久久久久久久久丰满| 中文天堂在线官网| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产高清三级在线| 日本与韩国留学比较| 91精品伊人久久大香线蕉| 天堂网av新在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 午夜视频国产福利| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 在现免费观看毛片| 亚洲性久久影院| 日韩制服骚丝袜av| 久久人人爽人人片av| 波野结衣二区三区在线| 激情五月婷婷亚洲| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品一区二区性色av| 一个人免费在线观看电影| 天堂影院成人在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲国产精品成人综合色| 免费观看精品视频网站| 熟女电影av网| 777米奇影视久久| 免费看av在线观看网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 中文字幕免费在线视频6| 成人毛片60女人毛片免费| 久久久久久伊人网av| 69人妻影院| 国产 一区 欧美 日韩| av在线老鸭窝| 伦理电影大哥的女人| 精品人妻视频免费看| 深爱激情五月婷婷| 亚洲自拍偷在线| 亚洲成色77777| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲av.av天堂| 精品欧美国产一区二区三| 免费观看精品视频网站| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产视频首页在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 草草在线视频免费看| 毛片女人毛片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 日韩一本色道免费dvd| 国产视频首页在线观看| 极品教师在线视频| 亚洲成色77777| 日韩大片免费观看网站| 亚洲精品国产av成人精品| 波多野结衣巨乳人妻| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 搡老乐熟女国产| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲色图av天堂| 国产乱人视频| 久久久精品免费免费高清| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 激情 狠狠 欧美| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲av国产av综合av卡| 爱豆传媒免费全集在线观看| 嫩草影院入口| 丝瓜视频免费看黄片| 成人亚洲精品一区在线观看 | 一个人观看的视频www高清免费观看| 免费看av在线观看网站| 成人午夜精彩视频在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 老司机影院成人| 国产探花在线观看一区二区| 午夜日本视频在线| 六月丁香七月| 乱码一卡2卡4卡精品| 1000部很黄的大片| 午夜激情久久久久久久| 国产av在哪里看| 日韩一区二区三区影片| 色视频www国产| 国产综合懂色| 大陆偷拍与自拍| 美女大奶头视频| 色播亚洲综合网| 美女高潮的动态| 国内精品一区二区在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 丰满乱子伦码专区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 老女人水多毛片| 久久鲁丝午夜福利片| 精华霜和精华液先用哪个| 黑人高潮一二区| 久久久久久久久中文| 人人妻人人看人人澡| 99视频精品全部免费 在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 男女国产视频网站| 99热6这里只有精品| 国产午夜精品论理片| 国产三级在线视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久a久久爽久久v久久| 两个人的视频大全免费| 久久精品综合一区二区三区| 干丝袜人妻中文字幕| 精品酒店卫生间| 色吧在线观看| 国产成人aa在线观看| 亚洲性久久影院| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 毛片女人毛片| 国产激情偷乱视频一区二区| 波野结衣二区三区在线| 又大又黄又爽视频免费| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产一级毛片在线| 免费大片黄手机在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 丰满少妇做爰视频| 老女人水多毛片| 成人毛片a级毛片在线播放| 97在线视频观看| 亚洲人成网站在线播| 人体艺术视频欧美日本| 国产乱人视频| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 国产有黄有色有爽视频| 免费电影在线观看免费观看| 日韩一本色道免费dvd| 97在线视频观看| 国产乱来视频区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品一区www在线观看| 成人综合一区亚洲| 国产真实伦视频高清在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 秋霞伦理黄片| 国产 一区精品| 能在线免费看毛片的网站| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲精品视频女| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产一区有黄有色的免费视频 | 国产不卡一卡二| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 搞女人的毛片| 亚洲自偷自拍三级| 特大巨黑吊av在线直播| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲国产精品成人综合色| 免费av观看视频| 最新中文字幕久久久久| 国产成人aa在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 国产黄片视频在线免费观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产精品99久久久久久久久| 婷婷色综合大香蕉| 日韩亚洲欧美综合| 欧美人与善性xxx| 五月玫瑰六月丁香| 成年免费大片在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 色综合站精品国产| 高清欧美精品videossex| 最近视频中文字幕2019在线8| 日韩 亚洲 欧美在线| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 插逼视频在线观看| 有码 亚洲区| 极品教师在线视频| 亚洲电影在线观看av| 国产综合精华液| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 亚洲av不卡在线观看| .国产精品久久| 亚洲av成人精品一区久久| av在线蜜桃| 国产成人精品婷婷| 三级国产精品片| 亚洲色图av天堂| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲成色77777| 丰满乱子伦码专区| 精品久久久久久久久久久久久| 久久热精品热| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲无线观看免费| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美日韩亚洲高清精品| 一区二区三区高清视频在线| 丰满少妇做爰视频| 欧美一区二区亚洲| 欧美3d第一页| 国产有黄有色有爽视频| 激情 狠狠 欧美| 国产 一区 欧美 日韩| av播播在线观看一区| 久久久久久久久久久丰满| 边亲边吃奶的免费视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 午夜老司机福利剧场| 两个人视频免费观看高清| 亚洲av福利一区| 在线观看av片永久免费下载| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 99久久精品热视频| 欧美一区二区亚洲| 极品教师在线视频| 免费av不卡在线播放| 精品一区二区免费观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 又爽又黄a免费视频| 大陆偷拍与自拍| 久久久成人免费电影| 99久久精品国产国产毛片| 青春草视频在线免费观看| 91久久精品电影网| 日韩强制内射视频| 国产69精品久久久久777片| 国产成人freesex在线| 久久久久久伊人网av| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲性久久影院| 精品久久久久久电影网| 毛片女人毛片| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲综合精品二区| 中文字幕av在线有码专区| 又大又黄又爽视频免费| av女优亚洲男人天堂| 看十八女毛片水多多多| av一本久久久久| 色尼玛亚洲综合影院| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久97久久精品| 精品一区二区三卡| 亚洲美女视频黄频| 在线免费观看不下载黄p国产| 大陆偷拍与自拍| 日本爱情动作片www.在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 一边亲一边摸免费视频| 欧美成人a在线观看| 青春草国产在线视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 久久亚洲国产成人精品v| av在线蜜桃| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩视频在线欧美| 国产亚洲5aaaaa淫片| videossex国产| 国产伦精品一区二区三区四那| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 男女视频在线观看网站免费| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 五月天丁香电影| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲国产av新网站| 亚洲精品第二区| 亚洲av二区三区四区| 国产精品三级大全| 成年av动漫网址| 22中文网久久字幕| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久久久久久亚洲中文字幕| 神马国产精品三级电影在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 午夜免费男女啪啪视频观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 老司机影院成人| 亚洲欧美日韩东京热| 国产男人的电影天堂91| 青春草国产在线视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 青青草视频在线视频观看| 又爽又黄a免费视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 好男人视频免费观看在线| kizo精华| 亚洲精品色激情综合| 国产亚洲一区二区精品| 大话2 男鬼变身卡| 久久午夜福利片| 美女主播在线视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品三级大全| 天堂影院成人在线观看| av播播在线观看一区| 国产在视频线精品| 伦精品一区二区三区| 国产亚洲91精品色在线| 99热这里只有精品一区| 久久久精品94久久精品| 男人狂女人下面高潮的视频| 边亲边吃奶的免费视频| 一本久久精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 高清av免费在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 精品人妻视频免费看| 久久久色成人| 国产精品1区2区在线观看.| 激情 狠狠 欧美| 国产 一区 欧美 日韩| 国产伦精品一区二区三区视频9| 又爽又黄无遮挡网站| av在线蜜桃| 大香蕉97超碰在线| 国产黄片美女视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久久免费精品人妻一区二区| xxx大片免费视频| 国产在线一区二区三区精| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国内精品宾馆在线| 国产精品一区二区在线观看99 | 97在线视频观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 日本色播在线视频| 国产麻豆成人av免费视频| 高清午夜精品一区二区三区| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美日本视频| 一级片'在线观看视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 97超碰精品成人国产| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲天堂国产精品一区在线| 少妇被粗大猛烈的视频| a级毛色黄片| 神马国产精品三级电影在线观看| 一本一本综合久久| 熟女电影av网| 好男人视频免费观看在线| 久久久久久久久久久免费av| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久亚洲国产成人精品v| 精品一区在线观看国产| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲av成人精品一二三区| 晚上一个人看的免费电影| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产精品99久久久久久久久| 麻豆国产97在线/欧美| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲av.av天堂| 欧美高清性xxxxhd video| 91av网一区二区| 97精品久久久久久久久久精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 久久久久久久久大av| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产黄频视频在线观看| 人妻系列 视频| 美女大奶头视频| 一级av片app| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 天堂影院成人在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲av在线观看美女高潮| 日本色播在线视频| 欧美 日韩 精品 国产| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 日本一二三区视频观看| 插逼视频在线观看| 性色avwww在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 成人特级av手机在线观看| 如何舔出高潮| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲精品成人av观看孕妇| www.av在线官网国产| 91久久精品国产一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| av又黄又爽大尺度在线免费看| 在线观看人妻少妇| 久久久久久久久久黄片|