豬丹毒絲菌滅活疫苗免疫佐劑的篩選

陳 章，劉曉露，姚焱彬，吳瓊娟，孫 裴，魏建忠，李東風(fēng)，李 郁，*

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036； 2.安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，安徽 合肥 230001)

豬丹毒(swine erysipelas)是由豬丹毒絲菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)引起的一種熱性、急性人畜共患傳染病，早在20世紀(jì)80年代，該病就與豬瘟、豬肺疫并稱為中國養(yǎng)豬業(yè)的三大傳染病[1]。隨著抗生素、疫苗的使用及規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬丹毒的危害減輕，防控被忽視。近年來，豬丹毒在我國云南、福建、江蘇、安徽等地和加拿大、日本、美國等國家發(fā)病率顯著上升[2-3]，臨床病例從單一感染模式逐漸演變?yōu)閺?fù)雜的繼發(fā)感染和混合感染，豬群的發(fā)病率和死亡率顯著上升[4]。

目前，預(yù)防豬丹毒的方式主要是疫苗免疫接種，豬丹毒商品化疫苗主要包括豬丹毒弱毒疫苗和豬丹毒滅活疫苗。豬丹毒弱毒疫苗存在加重豬群關(guān)節(jié)損傷、毒力返強(qiáng)等風(fēng)險(xiǎn)，免疫效果易受到抗生素和母源抗體的影響，難以對豬丹毒流行菌株形成較好的免疫保護(hù)作用[5]。豬丹毒滅活疫苗安全性優(yōu)于弱毒疫苗，且穩(wěn)定性較強(qiáng)，但存在免疫維持時(shí)間短、免疫效力不足等問題。在豬丹毒滅活疫苗的研制過程中，佐劑類型對疫苗免疫效果影響很大，優(yōu)良的佐劑不僅能夠增強(qiáng)疫苗抗原特異性免疫應(yīng)答的能力，而且能夠促進(jìn)疫苗產(chǎn)生持久的免疫保護(hù)力。本研究擬將5種佐劑(聚合物佐劑、礦物油佐劑ISA 201 VG、蜂膠佐劑、弗氏佐劑、鋁膠佐劑)和3株豬丹毒絲菌株(AEr21、AEr31和AEr32)[6]制備成15種滅活疫苗，經(jīng)物理性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)合格后分別免疫小鼠，檢測小鼠血清中IgG水平和細(xì)胞因子含量(IL-4、IL-10、TNF-β、IFN-γ、MCP-1)，最

后通過腹腔注射和灌胃2種方式對免疫后小鼠進(jìn)行攻毒，計(jì)算免疫保護(hù)率，以期篩選出具有良好免疫應(yīng)答增強(qiáng)效果的佐劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試菌株

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室從臨床病豬分離、鑒定和保存的42株豬丹毒絲菌，血清型均為1a型。分離株經(jīng)小鼠100%致死性試驗(yàn)(攻毒劑量為100 CFU·mL-1)篩選出4株豬丹毒絲菌，確定為強(qiáng)毒菌株；再通過致病力、抗原性、穩(wěn)定性試驗(yàn)，進(jìn)一步篩選出3株制苗用菌株，編號為AEr21、AEr31和AEr32(表1)。

1.1.2 攻毒菌株

攻毒菌株源自臨床急性敗血型病豬，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存，對小鼠的LD50為845 CFU·mL-1(豬丹毒絲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株對小鼠的LD50為50 CFU·mL-1)，編號LA 20130329。

1.1.3 主要試劑

0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)、0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)，紹興天恒生物科技有限公司；MONTANIDE TM GEL 01聚合物佐劑、MONTANIDE TM ISA 201 VG礦物油佐劑，法國賽比克有限公司；蜂膠佐劑，濱州畜牧獸醫(yī)研究所苗立中副研究員饋贈；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，美國SIGMA公司；氫氧化化鋁、氫氧化鈉、吐溫80，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；豬丹毒(疫苗)培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)公司；ELISA檢測細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、MCP-1、TFN-γ、TFN-β)試劑盒，美國RB公司。

表13株豬丹毒絲菌株信息

Table1Information of three seedling strains ofErysipelothrixrhusiopathiae

菌株 Strains分離日期 Date菌株來源 Origin分離部位 Separation發(fā)病階段 StagesLD50/(CFU·mL-1)AEr212013-08-18蚌埠 Bengbu 脾臟 Spleen育肥 Fattening50.3AEr312014-06-20六安 Luan腦部 Brain育肥 Fattening35.5AEr322014-07-09廣德 Guangde肺臟 Lung保育 Nursery10.9

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雌性昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 滅活疫苗的制備

將3株受試菌株(AEr21、AEr31、AEr32)培養(yǎng)至穩(wěn)定期，用終濃度為0.2%的甲醛滅活，分別確定豬丹毒絲菌滅活全菌體編號為V-AEr21、V-AEr31和V-AEr32。將滅活菌株分別與礦物油佐劑ISA 201 VG(質(zhì)量比1∶1)、弗氏佐劑(體積比1∶1)、聚合物佐劑(滅活菌株質(zhì)量的15%)、鋁膠佐劑(體積比4∶1)、蜂膠佐劑(滅活菌株質(zhì)量的2‰)均勻混合處理后，制得15種豬丹毒絲菌滅活疫苗。經(jīng)物理性狀檢驗(yàn)、無菌性檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)合格后，免疫小鼠。

1.3 免疫小鼠

將320只雌性昆明小鼠隨機(jī)分組，每組20只，共16組，包括陰性對照組(20只)和疫苗免疫組(300只)，具體分組見表2。免疫途徑為皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為每只小鼠0.2 mL(1.5×1010CFU·mL-1)。一免14 d后進(jìn)行第2次免疫，2次免疫的劑量及途徑均相同。

表2 小鼠分組及免疫情況

Table2Immunization of mice grouping

組別Group滅活全菌體Bacterial strain佐劑類型Adjuvant typeA1V-AEr21礦物油佐劑 ISA 201VGA2V-AEr21弗氏佐劑 Freunds adjuvant A3V-AEr21聚合物佐劑 polymer adjuvantA4V-AEr21鋁膠佐劑 aluminum gel adjuvantA5V-AEr21蜂膠佐劑 propolis adjuvantB1V-AEr31礦物油佐劑 ISA 201VGB2V-AEr31弗氏佐劑 Freunds adjuvant B3V-AEr31聚合物佐劑 polymer adjuvantB4V-AEr31鋁膠佐劑 aluminum gel adjuvantB5V-AEr31蜂膠佐劑 propolis adjuvantC1V-AEr32礦物油佐劑 ISA 201VGC2V-AEr32弗氏佐劑 Freunds adjuvant C3V-AEr32聚合物佐劑 polymer adjuvantC4V-AEr32鋁膠佐劑 aluminum gel adjuvantC5V-AEr32蜂膠佐劑 propolis adjuvantNC生理鹽水Normal saline

1.4 血清IgG抗體水平及細(xì)胞因子含量檢測

一免及二免14 d后，各組小鼠眼球靜脈叢采血，每組10只。參照文獻(xiàn)[7]的方法測定小鼠血清中IgG抗體水平，依據(jù)細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1)檢測試劑盒說明書，測定小鼠血清中細(xì)胞因子含量。

1.5 免疫保護(hù)率測定

二免14 d后，將各試驗(yàn)組剩余的10只小鼠平均分成2組，分別采用灌胃和腹腔注射方式攻毒小鼠，攻毒菌株為LA 20130329，攻毒劑量為100 LD50，陰性對照組注射等量PBS，測定各組的免疫保護(hù)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅活疫苗質(zhì)量檢驗(yàn)

油乳佐劑滅活疫苗均顯示為乳白色，3 000 r·min-1離心10 min，無漏乳、破乳現(xiàn)象出現(xiàn)。礦物油佐劑ISA 201 VG滅活疫苗屬于水包油包水劑型，置于冷水中先凝聚不擴(kuò)散，之后開始慢慢散開；弗氏佐劑滅活疫苗屬于油乳劑型，置于冷水中，無擴(kuò)散現(xiàn)象出現(xiàn)；礦物油佐劑ISA 201 VG和弗氏佐劑滅活疫苗分別形成液滴狀需要3 s和4 s，符合油乳佐劑滅活疫苗的制備要求。待檢疫苗在營養(yǎng)瓊脂、TSA-YE及鮮血培養(yǎng)基中均無細(xì)菌生長，符合豬丹毒絲菌滅活疫苗的無菌要求。待檢疫苗接種小鼠后均無明顯不良反應(yīng)，符合豬丹毒絲菌滅活疫苗的安全要求。

2.2 血清IgG抗體檢測

2.2.1 V-AEr21疫苗免疫后小鼠血清IgG抗體水平

如表3所示，礦物油佐劑ISA 201VG疫苗免疫組在一免及二免14 d后血清中IgG抗體水平最高。一免14 d后，礦物油佐劑ISA 201 VG疫苗免疫組IgG抗體水平與蜂膠佐劑、鋁膠佐劑、弗氏佐劑疫苗免疫組差異顯著(P<0.05)；二免14 d后，礦物油佐劑ISA 201 VG疫苗免疫組IgG抗體水平與鋁膠佐劑、弗氏佐劑疫苗免疫組差異顯著(P<0.05)。研究結(jié)果表明，礦物油佐劑ISA 201 VG與V-AEr21制備的豬丹毒絲菌滅活疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG抗體水平優(yōu)于其他佐劑。

表3 小鼠血清IgG抗體檢測

Table3IgG antibody test results in mouse serum

組別Group一免P/N值P/N value of thefirst immunization二免P/N值P/N value of thesecond immunizationA12.945±0.996 a5.065±0.694 aA21.210±0.136 b2.515±0.163 bA32.475±1.512 ab4.523±0.470 aA41.548±0.174 b3.470±0.383 bA51.105±0.058 b4.770±0.616 a

同列數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

The values in the same column followed by different letters showed significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2.2 V-AEr31疫苗免疫后小鼠血清IgG抗體水平

如表4所示，礦物油佐劑ISA 201 VG疫苗免疫組在一免及二免14 d血清中IgG抗體水平最高。一免14 d后，礦物油佐劑ISA 201VG疫苗免疫組IgG抗體水平與蜂膠佐劑、鋁膠佐劑、弗氏佐劑疫苗免疫組差異顯著(P<0.05)；二免14 d后，礦物油佐劑ISA 201 VG疫苗免疫組IgG抗體水平與其他4組疫苗免疫組差異均顯著(P<0.05)。研究結(jié)果表明，礦物油佐劑ISA 201 VG與V-AEr31制備的豬丹毒絲菌滅活疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG抗體水平優(yōu)于其他佐劑。

2.2.3 V-AEr32疫苗免疫后小鼠血清IgG抗體水平

如表5所示，礦物油佐劑ISA 201VG疫苗免疫組在一免及二免14 d后血清中IgG抗體水平最高。一免14 d后，礦物油佐劑ISA 201VG疫苗免疫組IgG抗體水平與其他4組疫苗免疫組差異顯著(P<0.05)；二免14 d后，礦物油佐劑ISA 201 VG 疫苗免疫組IgG抗體水平與蜂膠佐劑、鋁膠佐劑、弗氏佐劑疫苗免疫組差異顯著(P<0.05)。研究結(jié)果表明，礦物油佐劑ISA 201 VG與V-AEr32制備的豬丹毒絲菌滅活疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG抗體水平優(yōu)于其他佐劑。

表4 小鼠血清IgG抗體檢測

Table4IgG antibody test results in mouse serum

組別Group一免P/N值P/N value of thefirst immunization二免P/N值P/N value of thesecond immunizationB12.575±0.108 a6.018±0.326 aB21.289±0.257 b1.805±0.160 cB32.155±0.155 ab3.750±0.188 bB41.333±0.543 b3.808±0.450 bB51.850±0.034 b3.318±0.126 b

表5 小鼠血清IgG抗體檢測

Table5IgG antibody test results in mouse serum

組別Group一免P/N值P/N value of thefirst immunization二免P/N值P/N value of thesecond immunizationC13.863±0.170 a5.653±0.130 aC21.408±0.205 c2.483±0.233 bC32.495±0.462 b5.135±0.920 aC41.848±0.197 b3.663±0.285 bC51.043±0.054 c3.293±0.280 b

2.3 血清細(xì)胞因子檢測

2.3.1 V-AEr21疫苗免疫后小鼠血清細(xì)胞因子水平

如圖1所示，各疫苗免疫組小鼠血清中細(xì)胞因子水平顯 著高于陰性對照組(P<0.05)。礦物油佐劑ISA 201 VG和蜂膠佐劑疫苗免疫組的MCP-1、TNF-β水平顯著高于鋁膠佐劑和弗氏佐劑疫苗免疫組(P<0.05)，與其他疫苗免疫組之間差異不顯著(P>0.05)。礦物油佐劑ISA 201 VG和蜂膠佐劑與V-AEr21制備的豬丹毒絲菌滅活疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平優(yōu)于其他佐劑。

2.3.2 V-AEr31疫苗免疫后小鼠血清細(xì)胞因子水平

如圖2所示，各疫苗免疫組小鼠血清中細(xì)胞因子水平顯著高于陰性對照組(P<0.05)。礦物油佐劑ISA 201 VG疫苗免疫組的小鼠血清中MCP-1、IL-4和TNF-β水平顯著高于鋁膠佐劑和弗氏佐劑疫苗免疫組(P<0.05)，與其他疫苗免疫組之間差異不顯著(P>0.05)。礦物油佐劑ISA 201 VG和蜂膠佐劑與V-AEr31制備的豬丹毒絲菌滅活疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平優(yōu)于其他佐劑。

2.3.3 V-AEr32疫苗免疫后小鼠血清細(xì)胞因子水平

如圖3所示，蜂膠佐劑、礦物油佐劑ISA 201VG疫苗免疫組小鼠血清中MCP-1、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β水平顯著高于鋁膠佐劑和弗氏佐劑疫苗免疫組(P<0.05)，與其他疫苗免疫組差異不顯著(P>0.05)。礦物油佐劑ISA 201VG和蜂膠佐劑與V-AEr32制備的豬丹毒絲菌滅活疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平優(yōu)于其他佐劑。

圖1 V-AEr21疫苗免疫后小鼠血清細(xì)胞因子含量Fig.1 Determination of cytokine level in mice immunized with V-AEr21 vaccine

圖2 V-AEr31疫苗免疫后小鼠血清細(xì)胞因子含量Fig.2 Determination of cytokine level in mice immunized with V-AEr31 vaccine

2.4 免疫保護(hù)率測定結(jié)果

2.4.1 V-AEr21疫苗對小鼠的免疫保護(hù)率

如表6所示，以灌胃方式攻毒小鼠后，蜂膠佐劑和礦物油佐劑ISA 201 VG疫苗免疫組的免疫保護(hù)率最高，均為100%；以腹腔注射攻毒小鼠后，礦物油佐劑ISA 201 VG疫苗免疫組的免疫保護(hù)率最高，為80%。礦物油佐劑ISA 201 VG和V-AEr21制備的豬丹毒絲菌滅活疫苗對小鼠的免疫保護(hù)力優(yōu)于其他佐劑。

2.4.2 V-AEr31疫苗對小鼠的免疫保護(hù)率

如表7所示，以灌胃和腹腔注射方式分別攻毒小鼠，礦物油佐劑ISA 201 VG疫苗免疫組的免疫保護(hù)率最高，分別為100%和80%。礦物油佐劑ISA 201 VG和V-AEr31制備的豬丹毒絲菌滅活疫苗對小鼠的免疫保護(hù)力優(yōu)于其他佐劑。

2.4.3 V-AEr32疫苗對小鼠的免疫保護(hù)率

圖3 V-AEr32疫苗免疫后小鼠血清細(xì)胞因子含量Fig.3 Determination of cytokine level in mice immunized with V-AEr32 vaccine

表6V-AEr21疫苗對小鼠的免疫保護(hù)率

Table6Determination of immune protection rate of V-AEr21vaccine in mice

組別Group感染數(shù)Number ofinfection感染途徑Route ofinfection接種劑量Inoculatingdose死亡數(shù)Number ofdeath死亡率Rate ofdeath/%保護(hù)率Rate ofprotection/%A15灌胃 Gavage100 LD50001005腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5012080A25灌胃 Gavage100 LD50240605腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5048020A35灌胃 Gavage100 LD50120805腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060A45灌胃 Gavage100 LD50120805腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060A55灌胃 Gavage100 LD50001005腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060

如表8所示，以灌胃和腹腔注射方式分別攻毒小鼠，蜂膠佐劑、鋁膠佐劑和礦物油佐劑ISA 201 VG疫苗免疫組的免疫保護(hù)率均最高，分別為80%和60%。蜂膠佐劑、鋁膠佐劑、礦物油佐劑ISA 201 VG和V-AEr32制備的豬丹毒絲菌滅活疫苗對小鼠的免疫保護(hù)力優(yōu)于其他佐劑。

3 討論

豬丹毒是一種老病新發(fā)的急性、熱性傳染病，近些年來在我國江西、安徽、江蘇、云南和廣州等地檢出率明顯增多，在日本、加拿大、美國等國家也相繼出現(xiàn)報(bào)道[8]。根據(jù)臨床病例的調(diào)查情況，豬丹毒感染已經(jīng)從單一感染模式逐漸演變?yōu)閺?fù)雜的繼發(fā)感染和混合感染，豬群的發(fā)病率和死亡率明顯上升[4]。急性豬丹毒感染具有病死率高、發(fā)病周期短等特點(diǎn)，應(yīng)用抗生素治療會導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性、藥物殘留及藥物副作用等問題[9]，疫苗免疫是臨床上防控豬丹毒的首選方法。

評估疫苗候選抗原的重要指標(biāo)是該抗原是否能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答及產(chǎn)生免疫應(yīng)答的類型[10]。Th細(xì)胞是一類重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，根據(jù)其分泌細(xì)胞因子和功能的不同可分為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-β和IL-2等，主要增強(qiáng)細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-4和IL-10等，主要增強(qiáng)體液免疫[11]。本試驗(yàn)中，各佐劑疫苗免疫組較對照組均有明顯的免疫應(yīng)答反應(yīng)，其中蜂膠佐劑和礦物油佐劑ISA201VG疫苗免疫組在二次免疫后刺激誘導(dǎo)小鼠分化產(chǎn)生的Th1和Th2細(xì)胞水平最高，與弗氏佐劑及鋁膠佐劑疫苗免疫組差異顯著(P<0.05)，表明蜂膠佐劑和礦物油佐劑ISA 201 VG疫苗免疫組誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫最強(qiáng)。評價(jià)疫苗免疫效果的重要指標(biāo)之一就是該疫苗能否刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答。IgG是介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的主要抗體，而良好的佐劑不僅能使宿主體內(nèi)產(chǎn)生的IgM完全轉(zhuǎn)化為IgG，更有助于增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答能力。本試驗(yàn)中，礦物油佐劑ISA 201 VG疫苗免疫組在二次免疫后產(chǎn)生的IgG抗體水平均最高，表明礦物油佐劑ISA 201 VG相較于其他4種佐劑可刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)。

表7V-AEr31疫苗對小鼠的免疫保護(hù)率

Table7Determination of immune protection rate of V-AEr31vaccine in mice

組別Group感染數(shù)Number ofinfection感染途徑Route ofinfection接種劑量Inoculatingdose死亡數(shù)Number ofdeath死亡率Rate ofdeath/%保護(hù)率Rate ofprotection/%B15灌胃 Gavage100 LD50001005腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5012080B25灌胃 Gavage100 LD50240605腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5036040B35灌胃 Gavage100 LD50240605腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5036040B45灌胃 Gavage100 LD50360405腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5036040B55灌胃 Gavage100 LD50120805腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060

表8V-AEr32疫苗對小鼠的免疫保護(hù)率

Table8Determination of immune protection rate of V-AEr32 vaccine in mice

組別Group感染數(shù)Number ofinfection感染途徑Route ofinfection接種劑量Inoculatingdose死亡數(shù)Number ofdeath死亡率Rate ofdeath/%保護(hù)率Rate ofprotection/%C15灌胃 Gavage100 LD50120805腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060C25灌胃 Gavage100 LD50360405腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5036040C35灌胃 Gavage100 LD50240605腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5036040C45灌胃 Gavage100 LD50120805腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060C55灌胃 Gavage100 LD50120805腹腔注射 Intraperitoneal injection100 LD5024060

良好的佐劑不僅可以增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，還能促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生持久的免疫保護(hù)[12]。蜂膠佐劑、鋁膠佐劑、弗氏佐劑、白油佐劑等是當(dāng)前市售的主要獸用疫苗佐劑，但由于各種佐劑的作用機(jī)理存在較大差異，理化性質(zhì)也各有不同，這使得制備的滅活疫苗免疫機(jī)體后所延長抗體的持續(xù)時(shí)間和產(chǎn)生的免疫效果參差不齊[13]。近幾年來，有很多關(guān)于動(dòng)物疫苗佐劑的研究，國內(nèi)外也有針對我國傳統(tǒng)白油佐劑和鋁膠佐劑的免疫效果遜于進(jìn)口佐劑的報(bào)道[14-15]。目前我國細(xì)菌性疫苗佐劑主要以白油佐劑和鋁膠佐劑為主，已無法滿足新型細(xì)菌性疫苗的市場需求[16]。本研究在篩選豬丹毒絲菌滅活疫苗免疫佐劑的過程中，不僅選用傳統(tǒng)的蜂膠佐劑、弗氏佐劑和鋁膠佐劑，同時(shí)還引入了由法國賽比克公司生產(chǎn)的新型聚合物佐劑和礦物油佐劑ISA 201 VG作為候選佐劑。有研究表明，礦物油佐劑ISA 201 VG可明顯改善口蹄疫滅活疫苗的免疫效果[17]。豬丹毒絲菌主要經(jīng)由損傷皮膚黏膜和消化道誘發(fā)感染，本研究用LD50為845 CFU·mL-1的強(qiáng)毒株LA 20130329(1a型)分別以腹腔注射和模擬自然感染的灌胃2種方式進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示，礦物油佐劑ISA 201 VG與V-AEr21、V-AEr31、V-AEr32制備的滅活疫苗對小鼠的免疫保護(hù)率均最高，分別為100%、100%、80%和80%、80%、60%，表明礦物油佐劑ISA 201VG滅活疫苗相較于其他4種佐劑滅活疫苗能夠提供最佳的免疫保護(hù)。

油乳佐劑是一類由油類物質(zhì)和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑。油乳佐劑疫苗的免疫效力高低直接與乳化作用的好壞和乳劑成分的質(zhì)量等相關(guān)。油包水型(W/O)乳劑較黏稠，在機(jī)體內(nèi)不易分散，但佐劑活性較好；水包油型(O/W)乳劑較稀薄，注入機(jī)體后易于分散，但佐劑活性很低；而雙相油乳劑(W/O/W)則兼具了上述2種乳劑的優(yōu)點(diǎn)，制成的雙相油乳劑疫苗黏稠度低、在注射部位易分散、局部反應(yīng)輕微及佐劑效應(yīng)良好等特點(diǎn)[18]。本研究中礦物油佐劑ISA 201 VG為雙相油乳劑(W/O/W)型，將其與V-AEr21、V-AEr31和V-AEr32等3株豬丹毒絲菌滅活全菌體制備成滅活疫苗，對免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答、體液免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)力方面均顯示了良好的佐劑效應(yīng)。

本研究將礦物油佐劑ISA 201 VG與V-AEr21、V-AEr31和V-AEr32制備的滅活疫苗免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG抗體、細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、MCP-1、TNF-β、IFN-γ)水平和對強(qiáng)毒株的免疫保護(hù)力方面均明顯優(yōu)于其他佐劑，可作為制備豬丹毒絲菌滅活疫苗的候選免疫佐劑。