浙茄類型茄子品種DNA指紋圖譜構(gòu)建

魏慶鎮(zhèn)，王五宏，胡天華，胡海嬌，汪精磊，包崇來

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

茄子(SolanommelongenaL.，2n=24)是茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)的一種蔬菜作物，具有重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值和保健作用[1]。茄子具有十分豐富的生物多樣性和廣泛的地理分布，在生長習(xí)性、抗病抗逆、果實(shí)形狀和顏色上存在較大變異[1-3]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，2017年全世界茄子產(chǎn)量為5 230.9萬t，而中國的產(chǎn)量達(dá)到3 290.8萬t，占全世界產(chǎn)量的62.9%，我國已成為茄子世界第一生產(chǎn)國和主要出口國。茄子栽培種因區(qū)域消費(fèi)習(xí)慣的不同，差異較大，但是相同區(qū)域內(nèi)茄子品種卻非常相近[4-5]；浙江省主要栽培紫紅線茄，茄子紫紅色，細(xì)長，一般30 cm左右，橫徑2.5～3.5 cm，近年來涌現(xiàn)出一系列浙茄品種，如浙茄1號(hào)、浙茄3號(hào)、浙茄8號(hào)、杭豐、杭茄2010等[6-9]，浙茄系列品種形態(tài)學(xué)性狀非常相似，從性狀上統(tǒng)計(jì)鑒定有一定難度，而且形態(tài)學(xué)性狀容易受環(huán)境影響，在種子市場上同名異物及同物異名的情況經(jīng)常發(fā)生，給育種單位和育種人員造成重要的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)不同的品種進(jìn)行快速準(zhǔn)確地鑒定，不僅可以辨別品種的真假，同時(shí)對(duì)解決產(chǎn)權(quán)糾紛具有重要意義。

DNA指紋圖譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于作物的品種資源多樣性和純度鑒定研究中[10-13]。1986年，Jeffreys發(fā)明了DNA指紋圖譜技術(shù)(DNA-fingerprinting)，成為品種和品系鑒別的重要方法，且具有高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。近幾十年，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)成為鑒定品種的重要手段，用于DNA指紋圖譜的標(biāo)記類型也在不斷更新，從傳統(tǒng)的限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)標(biāo)記，發(fā)展到簡單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeat，SSR)，最新應(yīng)用較多的是單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(single nucleotide polymorphism，SNP)。SSR標(biāo)記已在許多作物指紋圖譜構(gòu)建中得到應(yīng)用，宋海斌等[14]利用SSR引物對(duì)不同甜瓜品種組合進(jìn)行了指紋圖譜構(gòu)建；董志剛等[15]利用15對(duì)SSR引物區(qū)分了16份葡萄品種與親本。此外，SSR標(biāo)記也在獼猴桃、柑橘、玉米等作物上得到應(yīng)用[16-18]。傳統(tǒng)標(biāo)記具有多態(tài)性低，對(duì)變異反應(yīng)較敏感等缺點(diǎn)，SNP標(biāo)記作為第三代分子標(biāo)記，具有數(shù)量多、分布廣泛、二態(tài)性、很容易進(jìn)行高通量檢測的優(yōu)點(diǎn)。目前，SNP標(biāo)記是國際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟分子測試指南中構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的推薦標(biāo)記之一[8]，王大莉[19]通過對(duì)功能基因SNP進(jìn)行分析，構(gòu)建了22個(gè)香菇栽培種的SNP指紋圖譜；張昆鵬[20]利用SSR標(biāo)記和SNP標(biāo)記分別構(gòu)建了油菜品種的指紋圖譜并做了比較，發(fā)現(xiàn)SNP標(biāo)記的結(jié)果更可靠；李志遠(yuǎn)等[11]開發(fā)篩選獲得甘藍(lán)50個(gè)核心SNP標(biāo)記，并利用這些標(biāo)記構(gòu)建了甘藍(lán)主要品種的指紋圖譜，SNP標(biāo)記已經(jīng)在指紋圖譜構(gòu)建中凸顯出越來越重要的地位。競爭性等位基因特異性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)是一種新型高通量SNP分型方法，該方法成本低、準(zhǔn)確度高，更具SNP位點(diǎn)適用性，已經(jīng)在水稻、小麥、大豆等作物中得到廣泛應(yīng)用[21-23]。

目前，茄子還未見開發(fā)標(biāo)記并用于構(gòu)建指紋圖譜的報(bào)道，本研究利用北京農(nóng)林科學(xué)院前期開發(fā)的48個(gè)核心SNP標(biāo)記，利用KASP技術(shù)對(duì)46份茄子材料進(jìn)行基因分型，根據(jù)標(biāo)記分型結(jié)果、多態(tài)性信息含量篩選獲得34個(gè)核心SNP標(biāo)記，并用于浙茄系列品種的指紋圖譜構(gòu)建，為浙茄品種真實(shí)性、特異性鑒定提供重要依據(jù)，為品種保護(hù)提供了重要的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料是浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茄子研究室收集，包含3份野生自交系材料，37份自交系材料，6份雜種F1。各材料于2018年11月播種，穴盤育苗后，移栽到小號(hào)營養(yǎng)缽中，于2019年4月定植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院喬司實(shí)驗(yàn)基地大棚溫室，株距20 cm，行距80 cm。利用所有材料對(duì)48個(gè)SNP標(biāo)記進(jìn)行分型，篩選核心標(biāo)記后，對(duì)品種進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建。

1.2 DNA提取

取茄子幼嫩葉片直接放入2.0 mL離心管中，用液氮速凍，然后利用DNAsecure試劑盒提取DNA，提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶明亮單一無污染，利用Nanodrop2100檢測D260/D280，在1.8～2.0(DNA樣品沒有蛋白污染)；D260/D230在1.8～2.0(DNA樣品鹽離子濃度低)；270 nm沒有明顯的光吸收(DNA樣品沒有酚污染)。根據(jù)英國LGC公司的KASP檢測技術(shù)和基因組大小換算出DNA用量為每樣品10～20 ng，稀釋DNA濃度成為10～20 ng·μL-1備用。

1.3 KASP標(biāo)記開發(fā)

1.3.1 引物的合成和引物預(yù)混液的配制

SNP標(biāo)記由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供，標(biāo)記是利用茄子參考基因組數(shù)據(jù)開發(fā)，經(jīng)過篩選后獲得的48個(gè)核心標(biāo)記。SNP引物由北京生工生物工程有限公司合成，每組引物中的引物A1的序列的5′端加上接頭序列：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，引物A2的序列的5′端加上接頭序列：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，引物C的序列不用改變。分別將各組SNP引物中的引物鏈均稀釋成10 μmol·L-1，并按照體積比為12∶12∶30(引物A1∶引物A2∶引物C)的比例混勻，分別得到引物預(yù)混液。

1.3.2 基因分型

利用KASP技術(shù)對(duì)46份茄子進(jìn)行SNP基因分型，SNP基因分型過程按照LGC公司提供的KASP技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行，試驗(yàn)涉及的試劑、耗材和儀器均由LGC公司提供，整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟和試劑用法用量均按照LGC公司的操作指南KASP user guideand manual(www.lgcgenomics.com)進(jìn)行。具體步驟如下：首先利用K-pette分液工作站將稀釋好的待測DNA模板(4～10 ng·μL-1)1.5 μL和空白對(duì)照(no template control，NTC)分別加入反應(yīng)板孔中，60 ℃烘干30 min(干燥箱，LGC公司)，DNA變成干粉備用。然后在Kraken操作系統(tǒng)下利用Meridian加樣工作站分別向每個(gè)反應(yīng)孔中加入1×Master mix與引物混合液，Mix分裝完畢立即將微孔板依次放在Kube熱封儀和Fusion激光封膜儀上封膜，利用Hydrocyler進(jìn)行高通量水浴PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)在高通量水浴系統(tǒng)Hydrocycler中進(jìn)行，具體程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性，15 min；94 ℃，20 s(變性)，61 ℃-55 ℃，1 min(復(fù)性和延伸：以touch down 程序擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，每循環(huán)降低0.6 ℃)；94 ℃，20 s(變性)，55 ℃，60 s繼續(xù)擴(kuò)增26個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，利用BMG PHERAstar儀器檢測熒光信號(hào)并查看分型情況。若分型不充分，則繼續(xù)擴(kuò)增，每3個(gè)循環(huán)查看分型情況，直至分型完全，從Kraken軟件中導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)分型結(jié)果，利用Excel 2010計(jì)算每個(gè)標(biāo)記的等位基因頻率，并計(jì)算各標(biāo)記的多態(tài)性信息含量，計(jì)算公式為PIC=1-∑fi2，其中fi為i位點(diǎn)基因頻率。根據(jù)SNP標(biāo)記的二態(tài)性特點(diǎn)，將分型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為二元編碼數(shù)據(jù)，其中按照茄子品種名稱順序，首次出現(xiàn)的純合基因型記為(1 0)，雜合基因型記為(1 1)，另一種純合基因型記為(0 1)，構(gòu)建6個(gè)浙茄品種的指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP標(biāo)記的基因分型

在所有標(biāo)記基因分型結(jié)果中，將所有46種茄子全部成功分型的標(biāo)記有9個(gè)，有11個(gè)標(biāo)記在45種茄子材料中成功分型，圖1為SNP分型結(jié)果示意圖。但有部分標(biāo)記分型結(jié)果較差，例如標(biāo)記SmSNP007在8個(gè)材料上未成功分型，其次是標(biāo)記SmSNP031，有6個(gè)材料未成功分型，有9個(gè)標(biāo)記在超過3個(gè)材料上未成功分型；有6個(gè)標(biāo)記SmSNP021、SmSNP024、SmSNP168、SmSNP186、SmSNP201、SmSNP217均不能在3個(gè)野生材料上獲得明確的分型結(jié)果，標(biāo)記SmSNP045、SmSNP089、SmSNP091、SmSNP112、SmSNP173均只能成功分型1個(gè)野生材料，推測這些標(biāo)記對(duì)野生材料的分型的概率比較小，不能應(yīng)用于野生茄子材料的基因分型。

每個(gè)圓點(diǎn)代表一份測試材料；a.標(biāo)記SmSNP011分型：紅色圓點(diǎn)，A∶A；綠色圓點(diǎn)，A∶T；藍(lán)色圓點(diǎn)，T∶T。b.標(biāo)記SmSNP196分型：紅色圓點(diǎn)，C∶C；綠色圓點(diǎn)，C∶T；藍(lán)色圓點(diǎn)，T∶T；粉色圓點(diǎn)，未成功分型。Each dot represented a test material. a. SmSNP011 genotyping: red dots， A∶A; Green dots， A∶T; Blue dots， T∶T; b. SmSNP196 genotyping: Red dots， C∶C; Green dots， C∶T; Blue dots， T∶T; Pink dots， the ungenotyped.圖1 SNP標(biāo)記分型示意圖Fig.1 Genotying graph of the SNP marker

2.2 SNP標(biāo)記的多態(tài)性及雜合比例

多態(tài)性信息含量(PIC)是衡量標(biāo)記質(zhì)量的重要指標(biāo)。48個(gè)標(biāo)記在46份材料中PIC值最小為0.139，最高為0.500，其中小于0.35的有5個(gè)標(biāo)記，有30個(gè)標(biāo)記PIC值為0.45～0.50，占到所有標(biāo)記的62.5%，沒有標(biāo)記的PIC值為0.30～0.35(圖2)。根據(jù)將PIC值的分布，將小于0.35的標(biāo)記剔除，PIC值大于0.35的標(biāo)記用于后續(xù)指紋圖譜的構(gòu)建。

根據(jù)標(biāo)記分型結(jié)果，我們計(jì)算了雜合基因型的比例，其中，雜合基因型比例小于5%的有3個(gè)標(biāo)記，大部分標(biāo)記的雜合基因型的比例為10%～15%，其中標(biāo)記SmSNP045雜合位點(diǎn)比例高達(dá)72%，只有G∶A和G∶G兩種基因型，雜合位點(diǎn)比例較高，不利于后續(xù)指紋圖譜的構(gòu)建，我們將此標(biāo)記剔除。

2.3 核心SNP標(biāo)記篩選

根據(jù)標(biāo)記在46份材料上的基因分型結(jié)果和PIC值，挑選基因分型數(shù)據(jù)缺失少于3個(gè)，PIC值大于0.35的SNP標(biāo)記作為核心標(biāo)記，用于后續(xù)6份浙茄材料指紋圖譜構(gòu)建的核心標(biāo)記，因?yàn)榍炎訁⒖蓟蚪M是scaffold版本，并不能明確標(biāo)記在染色體上的位置，所以并不能根據(jù)標(biāo)記的位置分布來篩選標(biāo)記。綜上，一共剔除了14個(gè)SNP標(biāo)記，剩余34個(gè)標(biāo)記用于后續(xù)指紋圖譜構(gòu)建(表1)。

圖2 SNP標(biāo)記多態(tài)性信息含量分布情況Fig.2 Distribution of polymorphism information of SNP markers

圖3 三十四個(gè)標(biāo)記在46種茄子中的雜合基因型比例Fig.3 Heterozygous genotype ratio of 46 eggplant varieties based on 34 SNPs

2.4 茄子材料的聚類分析

根據(jù)34個(gè)標(biāo)記的分型結(jié)果，利用NTSYS軟件對(duì)46份茄子材料進(jìn)行聚類分析(圖4)。結(jié)果表明，編號(hào)1、2、3的野生茄子聚類到一起，其中2和3更為相似；編號(hào)43(浙茄8號(hào))和編號(hào)44(杭豐1號(hào))更為接近，與編號(hào)29聚類為1個(gè)分支；編號(hào)27和編號(hào)45(杭茄2010)以及編號(hào)19更為接近，整體上這6個(gè)茄子與編號(hào)25更為接近；編號(hào)42(浙茄3號(hào))和編號(hào)46(浙茄10號(hào))相近，它們與編號(hào)41(引茄1號(hào))以及編號(hào)26歸為一個(gè)分支，這與我們浙茄系列品種的親本來源及品種特性相一致，；同時(shí)，浙茄類型6個(gè)品種均在一個(gè)大的亞類內(nèi)，同屬一個(gè)類型。

圖4 四十六個(gè)茄子品種的SNP聚類分析圖Fig.4 Clustering analysis dendrogram based on SNP for 46 eggplant varieties

表1 四十六個(gè)SNP標(biāo)記信息

Table1The information of 46 SNP markers

標(biāo)記名稱序列信息多態(tài)性信雜合位點(diǎn)比例未分型數(shù)目MarkernameSequence息含量PIC valueHeterozygousgenotype ratioNumber ofungenotypedSmSNP001TCATTGTACTAGCCG[A/T]ATTATTGAAGTTCT0.474 0.273 2SmSNP002CAACACATTAGTAAC[C/T]GGAATAACATTCAT0.491 0.261 0SmSNP003TTTCCCAATGCTATA[A/G]ATGATTTTTCAATC0.369 0.133 1SmSNP004TGATAGTGAGCAAAC[C/A]AGGGTGTTGTTGAC0.464 0.156 1SmSNP005AGGATTAAATGTTGG[C/T]CATGCGAACTCATT0.466 0.217 0SmSNP006CACACAATTGGAAGA[A/G]CAACATGTGAATCA0.485 0.217 0SmSNP007TTGTGAATTAGATTT[T/C]TTATTGATTTACTA0.487 0.243 8SmSNP011ATTATTTGGAGGAAC[T/A]AATGAGGAGAATGG0.491 0.130 0SmSNP012TGTATTGACTATTCT[T/A]ATCTGTTCTGCAGC0.496 0.261 0SmSNP013CAGTGGATTAATGGT[C/G]TGCTTAAAATCAGT0.429 0.267 1SmSNP016TGCCGCGATACCTCT[G/A]CATTTTTACTTTTG0.499 0.130 0SmSNP021TTGCAACTTGTAACT[A/G]TATGATTGAAGCAT0.369 0.209 3SmSNP024TGACTCTAAAGAATT[T/C]ATTAAAAGTTATCC0.363 0.143 4SmSNP027ATCAAGTAACCTGTC[G/A]TTCTTCTCGTTCAG0.415 0.109 0SmSNP030TACAATGAAACAATG[G/T]GAATAGACAAGAAA0.499 0.209 3SmSNP031CTCACAAAATTTCAA[C/T]CCAATTACATTATT0.139 0.100 6SmSNP035TCTGACTAGCGACTA[G/A]TATCATATCCAGAC0.438 0.162 1SmSNP038AGAGATTGAGAGAAC[G/T]CTTCAATCTGCGTT0.425 0.205 2SmSNP042ACTAAATGCAGAGGG[C/T]AAATTAGAGAAGAA0.498 0.222 1SmSNP045GTTTGCATTTGGATT[A/G]ATTTGGAGAATGTT0.461 0.721 3SmSNP055AATCAAGACTCAATC[C/T]CGACCACTTTCTTT0.416 0.136 2SmSNP062CAAATCGCCATAGAC[G/A]ATAACAGGAGCATT0.358 0.156 1SmSNP078TGCGTTGATGAATAA[C/T]GAGTAAGAGATTTT0.473 0.116 3SmSNP089AGTTAATTTATACAT[A/G]TATCCTAGATATAA0.499 0.256 3SmSNP091GCATTCAAGATGACA[T/C]CTAAATAAAATAAA0.500 0.159 2SmSNP094AATTAGGTGGAGAAA[A/G]GAGGACCATACAAT0.483 0.116 3SmSNP097ACCAACAGAAGGTGA[A/G]AATAATCAGTGGAT0.500 0.214 4SmSNP105ACAATCACATACTAC[T/C]ACCTCTCAAAGTCC0.500 0.093 2SmSNP107TGTCAAGTGACACTA[T/C]TTTGTCGAAAAAAA0.449 0.182 2SmSNP112TGTAAGTGGATCCGA[C/T]AAATTATCCTTTGA0.497 0.146 5SmSNP114AATAATGGGTTCGCT[T/C]GTTCAAAATCCCAG0.500 0.119 4SmSNP119ATCAGAGGCGGCAAG[C/T]ATAGCCACTGTTGC0.494 0.152 0SmSNP128TGGGTGCCACTTATT[T/C]CAACATTCTTTGAA0.198 0.044 1SmSNP135GCCATGGCTTCCGGT[G/A]TGTCGTCTGCTGCC0.463 0.045 2SmSNP140GTTTTGAGCCTTCTG[G/T]TTATAGAACATTTA0.442 0.068 2SmSNP142TTGGAGCAGTTCAGC[G/A]CCAAAGTTATGCTT0.500 0.089 1SmSNP146CGAGCCATGTGATTT[G/A]TCTCTGTGATGACC0.247 0.067 1SmSNP151TTATTATTCTAGCTA[T/A]GGAAGGTTTAAATC0.463 0.091 2SmSNP161ACCAGCATGATAAAG[C/T]AAAACCAAATCTAA0.298 0.091 2SmSNP168CCTCGCGGTGCTGTG[A/G]AATCTTCCAGAGAC0.476 0.195 4SmSNP173CTCAAAGTGAATGTC[T/C]TAGCATTACATATT0.487 0.140 3SmSNP186TCATATTCGCACTTA[C/T]ATTAGGATTATCAA0.404 0.122 5SmSNP196GCAAAAAGTTAGTCA[T/C]CAGTAACATGGCAA0.480 0.267 1SmSNP201TTGATTACAAGAAAT[C/T]TATATGATGCACTA0.476 0.098 5SmSNP205TTATTCAACTTGTTC[G/A]TATAGTTCTACTCC0.396 0.152 0SmSNP206AGAAGATAAGATGCA[C/T]ACAATTCATGTCTA0.278 0.022 1SmSNP216AGTTTTAGAAAAAAA[C/A]ATGTTCTTCAGGTT0.494 0.114 2SmSNP217AGCGAAATCTATATA[C/A]AGGAACTGAACAGT0.499 0.163 3

帶陰影標(biāo)記的是篩選后剔除的標(biāo)記。

The shaded markers were those markers removed after screening.

2.5 主要品種指紋圖譜構(gòu)建

利用最終篩選的34個(gè)SNP位點(diǎn)用以構(gòu)建主要茄子品種的指紋圖譜，將6個(gè)茄子品種SNP分型轉(zhuǎn)化為二元編碼數(shù)據(jù)，得到浙茄品種的指紋圖譜。34個(gè)標(biāo)記中，有13個(gè)標(biāo)記在6種茄子品種基因分型一致，占到38.2%，有7個(gè)標(biāo)記在6種茄子品種只有兩種基因分型，14個(gè)標(biāo)記均出現(xiàn)了3種基因分型，各品種間差異位點(diǎn)數(shù)均≥ 2，因此，利用該 DNA 指紋圖譜可對(duì)6個(gè)茄子品種進(jìn)行快速有效區(qū)分(表2)。

表2 六個(gè)浙茄類型茄子的指紋圖譜

Table2SNP-DNA Finger-printing database of 6 eggplant varieties from Zhejiang Province

品種VarietySmSNP001SmSNP002SmSNP003SmSNP004SmSNP005SmSNP006SmSNP011SmSNP012SmSNP013SmSNP016SmSNP021SmSNP027SmSNP030SmSNP035SmSNP038SmSNP042SmSNP055引茄1號(hào)1 01 11 11 11 11 11 01 11 01 01 11 01 01 01 11 01 1Yinqie No.1浙茄3號(hào)1 11 01 11 11 01 11 01 11 01 01 11 01 01 01 11 11 1Zheqie No.3浙茄8號(hào)1 00 11 11 10 11 01 01 01 01 01 01 00 11 11 00 11 0Zheqie No.8杭豐1號(hào)1 00 11 11 11 11 11 11 01 01 01 01 01 10 11 01 11 0Hangfeng No.1杭茄20101 00 11 11 11 00 11 00 11 01 01 01 01 00 11 00 11 0Hangqie 2010浙茄10號(hào)1 01 11 11 11 00 11 00 11 01 01 11 01 00 11 11 11 1Zheqie No.10品種VarietySmSNP062SmSNP078SmSNP089SmSNP091SmSNP094SmSNP105SmSNP107SmSNP119SmSNP135SmSNP140SmSNP142SmSNP151SmSNP173SmSNP196SmSNP205SmSNP216SmSNP217引茄1號(hào)1 01 01 11 11 11 11 11 01 01 01 01 01 11 01 01 01 1Yinqie No.1浙茄3號(hào)1 01 01 11 01 01 11 01 01 01 01 01 01 01 11 11 01 1Zheqie No.3浙茄8號(hào)1 01 01 01 10 11 11 11 01 01 01 01 00 11 11 11 01 0Zheqie No.8杭豐1號(hào)1 01 01 00 10 11 11 11 01 01 01 01 00 11 11 11 01 1Hangfeng No.1杭茄20101 01 00 10 11 01 11 01 01 01 01 01 00 10 10 11 00 1Hangqie 2010浙茄10號(hào)1 01 01 11 11 01 11 01 01 01 01 11 01 11 11 11 00 1zheqie No.10

3 結(jié)論與討論

雖然不同地域茄子品種差異很大，但是同一地區(qū)的茄子品種很難從形態(tài)學(xué)性狀方面準(zhǔn)確區(qū)分；浙茄系列品種均屬于紅茄線茄類型，在長度、橫徑、顏色方面差異很小，再加上茄子品種在銷售過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)同物異名的現(xiàn)象，使得品種鑒定保護(hù)成為重要的一環(huán)。

SSR標(biāo)記已在多種作物指紋圖譜構(gòu)建中得到應(yīng)用，但是隨著標(biāo)記檢測成本的降低，SNP標(biāo)記逐步用于指紋圖譜的構(gòu)建中。目前，相對(duì)于SSR標(biāo)記，高通量大樣本的SNP標(biāo)記檢測已顯現(xiàn)出優(yōu)勢；李志遠(yuǎn)等[11]利用開發(fā)的2.54×106個(gè)SNP標(biāo)記，成功篩選出50個(gè)核心SNP標(biāo)記，構(gòu)建了59個(gè)甘藍(lán)品種的指紋圖譜；顧炳朝等[13]采用芯片技術(shù)開發(fā)SNP，構(gòu)建了鎮(zhèn)油6號(hào)的指紋圖譜，并發(fā)現(xiàn)SNP標(biāo)記指紋圖譜所含差異位點(diǎn)信息較多，比SSR標(biāo)記圖譜更好，同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)SNP標(biāo)記構(gòu)建的指紋圖譜具有數(shù)量多、分布廣泛、高通量的優(yōu)點(diǎn)[24]。目前，SNP檢測及分型的方法有很多種，例如基于凝膠電泳檢測的等位基因特異性PCR[25]、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列法[26]、DNA芯片技術(shù)[27]和KASP技術(shù)[28]等。張昆鵬等[20]利用DNA 芯片技術(shù)檢測SNP，構(gòu)建了油菜的指紋圖譜；Tian等[29]利用DNA芯片技術(shù)構(gòu)建了玉米的指紋圖譜構(gòu)；趙勇等[23]采用測序法、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列法和KASP法對(duì)大豆Dt1基因的4個(gè)SNP進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)KASP法是大豆快速、高效的SNP分型方法。相對(duì)于其他SNP檢測方法，KASP 技術(shù)具有靈活、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，優(yōu)勢明顯，被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。今后隨著品種數(shù)量的增多、品種指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的進(jìn)一步豐富，高通量的SNP檢測技術(shù)在新育成品種的真實(shí)性、特異性鑒定方面將具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

本研究利用了北京農(nóng)林科學(xué)院開發(fā)的48個(gè)核心SNP標(biāo)記，利用KASP技術(shù)，經(jīng)過46份茄子材料的再次篩選，最終獲得34個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記，并利用這些核心標(biāo)記構(gòu)建了浙茄類型6個(gè)品種的指紋圖譜，通過指紋圖譜有效地區(qū)分6個(gè)品種類型的茄子，對(duì)浙茄類型的品種鑒定保護(hù)起到了積極作用，有助于茄子種子市場的監(jiān)管監(jiān)督。浙茄類型品種豐富，遠(yuǎn)不止6個(gè)品種，從長遠(yuǎn)考慮應(yīng)當(dāng)對(duì)不同類型的茄子品種材料和育種親本進(jìn)行重測序，結(jié)合參考基因組數(shù)據(jù)，開發(fā)大量SNP標(biāo)記，然后結(jié)合分型結(jié)果、PIC值、在染色體上的分布等情況篩選更多的核心標(biāo)記用于指紋圖譜的構(gòu)建。同時(shí)，由于全國范圍內(nèi)各省市茄子的差異，應(yīng)當(dāng)搜集更多的不同類型茄子資源材料、品種、育種親本等，開發(fā)更多核心SNP標(biāo)記且通用于不同類型的茄子，構(gòu)建更加全面的茄子指紋圖譜，以此來快速鑒別鑒定茄子品種，提高種子市場規(guī)范。

致謝：感謝北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心在SNP標(biāo)記開發(fā)和分型方面提供的幫助，感謝李志遠(yuǎn)博士在指紋圖譜構(gòu)建方面提供的幫助。