子宮腺肌病中微血管密度與VEGF和VEGFR2的關(guān)系

王 珺，彭學(xué)勤，龔 芫，申 璇，丁婭妮，茍飛飛，劉祉君，黃 平，李東林

(1.貴州省人民醫(yī)院 婦科，貴州 貴陽 550002；2.貴州省人民醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽 550002)

子宮腺肌病是婦科常見疾病，多發(fā)生于30～50歲，以經(jīng)量增多、子宮增大伴進(jìn)行性痛經(jīng)加重為主要臨床表現(xiàn)，子宮腺肌病雖為良性疾病，卻具有無限生長、浸潤并破壞周圍組織的特性。新生血管形成是異位子宮內(nèi)膜組織浸潤性生長的關(guān)鍵，血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)通過影響子宮肌層毛細(xì)血管通透性及新生血管形成，增加子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移、增殖。有學(xué)者觀察到子宮內(nèi)膜中，腺肌病內(nèi)膜-肌層界面處VEGF的表達(dá)高于遠(yuǎn)肌層[1]。研究觀察到抑制VEGF生成后病灶中微血管的生成受阻[2]。也發(fā)現(xiàn)拮抗血管內(nèi)皮生長因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)后病灶中微血管形成受到抑制[3]。有研究報道子宮腺肌病異位子宮內(nèi)膜組織中VEGF和FLK1的表達(dá)增強，但未對MVD(Microvessel density, MVD)與VEGF、FLK1的相關(guān)性作進(jìn)一步的深入研究[4]。本研究通過免疫組織化學(xué)法觀察子宮腺肌病病灶中及在位子宮內(nèi)膜中VEGF、VEGFR2和MVD的表達(dá)情況，了解子宮腺肌病中MVD與VEGF 、VEGFR2的相關(guān)性，為進(jìn)一步揭示子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 標(biāo)本取自2016年9月至2019年5月在貴州省人民醫(yī)院婦科因子宮腺肌病行手術(shù)治療的子宮標(biāo)本，取子宮腺肌病灶及增生期子宮內(nèi)膜?；颊吣挲g39～47歲，平均年齡(43.12±4.37)歲，近6月內(nèi)未服用任何藥物，既往月經(jīng)規(guī)律，未放置宮內(nèi)節(jié)育器。子宮腺肌病組標(biāo)本(40例)：取自因子宮腺肌病切除子宮的病灶組織；子宮腺肌病在位內(nèi)膜標(biāo)本取自同一患者子宮腺肌病病灶相鄰部位的子宮內(nèi)膜；對照組標(biāo)本(30例)：取自行診斷性刮宮術(shù)患者的子宮內(nèi)膜，且經(jīng)病理證實該子宮內(nèi)膜無病理性改變者。

1.2 實驗方法 將福爾馬林固定石蠟包埋的組織制備成4 μm切片，枸櫞酸鹽緩沖液中以微波高溫行抗原修復(fù)，采用免疫組化技術(shù)Envision二步法，使用抗VEGF、VEGFR2和CD34鼠抗人多克隆抗體和Envision試劑盒說明書進(jìn)行操作。效應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色顆粒被判定為結(jié)果陽性，分布于細(xì)胞膜和/或胞漿。組織學(xué)評分如下[5]：(1)陽性細(xì)胞百分率：陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<5%，記為0分；5%～35%細(xì)胞顯色記為1分；36%～65%細(xì)胞顯色記為2分；細(xì)胞顯色>66%，記為3分。(2)顯色深淺：不顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分。將二者評分相加除以2，作為該切片的最終評分，將0、0.5～1和1.5～3分分別定為陰性(-)、陽性(+)和強陽性(++)。用宮頸癌組織作為陽性對照，每組均用PBS代替一抗作陰性對照。CD34在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中被標(biāo)記為棕黃色顆粒，先在低倍視野下觀察每張切片選擇3個微血管密度大的區(qū)域換高倍鏡(×200)計數(shù)，取平均值計作MVD。

2 結(jié)果

2.1 子宮腺肌病病灶和腺肌病在位內(nèi)膜中微血管密度情況 CD34染色觀察到血管上皮細(xì)胞膜染色呈棕黃色，MVD在子宮腺肌病組中明顯高于腺肌病在位內(nèi)膜組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0167)。MVD在腺肌病在位內(nèi)膜組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.0167，見表1)。

組別例數(shù)MVDFP子宮腺肌病 4082.23±1.315.560.012?腺肌病在位內(nèi)膜 4063.11±1.215.410.194??對照 3055.42±1.432.350.015???

*：子宮腺肌病組與腺肌病在位內(nèi)膜組比較；**：腺肌病在位內(nèi)膜組與對照組比較；***：子宮腺肌病組與對照組比較。

2.2 子宮腺肌病病灶和腺肌病在位內(nèi)膜中VEGF的表達(dá)情況 VEGF蛋白表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體上皮細(xì)胞的胞漿中，呈棕黃色。VEGF在子宮腺肌病組、腺肌病在位內(nèi)膜組和對照組中的陽性表達(dá)率為100%，其中++陽性率分別為97.5%、40.0%和30.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；VEGF++陽性率在子宮腺肌病組中明顯高于腺肌病在位內(nèi)膜組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0167)，VEGF++陽性率在子宮腺肌病在位內(nèi)膜組與對照組中表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.0167，見表2)。

表2子宮腺肌病病灶和腺肌病在位子宮內(nèi)膜中VEGF的表達(dá)情況

組別例數(shù)-+++χ2P子宮腺肌病 4001396.6710.013?腺肌病在位內(nèi)膜 40024162.1340.142??對照3002199.9460.002???

*：子宮腺肌病組與腺肌病在位內(nèi)膜組比較；**：腺肌病在位內(nèi)膜組與對照組比較；***：子宮腺肌病組與對照組比較。

2.3 子宮腺肌病組和腺肌病在位內(nèi)膜組中VEGFR2表達(dá)情況 VEGFR2蛋白顯色呈棕黃色，主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜及血管壁肌細(xì)胞的胞漿中。VEGFR2在子宮腺肌病組、腺肌病在位內(nèi)膜組和對照組中的陽性表達(dá)率分別為100%、87.5%和76.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；VEGFR2在腺肌病在位內(nèi)膜組與對照組之間無明顯差異(P>0.0167)；其中VEGFR2++陽性率分別為95.0%、77.5%和26.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。VEGFR2++陽性率在子宮腺肌病病灶中表達(dá)明顯高于腺肌病在位內(nèi)膜組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0167，見表3)。

表3子宮腺肌病病灶和腺肌病在位內(nèi)膜中VEGFR2表達(dá)情況

組別例數(shù)-+++χ2P子宮腺肌病 4002388.1320.011?腺肌病在位內(nèi)膜 4054313.3470.115??對照 3071586.1590.016???

*：子宮腺肌病組與腺肌病在位內(nèi)膜組比較；**：腺肌病在位內(nèi)膜組與對照組比較；***：子宮腺肌病組與對照組比較。

2.4 子宮腺肌病病灶中MVD與VEGF和VEGFR2相互關(guān)系 在子宮腺肌病病灶中，隨著VEGF表達(dá)強度的增加，微血管密度明顯增加，Spearman等級相關(guān)分析表明，MVD與VEGF表達(dá)有顯著相關(guān)性(r=0.72,P=0.012)；隨著VEGFR2 表達(dá)增加，MVD也隨著增加，MVD與VEGFR2表達(dá)有顯著相關(guān)性(r=0.63，P=0.016)。

3 討論

子宮腺肌病是婦科常見疾病，子宮腺肌病的發(fā)生和發(fā)展與子宮內(nèi)異位病灶中微血管形成密切相關(guān)，新生血管形成是異位子宮內(nèi)膜成活生長的關(guān)鍵。VEGF通過影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移而誘導(dǎo)新生血管的形成。本研究觀察到VEGF在子宮腺肌病組、腺肌病在位內(nèi)膜組和對照組各組組織中陽性表達(dá)率為100%，但++陽性率在子宮腺肌病組中比較高為97.5%，在對照組中最低為30%。VEGFR2主要存在于微血管內(nèi)皮胞，在子宮內(nèi)膜異位病灶中存在VEGFR2受體過表達(dá)的狀態(tài)[6]，當(dāng)子宮腺肌病病灶中子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞分泌VEGF進(jìn)入病灶周圍肌層內(nèi)與微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR2受體結(jié)合進(jìn)而誘導(dǎo)新生血管形成，促進(jìn)病灶進(jìn)一步彌漫性侵襲生長。本研究觀察到VEGFR2在子宮腺肌病組、腺肌病在位內(nèi)膜組和對照組中的陽性表達(dá)率分別為100%、87.5%和76.7%，其中++陽性率分別為95.0%、77.5%和26.7%，顯示VEGFR2與子宮腺肌病有關(guān)。近來發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥易感位點在4q12 rs17773813[G]，其編碼產(chǎn)物為VEGFR2上游信號因子，該位點突變與子宮內(nèi)膜異位癥嚴(yán)重程度相關(guān)，揭示VEGF-VEGFR2通路在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制中的重要作用[7]。在分析MVD與VEGF、VEGFR2的相互關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，子宮腺肌病病灶中MVD明顯高于腺肌病在位內(nèi)膜和對照組子宮內(nèi)膜中微血管密度，在子宮腺肌病病灶中隨著VEGF表達(dá)強度的增加MVD明顯增加，隨著VEGFR2 表達(dá)增加MVD也隨著增加，MVD與VEGF、VEGFR2表達(dá)呈正相關(guān)性。子宮腺肌病病灶中異位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞VEGF表達(dá)顯著增強，對子宮組織中微血管生成活性增加，與子宮腺肌病病灶的進(jìn)展密切相關(guān)，提示微血管形成在子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，抗血管生成可能是控制病灶生長和延緩病情進(jìn)展的重要方向。