Th17/Treg細(xì)胞平衡與感染性早產(chǎn)的關(guān)系研究

曹 琦，陳 蕾，李 穎，胡 瓊，董生鳳

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 產(chǎn)科，天津 西青 300380；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 產(chǎn)科，貴州 遵義 563099)

早產(chǎn)(Preterm birth,PTB)指妊娠滿28周至不滿37周的分娩[1]。全世界上的發(fā)生率約為5%至18%，這是一種常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥并且有增加趨勢(shì)[2]。因此，對(duì)感染性早產(chǎn)的防治越來(lái)越受到大家的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，孕婦體內(nèi)的免疫細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，構(gòu)建成母胎界面(蛻膜和子宮組織)復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，維持著母胎免疫平衡[3]。輔助性T細(xì)胞17(T helper 17 cells,Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)是CD4+T免疫細(xì)胞群中重要的細(xì)胞亞群，Th17是強(qiáng)有力的致炎細(xì)胞，與其所分泌的炎性細(xì)胞因子共同參與炎性疾病的發(fā)生[2]。Treg細(xì)胞在妊娠時(shí)可抑制母體對(duì)胎兒的免疫殺傷反應(yīng)，而維持著妊娠的發(fā)生發(fā)展。本研究對(duì)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在感染性早產(chǎn)孕婦外周血中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，目的在于探討其作為早期預(yù)測(cè)感染性早產(chǎn)發(fā)生新指標(biāo)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)取材 收集2017年12月至2018年12月遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院40例早產(chǎn)(28～36+6周)患者的外周血。這些早產(chǎn)患者產(chǎn)前均無(wú)干預(yù)措施，年齡、孕前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。根據(jù)胎盤(pán)病檢結(jié)果再分為早產(chǎn)感染組(24例)和早產(chǎn)非感染組(16例)。20名正常足月入院的孕婦作為足月待產(chǎn)組，均除外妊娠期合并癥及并發(fā)癥。收集上述3組孕婦靜脈血5 mL，肝素抗凝。本研究所有操作均符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)，并經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)及患者本人同意。

1.1.2 主要試劑 PE-抗人IL-17A單克隆抗體、FITC-抗人CD4單克隆抗體、APC-抗人CD25單克隆抗體、APC-抗人CD3單克隆抗體、FITC-抗人CD8a單克隆抗體、PE-抗人FoxP3單克隆抗體、PE-鼠lgG1同型對(duì)照均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；Transcription Fsctor Buffer Set購(gòu)自美國(guó)BD公司；PMA+Ionomycin淋巴細(xì)胞刺激物、BFA工作液、RPMI1640培養(yǎng)基等。

1.2 方法

1.2.1 白細(xì)胞懸液制備 取1mL全血于試管中加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，震蕩搖勻，4℃放置15 min，待細(xì)胞裂解。1 500 rpm，離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞。向白細(xì)胞沉淀中加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，1 500 rpm，離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞。用360 μL PBS重懸細(xì)胞。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞 吸取300 μL全血與同體積RPMI1640培養(yǎng)基，放置于24孔板中。在標(biāo)本中加入刺激劑和阻斷劑，混勻細(xì)胞。放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)刺激4～6 h。流式上樣管中分別加入5 μL CD3-APC單克隆抗體、5 μL CD8a-FITC單克隆抗體，吸取200 μL培養(yǎng)好的樣本加入流式管中，4℃避光孵育30 min，之后用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入破膜劑，再次室溫避光孵育40～50 min，1 500 rpm，4℃離心6 min，棄上清。重懸細(xì)胞后加入5 μL IL-17A-PE單克隆抗體進(jìn)行充分混勻，并設(shè)立對(duì)照管，4℃避光孵育40～50 min。用PBS洗滌2次后，加入1%多聚甲醛400 μL固定細(xì)胞，于4℃避光保存24 h，F(xiàn)ACS calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞所占的百分比。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞 吸取之前制備的白細(xì)胞懸液100 μL加入流式上樣管中，分別加入5μL CD4-FITC單克隆抗體、5μL CD25-APC單克隆抗體，渦旋震蕩細(xì)胞，4℃避光孵育30 min。加入2 mL PBS清洗細(xì)胞1次，1 000 rpm，離心5 min，棄上清。加入破膜劑，再次室溫避光孵育40～50 min，1 500 rpm，4℃離心6 min，棄上清。重懸細(xì)胞后加入5 μL PE anti-Human Foxp3單克隆抗體進(jìn)行充分混勻，并設(shè)立對(duì)照管，4℃避光孵育40～50 min。用PBS洗滌2次后，加入1%多聚甲醛400μL固定細(xì)胞，避光4℃保存24 h，F(xiàn)ACS calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞所占的百分比。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 早產(chǎn)感染組、早產(chǎn)非感染組、足月待產(chǎn)組的年齡、孕次比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但3組孕周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，用Pearson簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)分析孕周與外周血中Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性，結(jié)果提示無(wú)相關(guān)(P>0.05)，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，詳見(jiàn)表1。

表13組孕周與外周血Treg、Th17細(xì)胞的相關(guān)性

臨床指標(biāo)早產(chǎn)感染組孕周rP早產(chǎn)非感染組孕周rP足月待產(chǎn)組孕周rPTreg0.0120.978-0.1670.7520.0940.811Th17-0.3570.345-0.4630.3550.040.926

2.2 Th17、Treg細(xì)胞在外周血中的表達(dá) 早產(chǎn)感染組中Th17細(xì)胞陽(yáng)性率明顯高于早產(chǎn)非感染組、足月待產(chǎn)組(P<0.01)；Treg細(xì)胞陽(yáng)性率明顯低于早產(chǎn)非感染組、足月待產(chǎn)組(P<0.01)；早產(chǎn)非感染組和足月待產(chǎn)組中Th17、Treg細(xì)胞陽(yáng)性率無(wú)顯著差異(P>0.05，見(jiàn)表2、圖1～2)。

組別例數(shù)Th17陽(yáng)性率(%)Treg陽(yáng)性率(%)早產(chǎn)感染240.640±0.063?#0.048±0.014?#早產(chǎn)非感染160.350±0.0490.634±0.136足月待產(chǎn)200.340±0.0980.670±0.109

與早產(chǎn)非感染組相比，*：P<0.05；與足月待產(chǎn)組相比，#：P<0.05。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞陽(yáng)性率

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞中Treg細(xì)胞陽(yáng)性率

3 討論

在所有不同類(lèi)型早產(chǎn)中，感染性早產(chǎn)的發(fā)生率居于首位，其病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制不明，是圍產(chǎn)兒患病、死亡的重要原因，給家庭及社會(huì)帶來(lái)巨大的心理、社會(huì)負(fù)擔(dān)[4]。明確感染性早產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制，針對(duì)其發(fā)病機(jī)制尋找有效的實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)指標(biāo)，便于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，對(duì)降低感染性早產(chǎn)的發(fā)生，具有重要的臨床意義。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群，越來(lái)越多的證據(jù)表明Th17、Treg細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞和調(diào)節(jié)細(xì)胞參與妊娠的建立和維持，其失衡可能導(dǎo)致妊娠失敗[5]。

Th17細(xì)胞作為新發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)細(xì)胞參與妊娠的建立和維持[6]。然而，尚未見(jiàn)報(bào)道其對(duì)感染性早產(chǎn)的預(yù)測(cè)作用。本研究中，早產(chǎn)感染組外周血中Th17細(xì)胞陽(yáng)性率表達(dá)升高，表明Th17細(xì)胞在感染性早產(chǎn)孕婦體內(nèi)高表達(dá)，對(duì)妊娠過(guò)程中的免疫平衡起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。促進(jìn)中性粒細(xì)胞動(dòng)員、募集、激活，巨噬細(xì)胞吞噬病原體等活動(dòng)一直被認(rèn)為是Th17細(xì)胞發(fā)揮促炎作用的主要機(jī)制[7]。因而，造成感染性早產(chǎn)的免疫機(jī)制可能是：機(jī)體被細(xì)菌、病毒等病原體攻擊后，Th17細(xì)胞刺激體內(nèi)免疫細(xì)胞啟動(dòng)免疫應(yīng)答，導(dǎo)致體內(nèi)Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡向Th17細(xì)胞方向移動(dòng)，機(jī)體內(nèi)Th17細(xì)胞陽(yáng)性率增加，促使炎性細(xì)胞因子IL-17A表達(dá)增多并直接作用于白介素-17受體A(Interleukin‐17 receptor A，IL-17RA)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等增殖和成熟，并將其募集到感染部位，通過(guò)這些細(xì)胞的活化及相關(guān)炎性介質(zhì)釋放后形成的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)(Inflammatory cascade)，介導(dǎo)外源性細(xì)菌感染及促炎作用，提前發(fā)動(dòng)分娩[8-9]。

在本研究中，感染性早產(chǎn)組Treg細(xì)胞的陽(yáng)性率顯著低于其它兩組，說(shuō)明Treg細(xì)胞在感染性早產(chǎn)孕婦體內(nèi)表達(dá)降低，對(duì)妊娠過(guò)程中的免疫平衡起積極正調(diào)節(jié)作用，有利于妊娠維持。其原因可能是：正常妊娠期間，Treg細(xì)胞被募集到母胎界面，調(diào)節(jié)局部抗炎微環(huán)境，幫助在母體與胎兒之間形成免疫耐受，維持妊娠的發(fā)展[10]。當(dāng)有微生物侵襲并形成炎癥時(shí)，炎性介質(zhì)刺激免疫細(xì)胞分化成Th17細(xì)胞，使得Treg細(xì)胞在免疫細(xì)胞中比例降低，細(xì)胞外環(huán)境中的抗炎細(xì)胞因子表達(dá)降低[11]。一方面使Treg細(xì)胞不能發(fā)揮針對(duì)胎兒和母體間免疫排斥的高效免疫抑制功能；另一方面，沒(méi)有足夠的抗炎因子來(lái)抑制Th17細(xì)胞的增殖和分化，無(wú)法有效地抑制促炎細(xì)胞因子IL-17A等的表達(dá)。Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子將胎兒視為異體移植物或外來(lái)病原體發(fā)動(dòng)免疫攻擊，這種自身免疫過(guò)度，可導(dǎo)致感染性早產(chǎn)的發(fā)生。比較3組Treg細(xì)胞陽(yáng)性率，發(fā)現(xiàn)非感染性早產(chǎn)和足月分娩孕婦體內(nèi)表達(dá)無(wú)明顯差異，與Th17細(xì)胞陽(yáng)性率的比較結(jié)果相似。進(jìn)一步表明Th17/Treg免疫失衡確實(shí)僅與感染性早產(chǎn)的分娩機(jī)制有關(guān)，而對(duì)非感染性早產(chǎn)和正常分娩的影響微弱。

感染性早產(chǎn)的發(fā)生機(jī)制目前尚無(wú)準(zhǔn)確的結(jié)論，對(duì)其預(yù)測(cè)及治療方法有限，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)Th17、Treg細(xì)胞數(shù)量的比較，發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)生感染性早產(chǎn)時(shí)，孕婦母胎免疫界面的Th17/Treg細(xì)胞平衡發(fā)生偏移。因此，對(duì)Th17/Treg細(xì)胞平衡的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，有望成為預(yù)測(cè)感染性早產(chǎn)的新指標(biāo)，但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證。