IL-6與GATA-6在肺動脈高壓大鼠肺組織中的表達及意義

廖劍雄，張一馳，王炳今,張 謙，劉維佳

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 研究生院，貴州 遵義 563099 ；2.貴州省人民醫(yī)院 燒傷整形科，貴州 貴陽 550002；3.貴州省人民醫(yī)院急診內(nèi)科，貴州 貴陽 550002；4.貴州省人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 貴州 貴陽 550002)

肺動脈高壓(Pulmonary hypertension，PH)是以肺動脈壓力和肺小血管阻力進行性增加為特征的臨床-病理生理綜合征，主要表現(xiàn)為肺血管過度收縮、肺小動脈重構(gòu)，從而引起肺血管阻力的增加來實現(xiàn)肺動脈壓力的逐漸升高，最終導(dǎo)致右心衰死亡。PH的形成中以肺小動脈重構(gòu)是主要環(huán)節(jié)，而在肺血管重構(gòu)過程中又以炎癥反應(yīng)及肺動脈平滑肌細胞(Pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)異常增殖為中心環(huán)節(jié)[1]，然而近年來IL-6及GATA-6在炎癥反應(yīng)及肺動脈平滑肌細胞異常增殖中的作用受到高度關(guān)注。目前全球約有1億人受到PH的威脅，由于治療效果差和疾病不可逆性的迅速進展，其死亡率居高不下[2-3]。所以進一步研究PH的發(fā)病機制，探討其治療新靶點具有重要意義。為此本研究采用野百合堿(MCT)成功誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓模型，探討IL-6與GATA-6在肺動脈高壓中表達及意義，為確定肺動脈高壓的發(fā)生機制和新的治療靶點提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 MCT購于美國MCE公司(批號：Lot#35488)；IL-6一抗(山羊抗大鼠)購于美國R&D公司(批號：AF506)；二抗(兔抗山羊)購于康為世紀(批號：CW0105s)；PageRulerTMPlus Prestained Protein Ladder購于美國THERMO公司(批號：00459134)；PCR引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；Ultrapure RNA Kit購于康為世紀公司(批號50250)；HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit購于美國Vazyme公司(批號7E220E8)；酚：氯仿：異戊醇25∶24∶1購于Solarbio公司生產(chǎn)(批號：P1012)。

1.2 實驗動物及分組 健康成年清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠54只，體重250～300 g，第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗室提供，動物飼養(yǎng)由第三軍醫(yī)大學(xué)動物實驗室負責，本研究已通過貴州省人民醫(yī)院倫理委員會審核(編號:2018-001)，所有操作均遵守實驗動物倫理規(guī)范。大鼠籠盒飼養(yǎng)，保持環(huán)境溫度25℃，濕度60%～70%，自由進食、飲水。采用隨機數(shù)字表法將動物分為3組，分別是生理鹽水對照組(A組，n=18)，空白對照組(B組，n=18)，MCT組(C組，n=18只)。 所有動物實驗均在貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心進行(實驗動物使用許可證號：SYXK(黔)2018-0001)

1.3 動物實驗?zāi)Ｐ徒⒓皺z測時間點確認 上述大鼠自由飼養(yǎng)1周后于造模前1天取無水乙醇：生理鹽水2∶8比例將MCT溶解稀釋配置成1%MCT溶液37℃過夜，C組18只大鼠于造模當天取配置完成的MCT按60 mg/kg單次腹腔內(nèi)注射。 A組18只大鼠于造模當天將0.9%NaCl按60mg/kg單次腹腔內(nèi)注射。B組18只大鼠不做任何處理。記造模當天為第一日，于造模后第7天(T1)、第14天(T2)、第21天(T3)共3個時間點每次分別從A組、B組、C組大鼠中各隨機取6只做實驗檢測。

1.4 右心導(dǎo)管法測右心室壓力 根據(jù)文獻右心室平均壓力可反映肺動脈平均壓力[4]。于造模后T1、T2、T3分別取各組大鼠6只，手術(shù)前禁食8h，10%水合氯醛(0.04 mL/kg)腹腔注射麻醉，將PE10管預(yù)充肝素鹽水采用右心導(dǎo)管法經(jīng)右側(cè)頸外靜脈插管至右心室，用BL-420S生物信號采集分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司生產(chǎn))檢測右心室壓力，并計算右心室平均壓力。

1.5 稱重法計算右心室肥厚指數(shù) 大鼠分別于每個時間點測完右心室壓力后均斷頭處死開胸后完整取出心臟，剪去左右心房及心耳，在肺動脈出口處剪開右心室游離壁組織(RV)，其余則為左心室(LV)+室間隔組織(S),洗去血污,吸干水分,然后分別稱重,按公式右心肥厚指數(shù)=RV/[LV+S]計算。

1.6 肺組織病理學(xué)檢測 檢測右心室壓力后，取肺組織用生理鹽水通過肺動脈沖洗剩余的血液，放入4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色、封片。在數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)下對切片進行圖像采集及分析。

1.7 Western Blot檢測肺組織IL-6蛋白表達水平 稱取適量肺組織，RIPA裂解液與PMSF體積比按99∶1混勻，充分裂解組織，冰上孵育20 min后，12 000 rpm離心10 min，收集上清。根據(jù)BAC蛋白試劑盒測各樣本蛋白濃度，垂直電泳后，轉(zhuǎn)膜2h，封閉20 min，IL-6一抗4℃過夜(稀釋度1∶1 000)，兔抗山羊為二抗室溫孵育2 h(稀釋1∶2 000)，設(shè)β-actin為內(nèi)參(稀釋度1∶5 000)，ECL發(fā)光液化學(xué)發(fā)光，膠片曝光。采用Gel-Pro analyzer4圖像分析軟件測定各條帶的灰度值做定量分析。

1.8 Real-time PCR檢測肺組織GATA-6表達水平 Trizol 法提取樣本肺組織細胞總RNA，引物設(shè)計：上游5'CCCAGCGCAGACCTGTTGGAGGACC3',下游5'TGTGACAGTTGGCACAGGACAG3'；β-actin：上游5'TTGCTGACAGGATGCAGAAG3',下游5'TAGAGCCACCAATCCACACA3'；按照HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit步驟操作，50℃逆轉(zhuǎn)錄3 min，95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s， 60℃退火30 s， 72℃ 延伸30 s，40 個循環(huán)。計算2-△△CT值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理變化見圖1。

A、B：A組和B組大鼠肺組織：可見組織小動脈管壁結(jié)構(gòu)清晰，小動脈周圍未見炎性細胞浸潤；1C:C組T1大鼠肺組織：可見組織小動脈壁厚薄不均，平滑肌細胞胞核形狀不規(guī)則，小動脈周圍水腫；2C：C組T2大鼠肺組織：可見組織小動脈形狀不規(guī)則，周圍炎性細胞浸潤成環(huán)，小動脈壁被炎性細胞侵蝕；3C：C組T3大鼠肺組織：平滑肌細胞胞核固縮深染，小動脈周圍可見淋巴細胞、漿細胞浸潤成環(huán)，肺水腫明顯，肺泡腔內(nèi)可見大量炎性細胞；HE×100。圖1 肺組織HE染色

2.2 MCT誘導(dǎo)SD大鼠右心室平均壓增高 與A組和B組比較，C組T1～T3右心室平均壓力明顯增高(P<0.05)；A組與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；C組中T1～T3右心室平均壓力呈遞增性變化，于T3達到最高峰(P<0.05，見表1)。

2.3 MCT誘導(dǎo)SD大鼠右心室肥厚指數(shù)增高 與A組和B組比較，C組T1～T3右心室肥厚指數(shù)明顯增高(P<0.05)；A組與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；C組中T2與T1比較無明顯差異(P>0.05)，與T2和T1比較，T3明顯增高且達到最高峰(P<0.05，見表2)。

組別T1T2T3A12.41±2.8212.66±2.8712.93±0.63B11.71±2.4913.20±1.5211.47±1.50C18.72±0.77ab24.50±1.81abc34.28±3.55abcdF19.2348.3096.42P0.0010.0000.000

a：與A組比較，P<0.05；b：與B組比較，P<0.05；c：與T1比較，P<0.05；d：與T2比較，P<0.05。

組別T1T2T3A 0.199±0.0070.198±0.0080.224±0.018B 0.193±0.0060.203±0.0150.204±0.008C 0.232±0.008ab0.235±0.150ab0.326±0.076abcdF 52.3314.3212.46P 0.0010.0000.001

a：與A組比較，P<0.05；b：與B組比較，P<0.05；c：與T1比較，P<0.05；d：與T2比較，P<0.05。

2.4 MCT誘導(dǎo)SD大鼠肺組織IL-6水平增高 與A組和B組比較，C組IL-6表達在T1～T3時明顯增高(P<0.05)；A組與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；C組中T2與T1比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與T2和T1比較，T3明顯增高且達到最高峰(P<0.05，見表3、圖2)。

組別T1T2T3A 0.02±0.010.02±0.010.03±0.01B 0.02±0.010.03±0.010.03±0.01C 0.08±0.01ab0.08±0.01ab0.17±0.01abcdF 71.9943.52344.86P 0.000.000.00

a：與A組比較，P<0.05；b：與B組比較，P<0.05；c：與T1比較，P<0.05；d：與T2比較，P<0.05。

圖2 各時間點蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果

2.5 MCT誘導(dǎo)SD大鼠肺組織GATA-6 mRNA水平降低 與A組和B組比較，C組GATA-6的表達在T1～T3時明顯降低(P<0.05)；A組與B組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；C組中T2與T1比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與T2和T1比較，T3明顯降低且達到最小峰(P<0.05，見表4)。

組別T1T2T3A 1.02±0.091.01±0.071.03±0.08B 0.98±0.051.03±0.061.01±0.07C 0.54±0.05ab0.48±0.04ab0.30±0.02abcdF 92.90165.42279.64P 0.000.000.00

a：與A組比較，P<0.05；b：與B組比較，P<0.05；c：與T1比較，P<0.05；d：與T2比較，P<0.05。

2.6 C組中IL-6與GATA-6相關(guān)分析 C組中IL-6與GATA-6呈顯著負相關(guān)(r=-0.887，P<0.05，見圖3)。

肺組織中IL-6表達水平圖3 IL-6與GATA-6相關(guān)分析

3 討論

PH發(fā)生時 PASMC周圍的免疫細胞不斷積累，導(dǎo)致大量的炎癥介質(zhì)釋放，其中IL-6被認為是炎癥介質(zhì)中最重要的靶點之一[5]。在人體通過檢測 PH患者肺組織中IL-6的表達發(fā)現(xiàn)其水平顯著升高，且單核巨噬細胞產(chǎn)生IL-6越多，動脈重構(gòu)越迅速[6]。在未經(jīng)肺動脈高壓造模的小鼠中，IL-6 的過表達可導(dǎo)致小鼠形成PH[7]，而IL-6基因敲除鼠在低氧誘導(dǎo)下未能形成肺動脈壓力升高和肺血管重構(gòu)[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smad2信號通路對維持血管正常結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)平衡起到重要作用，而該通路任意一個環(huán)節(jié)異常均可促進肺血管重構(gòu)，其機制與在TGF-β1及Smad2刺激下PASMC內(nèi)IL-6增加有關(guān)[9-10]。最新研究顯示，在PH的形成中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2) 對促進炎癥反應(yīng)起到重要作用，一方面活化的ERK1/2可以通過ERK1/2-NF-κB信號通路激活NF-κB來促進炎癥介質(zhì)的釋放，另一方面IL-6又可以通過ERK1/2信號通路激活鈣離子依賴性的半胱氨酸蛋白酶(calpain)來促進肺小動脈重構(gòu)[11-12]。本研究結(jié)果顯示在給予MCT后，肺HE染色可見T1～T3，C組大鼠肺組織逐步出現(xiàn)小動脈壁厚薄不均，平滑肌細胞胞核固縮深染，肺水腫，肺泡腔內(nèi)大量炎性細胞浸潤，而A組和B組未見明顯改變，同時與A組、B組相比C組大鼠在T1～T3右心室平均壓力及右心室肥厚指數(shù)均明顯增高，且在C組中T1～T3右心室平均壓力及右心室肥厚指數(shù)呈遞增性變化并在T3達到最高峰，提示本研究PH模型建立成功，在此基礎(chǔ)上本研究發(fā)現(xiàn)與A組、B組相比C組大鼠IL-6表達在T1～T3明顯增高且C組中IL-6表達于T3明顯增高并達到最高峰。證實了IL-6在PH形成中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，同時提示其表達的強弱可以作為評估PH病情程度的一個重要指標。

GATA-6是唯一表達于血管平滑肌細胞的GATA家族轉(zhuǎn)錄因子，在肺組織其作用為抑制PASMC進入細胞周期，維持靜止期PASMC表型的穩(wěn)定[13]，所以推測GATA-6通過穩(wěn)定細胞表型來抑制PASMC異常增殖可能具有重要意義。在一項肺癌細胞的研究中觀察到，刺激GATA-6的高表達能提高細胞存活率，而抑制GATA-6的表達可以明顯減低細胞的存活率[14]，進一步證實GATA-6可以抑制細胞進入細胞周期，能保持靜止期細胞表型的穩(wěn)定性?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，GATA-6的下調(diào)能明顯提高肺動脈壓力，在MCT大鼠模型中觀察到損傷后第3天起肺中的GATA-6 表達便迅速下降，表明GATA-6的低表達可能是引起肺動脈高壓中血管重構(gòu)的早期病理過程[15]。本研究顯示，隨著PH的進展，與A組、B組比較C組大鼠GATA-6的表達在T1～T3明顯降低且C組中GATA-6的表達于T3明顯降低并達到最小峰。與上述研究結(jié)果趨勢一致，表明GATA-6在PH的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。同時本研究發(fā)現(xiàn)，隨著PH的逐步進展，IL-6的表達呈持續(xù)性升高，而GATA-6的表達呈持續(xù)降低，將C組中IL-6與GATA-6行相關(guān)分析結(jié)果顯示呈顯著負相關(guān)，提示IL-6與GATA-6在PH的發(fā)生發(fā)展中具有明顯相關(guān)性。

綜上所述，在肺動脈高壓大鼠肺組織中IL-6的表達明顯增高，GATA-6的表達明顯減低，且兩者在PH的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，并推測IL-6與GATA-6有明顯的相關(guān)性，但其機制還需進一步研究探討。