氧化石墨烯水體和土壤生物毒性效應(yīng)研究進(jìn)展

周萌萌，黃碧捷，靖小菁

(江漢大學(xué) 光電化學(xué)材料與器件教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430056)

1 引言

氧化石墨烯作為二維納米材料的典型代表，擁有極薄的片層結(jié)構(gòu)、豐富的含氧官能團(tuán)、強(qiáng)大的吸附力[1]，同時(shí)，它在改善材料性能發(fā)揮著非常重要的作用，其中有材料的熱學(xué)性能、電學(xué)性能、力學(xué)性能等。隨著氧化石墨烯的廣泛應(yīng)用，其對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的潛在影響日漸引起人們關(guān)注。

近年來，有關(guān)氧化石墨烯對(duì)動(dòng)植物的影響的研究越來越多，甚至包括對(duì)微生物的毒性研究，實(shí)驗(yàn)證明氧化石墨烯會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生毒害作用，且隨著氧化石墨烯的種類、濃度和受試生物的不同，產(chǎn)生不同程度的影響。氧化石墨烯的毒性機(jī)理有多種，包括直接接觸造成的物理損傷、隱蔽效應(yīng)，氧化應(yīng)激效應(yīng)、與其他金屬離子的復(fù)合作用等。依據(jù)氧化石墨烯自身的性質(zhì)，綜述了氧化石墨烯在水中和土壤中的環(huán)境行為，并探究了氧化石墨烯對(duì)各種水生生物、土壤生物的毒性效應(yīng)。

2 氧化石墨烯的水環(huán)境行為及其生物毒性

2.1 氧化石墨烯的水環(huán)境行為

氧化石墨烯自身性質(zhì)和水環(huán)境理化性質(zhì)，能夠極大地影響氧化石墨烯在水環(huán)境中的穩(wěn)定性和膠體特性。其中導(dǎo)致氧化石墨烯在水體中環(huán)境行為的主要的因素是氧化石墨烯的種類和濃度[2]。

石墨烯可分為純石墨烯、氧化石墨烯和少層石墨烯，不同種類的石墨烯性質(zhì)大不相同。例如純石墨烯化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,在水體很難被去除。而且其具有強(qiáng)疏水性，不同片層之間會(huì)團(tuán)聚，甚至沉積到水底[3]；而氧化石墨烯具有高親水性和表面活性,在純水中能均勻分散，形成穩(wěn)定的膠體溶液，因此難以去除[4]，由于氧化石墨烯能在水體中高度移動(dòng)，這加大了氧化石墨烯的潛在毒性影響，對(duì)水環(huán)境理化性質(zhì)也會(huì)有一定的影響[5]。石墨烯的層數(shù)也會(huì)影響其在水體中的行為，其中濃度對(duì)少層石墨烯在水性介質(zhì)中的聚集穩(wěn)定性有重要影響。

氧化石墨烯的強(qiáng)吸附能力不可避免地影響了水環(huán)境中污染物的遷移,如氧化石墨烯對(duì)水體中的金屬陽離子(Cu2+、Co2+、Zn2+、Sb3+)具有強(qiáng)吸附能力[6]，可能導(dǎo)致氧化石墨烯與金屬離子聯(lián)合對(duì)水生生物產(chǎn)生毒性,從而加大氧化石墨烯在水生生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 氧化石墨烯的水生生物毒性

2.2.1 氧化石墨烯對(duì)魚類的毒性效應(yīng)

氧化石墨烯在水中高度分散,會(huì)隨著水流發(fā)生轉(zhuǎn)化和遷移，其化學(xué)性質(zhì)很活潑，溶于水后將影響水環(huán)境生態(tài)和水生生物的生長(zhǎng)。而魚類作為水生生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺的一部分，在水生系統(tǒng)中扮演著重要角色，可以通過研究魚類來了解氧化石墨烯對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的影響[7]。斑馬魚具有體積小發(fā)育快等特性，因此絕大多數(shù)研究水生動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中都選用斑馬魚[8]。高濃度的氧化石墨烯對(duì)斑馬魚并沒有明顯的急性毒性，但是會(huì)引起細(xì)胞排列松散，組織解體等一系列危害[9]。例如50 mg/L的氧化石墨烯會(huì)抑制斑馬魚胚胎的細(xì)胞生長(zhǎng)，雖然抑制了其孵化速度，但并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。5 mg/L以上的氧化石墨烯對(duì)斑馬魚胚胎作用24 h，氧化石墨烯會(huì)發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象并吸附在胚胎絨毛膜的表面,斑馬魚胚胎心率受到了顯著抑制[10]。但即使在100 mg/L的高暴露濃度下也未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的毒害作用，如致死率、胚胎畸形、孵化延遲等。

氧化石墨烯對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的特殊的毒性效應(yīng)主要表現(xiàn)在氧化石墨烯材料容易吸附在胚胎絨毛膜表面上，從而阻礙了胚胎與環(huán)境之間的氣體交換，于是絨毛膜空間會(huì)形成低氧微環(huán)境，導(dǎo)致影響胚胎發(fā)育[2]。

2.2.2 氧化石墨烯對(duì)藻類的毒性效應(yīng)

一般情況下，氧化石墨烯對(duì)某些藻類不具有明顯毒性，但對(duì)于一些藻類毒性效應(yīng)較強(qiáng)。氧化石墨烯會(huì)影響生長(zhǎng)階段的光合色素，如在高濃度下，會(huì)促進(jìn)海藻的生長(zhǎng)和光合色素的增加[11]。當(dāng)暴露時(shí)間為96 h，濃度低于1 mg/L時(shí)，會(huì)顯著增加過氧化氫酶及超氧化物歧化酶活性；當(dāng)濃度低于2.5 mg/L時(shí)，藻類的生長(zhǎng)繁殖將受到明顯抑制；濃度低于5 mg/L時(shí)，葉綠素a的含量明顯下降進(jìn)而影響光合速率[12]。

氧化石墨烯對(duì)藻類的毒性效應(yīng)的機(jī)制表現(xiàn)在，當(dāng)氧化石墨烯進(jìn)入到水體以后，會(huì)吸附到藻類細(xì)胞表面，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)光的利用率下降。將適量的氧化石墨烯加入到眼蟲藻的培養(yǎng)液后發(fā)現(xiàn)，片狀的氧化石墨烯均勻地覆蓋在藻細(xì)胞表面[8]。氧化石墨烯的遮蔽效應(yīng)會(huì)引起生物膜和納米顆粒材料之間強(qiáng)相互作用[13]。高濃度氧化石墨烯會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，使細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，進(jìn)而造成細(xì)胞損傷。

目前最新的進(jìn)展是關(guān)于氧化石墨烯與其他物質(zhì)的聯(lián)合毒性。已有研究顯示，雖然低濃度的氧化石墨烯對(duì)銅綠微囊藻沒有顯著的毒性，但其會(huì)與Cd2+發(fā)生復(fù)合作用，從而會(huì)加劇Cd2+對(duì)細(xì)胞的毒性[14]。

2.2.3 氧化石墨烯對(duì)微生物的毒性效應(yīng)

氧化石墨烯對(duì)細(xì)菌并無顯著毒性效應(yīng)，甚至在有的情況下氧化石墨烯可以對(duì)某些細(xì)菌的生長(zhǎng)和增殖起促進(jìn)作用。氧化石墨烯對(duì)不同的微生物有著不同的毒性效應(yīng)。氧化石墨烯對(duì)細(xì)菌的毒性還表現(xiàn)在氧化石墨烯的濃度和接觸時(shí)間[15]。例如在25 μg/mL氧化石墨烯的培養(yǎng)液中，大腸桿菌生長(zhǎng)速度較快，容易形成生物膜；在覆蓋25 μg氧化石墨烯的濾膜上，細(xì)菌的生長(zhǎng)速度加快，是對(duì)照組的2倍。在75 μg氧化石墨烯的濾膜上,細(xì)菌的生長(zhǎng)速度更快了，是對(duì)照組的3倍[16]。而在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入高濃度氧化石墨烯，滅活率顯著提高。

造成細(xì)菌死亡最主要的原因是氧化石墨烯對(duì)細(xì)胞造成物理損傷，氧化石墨烯的結(jié)構(gòu)特殊，呈片狀結(jié)構(gòu)，具有鋒利的邊緣[17]，容易對(duì)細(xì)胞直接造成機(jī)械損傷，導(dǎo)致大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞失去完整性。

3 氧化石墨烯的土壤環(huán)境行為及其生物毒性

3.1 氧化石墨烯的土壤環(huán)境行為

最終大量的氧化石墨烯會(huì)遷移到土壤中，于是研究氧化石墨烯的環(huán)境行為及生物毒性效應(yīng),對(duì)科學(xué)客觀地評(píng)價(jià)石墨烯類物質(zhì)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)具有重要的意義[18]。氧化石墨烯在土壤中的行為的研究主要是關(guān)于多孔介質(zhì)中的遷移，這是影響土壤微生物群落變化的重要因素[19]。隨著環(huán)境理化性質(zhì)的改變，氧化石墨烯的遷移行為會(huì)有一定的變化[14]。其中pH值對(duì)氧化石墨烯的遷移行為無明顯影響，離子強(qiáng)度是決定因素，影響氧化石墨烯在多孔介質(zhì)中遷移[20]。此外,由于氧化石墨烯具有很大的比表面積和強(qiáng)吸附能力,因此有必要探索一下氧化石墨烯對(duì)土壤中現(xiàn)有的污染物的環(huán)境效應(yīng)的影響,以便全面地評(píng)價(jià)氧化石墨烯對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響。下面研究氧化石墨烯在土壤中的行為及影響因素。

3.2 氧化石墨烯的土壤生物毒性

3.2.1 氧化石墨烯對(duì)秀麗隱桿線蟲的毒性效應(yīng)

秀麗隱桿線蟲廣泛被用于生態(tài)毒理學(xué)和測(cè)試，一般雌雄同體，有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境變化敏感、生命周期短、行為反應(yīng)穩(wěn)定、遺傳背景清楚等特點(diǎn)[21]。早在半個(gè)多世紀(jì)以前，有學(xué)者研究線蟲，并且將其作為模式生物。美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)在2002年頒布了一份標(biāo)準(zhǔn)化指南，這份指南是上詳細(xì)的描述了秀麗線蟲這種生物，以及它作用于土壤毒性的評(píng)價(jià)[22]。

目前最被學(xué)者接受的機(jī)制是，氧化石墨烯能使DNA和RNA損傷，進(jìn)而從分子水平上誘導(dǎo)生殖細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的阻滯，導(dǎo)致秀麗線蟲性腺損傷，影響其發(fā)育，最后降低其生殖能力。例如將秀麗線蟲在0.1～100 mg/L的氧化石墨烯中實(shí)驗(yàn)24～48 h，會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，生殖能力喪失，DNA損傷和RNA干擾，甚至細(xì)胞凋亡等一系列影響[23]。

氧化石墨烯造成靶器官損傷的主要原因是誘導(dǎo)秀麗線蟲體內(nèi)ROS的產(chǎn)生[9]。例如氧化石墨烯誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，干擾生物體的免疫能力，從而影響生物體正常的生殖發(fā)育。

3.2.2 氧化石墨烯對(duì)潮蟲的毒性效應(yīng)

潮蟲在土壤中分布廣泛，數(shù)量巨大，種類繁多，是有機(jī)物的主要分解者。主要活動(dòng)于地表凋落物層中,因?yàn)樗鼘?duì)環(huán)境的敏感性較強(qiáng)，所以在學(xué)者研究實(shí)驗(yàn)室，這種生物往往是被用于評(píng)價(jià)污染土壤的毒性測(cè)試的首要選擇。

對(duì)潮蟲的這類研究，一般是通過常規(guī)的毒性測(cè)試，比如說對(duì)其的攝食率的影響、體重的影響等。設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，攝入濃度為500、1000、1500、2000 mg/kg納米TiO2對(duì)潮蟲的影響，時(shí)間分為3 d、7 d、14 d和28 d 4種，然后對(duì)比其變化和死亡率[9]。發(fā)現(xiàn)納米材料對(duì)潮蟲并不產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性作用，即沒有死亡，也無明顯體重變化[24]。從微觀角度分析，納米材料會(huì)影響潮蟲的消化系統(tǒng)，它對(duì)消化腺內(nèi)部的CAT和GST等抗氧化酶的活性有一定的影響，表現(xiàn)為高濃度或低濃度時(shí)過氧化氫酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性會(huì)有所降低[25]，導(dǎo)致消化道膜的極度不穩(wěn)定，但是中等濃度時(shí)不會(huì)導(dǎo)致酶活性的顯著變化。

3.2.3 氧化石墨烯對(duì)植物的毒性效應(yīng)

氧化石墨烯主要通過根部被植物所吸收，積累在根的薄壁細(xì)胞中。而根冠和氣孔在控制植物體中吸收和運(yùn)輸方面起重要作用[26]。一系列證據(jù)表明，長(zhǎng)時(shí)間暴露在氧化石墨烯中會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生不利影響，高濃度的氧化石墨烯影響更為嚴(yán)重[27]。氧化石墨烯對(duì)陸生植物的毒性研究的主要對(duì)象主要是豆科類和蔬菜類等，集中是對(duì)種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的直接毒性影響方面，目前看來，氧化石墨烯對(duì)陸生植物的直接毒性影響大都表現(xiàn)為抑制植物根部的生長(zhǎng)、降低種子的發(fā)芽、延遲花期等[2]。對(duì)于不同品種的植物和不同的暴露濃度，對(duì)于不同的植物和不同的暴露濃度，氧化石墨烯的作用會(huì)不同。例如用25～100 mg/kg氧化石墨烯處理油菜，會(huì)導(dǎo)致油菜根長(zhǎng)度縮短；用50～100 mg/kg氧化石墨烯處理油菜導(dǎo)致新鮮根重量下降[28]；而10～1000 μg/L范圍內(nèi)對(duì)擬藍(lán)芥種子萌發(fā)生長(zhǎng)并沒有影響[27]。

根據(jù)以往研究發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生氧化應(yīng)激，破壞植物正常發(fā)育的表達(dá)基因，導(dǎo)致SOD含量和CTA含量下降，從而影響植物生物生長(zhǎng)[29]。隨著氧化石墨烯濃度的增高，植物的大小和葉片的數(shù)量會(huì)發(fā)生變化，ROS水平和細(xì)胞的死亡率會(huì)隨著氧化石墨烯濃度的增加而增加。根據(jù)進(jìn)一步的加強(qiáng)分析和研究，能實(shí)現(xiàn)氧化石墨烯的合理應(yīng)用。

4 展望

有關(guān)氧化石墨烯的毒性效應(yīng)的研究方興未艾，與此同時(shí)，不同研究者的實(shí)驗(yàn)結(jié)論存在較大分歧，原因可能是由于氧化石墨烯的特殊性質(zhì)，其對(duì)水污染物具備高吸附能力，容易與不同的金屬離子、有機(jī)物結(jié)合復(fù)合，產(chǎn)生更復(fù)雜的影響；又或者是因?yàn)椴煌瑢?shí)驗(yàn)中所采用氧化石墨烯的制備方法、理化性質(zhì)、檢測(cè)方法等方面不同，也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的差異。而且現(xiàn)階段所選的受試生物的種類單一，研究手段有限，沒有建立統(tǒng)一的數(shù)據(jù)庫，很多數(shù)據(jù)不能共享。

根據(jù)氧化石墨烯的性質(zhì)，其形態(tài)多樣，難以從環(huán)境分離出來，尤其是當(dāng)氧化石墨烯進(jìn)入到生物體內(nèi)，情況會(huì)變得更加復(fù)雜，所以在檢測(cè)上十分困難。因此目前面臨的難題是如何創(chuàng)造出一套新的檢測(cè)追蹤手段，能準(zhǔn)確快速的檢測(cè)出氧化石墨烯如何從環(huán)境中進(jìn)入到生物體內(nèi)，又是如何在分子水平上相互作用，產(chǎn)生影響的。

氧化石墨烯和生物的相互作用比較復(fù)雜，即使在低濃度下表現(xiàn)為無明顯毒性，它也可能和其他物質(zhì)發(fā)生復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，形成一種新的復(fù)合物，這種復(fù)合物可能對(duì)這種生物產(chǎn)生更強(qiáng)的毒害作用。今后應(yīng)該繼續(xù)加大力度，做進(jìn)一步研究。