葡萄球菌性燙傷樣皮膚綜合征(SSSS)快速診斷ELISA方法的初步探索*

賴 蕓，尤 聰，李立明，李龍年，葉小英

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2017級(jí)碩士研究生；2.第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000)

葡萄球菌性燙傷樣皮膚綜合征(Staphylococcal Scalded Skin Syndrome, SSSS)是由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S.aureus)產(chǎn)生的表皮剝脫毒素(Exfoliative Toxin, ET)引起的以皮膚形成淺表水皰、皮膚彌漫性紅斑及皮膚大面積剝脫后留有潮紅的糜爛面為特征的皮膚病[1-2]。目前臨床上沒(méi)有針對(duì)ETA的SSSS快速診斷試劑盒的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)選擇合適的結(jié)合方法，將抗體偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，利用特異性的ETA抗體，體外檢測(cè)ETA抗原，進(jìn)行抗原檢測(cè)的ELISA方法的初步探索。本項(xiàng)目參考乙肝病毒表面抗原診斷試劑盒制備的研究[3]以及布魯氏菌VirB12蛋白純化及其抗體ELISA方法的初步建立[4]，通過(guò)建立合理的抗體偶聯(lián)固定化方法，初步建立了檢測(cè)SSSS患者ETA的ELISA方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床血清樣品血清來(lái)源于贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科2017年-2018年采集的SSSS患者血清、內(nèi)毒素陽(yáng)性患者血清及正常人血清(至我院體檢的非SSSS患者血清)各7份?；颊呒覍賹?duì)血樣的采集目的知情同意，血樣的采集符合贛南醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)章程。

1.1.2主要試劑ETA購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司。Anti-ETA抗體購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司。0.1 mmol·L-1碳酸鹽包被緩沖液(0.1 M pH 9.6)、0.01 M磷酸鉀緩沖液(PBS pH 7.4)、封閉液5% BSA、包被微孔板、0.1 M磷酸鉀緩沖液(PBS pH 6.8)、2.5%戊二醛液、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、TMB顯色液、陽(yáng)性對(duì)照稀釋液(PBS液)、2 M甘氨酸液、蒸餾甘油、透析袋、HRP標(biāo)記抗體稀釋液、PBS洗滌液(PBS干粉 2 L pH 7.2～7.4配制)均購(gòu)自江西阿普斯戴爾生物科技有限公司。

1.2ELISA方法的建立

1.2.1Anti-ETA固相載體的包被采用方陣滴定法選擇包被抗體和酶標(biāo)記抗體最佳的工作濃度，分別為10 μg·mL-1和1∶100。將Anti-ETA溶解在0.1 M碳酸鹽包被緩沖液中，濃度為10 μg·mL-1，100 μL/孔，2～8 ℃放置24 h，棄去孔內(nèi)舊液，用PBS洗滌液向每孔加入200 μL，洗板3次，拍干，每次3 min，再加入150 μL/孔封閉液，置18～26 ℃封閉2 h，棄去孔內(nèi)舊液，拍干，置18～26 ℃，干燥不少于12 h。用鋁箔袋裝好干燥好的抗體板，置4～8 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2酶標(biāo)二抗的制備將2 mg ETA抗體(Anti-ETA)與4 mg酶在總體積400 μL的0.1 M磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)中混合，在4 ℃對(duì)0.1 M磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)透析過(guò)夜，用0.1 M磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)稀釋2.5%戊二醛至1%，向混合液中加入50 μL稀釋過(guò)的戊二醛，在室溫下輕攪拌3 h，加入2 M甘氨酸液使甘氨酸最終濃度達(dá)到0.1 M，混合液室溫放置2 h，以封閉殘存的醛基，混合液在4 ℃對(duì)0.01 M PBS(pH 7.4)透析過(guò)夜，10 000×g 4 ℃離心30 min，將上清移入另一管中,按體積1∶1加入甘油,使終濃度達(dá)50%，置-20 ℃保存。

1.2.3Anti-ETA最適包被濃度的確定用0. 1 M 碳酸鹽包被緩沖液將Anti-ETA分別稀釋成1，2，4，6，8，10 μg·mL-1的濃度梯度，每孔加入100 μL，分別設(shè)4孔，4 ℃過(guò)夜包被。次日，將酶標(biāo)板洗滌 3次后，加封閉液封閉。將稀釋好的ETA(10 μg·mL-1)、正常人血清各兩孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h。 洗滌 3次后加入100 μL 1∶100濃度的酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育30 min，洗滌后加入100 μL TMB顯色液，避光顯色20 min，加入100 μL終止液。在酶標(biāo)儀上讀取OD 450值。

1.2.4酶標(biāo)抗體最適工作濃度的確定稀釋好的ETA(10 μg·mL-1)包被 4 ℃過(guò)夜，用PBS洗滌液向每孔加入200 μL，洗板3次，拍干，每次3 min，再用150 μL/孔封閉液，置18～26 ℃封閉2 h，用稀釋液稀釋酶標(biāo)抗體成1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1 600，分別加入到反應(yīng)板中，每個(gè)稀釋度二孔，每孔100 μL，置37 ℃孵育1 h后洗滌，洗滌后加入TMB顯色液和終止液，測(cè)定OD 450值。

1.2.5酶標(biāo)反應(yīng)板初步測(cè)定從包被好的酶標(biāo)板中隨機(jī)抽取3條，洗滌3次，加入臨床血清樣品，每孔 100 μL，同時(shí)使用ETA做陽(yáng)性對(duì)照孔，37 ℃孵育1 h后，用洗滌液洗滌3遍，洗滌后加入 100 μL 1∶100濃度的酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育30 min，洗滌后每孔加入TMB底物顯色液100 μL，避光顯色20 min。 每孔加入100 μL終止液，放入酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(OD 450值)。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定將包被好的ETA抗體反應(yīng)板取出，置于室溫30 min，在對(duì)應(yīng)的微孔內(nèi)加入校準(zhǔn)品(采購(gòu)的ETA作為陽(yáng)性對(duì)照)、正常人血清、內(nèi)毒素陽(yáng)性患者血清、SSSS患者血清各100 μL，37 ℃孵育30 min。棄孔內(nèi)液體，用稀釋好的洗滌液漂洗4次，拍干。每孔加入100 μL酶標(biāo)液(HRP標(biāo)記的ETA抗體), 37 ℃孵育30 min，用稀釋好的洗滌液漂洗4次，拍干，每孔加入100 μL顯色液，避光37 ℃孵育15 min，每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)。反應(yīng)終止30 min內(nèi)，在450 nm處讀取吸光度OD值。

2 結(jié) 果

2.1ETA抗體包被工作濃度的選擇將包被抗體(Anti-ETA)稀釋成1，2，4，6，8，10 μg·mL-1的濃度，分別固定在酶標(biāo)板上，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，得到陰陽(yáng)性血清的OD值(表1)，計(jì)算陽(yáng)性O(shè)D值/陰性O(shè)D值(P/N值)，結(jié)果顯示，當(dāng)ETA抗體包被濃度為10 μg·mL-1時(shí)，P/N值最高，為4.83，效果最好，所以確定包被抗體最適宜的工作濃度為10 μg·mL-1[4]。

表1 最佳包被濃度的確定

注：“+”表示ETA，“-”表示正常人血清。

2.2酶標(biāo)二抗工作濃度的選擇將包被抗原(ETA)稀釋成10 μg·mL-1的濃度，固定在酶標(biāo)板上，用經(jīng)過(guò)一系列稀釋的酶標(biāo)抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，測(cè)定OD值(表2)，結(jié)果顯示，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為1∶100時(shí)OD值最高接近1.0[5]，反應(yīng)效果最好。 在后面的試驗(yàn)中二抗進(jìn)行100倍稀釋。

表2 酶標(biāo)二抗工作濃度滴定

2.3酶標(biāo)反應(yīng)板初步測(cè)定從包被好的酶標(biāo)板中隨機(jī)抽取3條，加入臨床血清樣品、酶標(biāo)二抗后顯色測(cè)定OD值(表3)，結(jié)果OD 450平均值為0.077，標(biāo)準(zhǔn)差為0.007 9，變異系數(shù)為10.3%，提示檢測(cè)結(jié)果較穩(wěn)定，且變異系數(shù)小于15%，顯示所制備的酶標(biāo)板穩(wěn)定性好，能滿足ELISA實(shí)驗(yàn)的要求[4,6]。

表3 酶標(biāo)反應(yīng)板的初步測(cè)定

表4 臨界值確定

2.5抗體包被板加封閉液與不加封閉液的包被板比較將抗體固定在酶標(biāo)板上，分別采用患者血清、ETA進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(表5)。結(jié)果顯示，不加封閉液組的OD均值及標(biāo)準(zhǔn)差高于添加封閉液者組，經(jīng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩組總體OD均值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.078，P=0.939)，OD值的大小反應(yīng)ELISA顯色強(qiáng)度，得出：進(jìn)行封閉可在一定程度上增強(qiáng)偶聯(lián)體系的穩(wěn)定性，且不降低顯色反應(yīng)強(qiáng)度。

2.6臨床樣品檢測(cè)采用包被好的ETA抗體反應(yīng)板，分別對(duì)SSSS患者血清、正常人血清、內(nèi)毒素陽(yáng)性患者血清進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，并進(jìn)行比較(表6)。

表5 加封閉液與不加封閉液的包被板OD值比較

注：“+”表示ETA，下同。

表6 三組臨床樣品檢測(cè)的OD值比較

結(jié)果得出不同組ELISA檢測(cè)得出的OD值總體分布不全相同(H=12.394，P=0.002)，可以認(rèn)為不同組的OD值有差別，可以認(rèn)為不同組的表皮剝脫毒素A的含量不全相同。進(jìn)一步兩兩比較得出：SSSS患者血清組與內(nèi)毒素陽(yáng)性血清組的OD值有差別(調(diào)整后P=0.004)；正常人血清組與內(nèi)毒素陽(yáng)性血清組的OD值有差別(調(diào)整后P=0.012)；SSSS患者血清組和正常人血清組的OD值無(wú)差別(調(diào)整后P>0.05)。

3 討 論

SSSS主要發(fā)生于嬰幼兒，但也見(jiàn)于免疫功能低下或腎功能衰竭的成人。本病發(fā)病率近年來(lái)有明顯上升，雖然多數(shù)患者在經(jīng)抗生素治療后能完全恢復(fù)，但部分患者經(jīng)積極的抗生素治療仍不能獲得滿意療效甚至死亡。本病的預(yù)后取決于其快速診斷與及時(shí)準(zhǔn)確的治療，但目前SSSS診斷主要依靠臨床表現(xiàn)和醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)。1970年，Melish和Glasgow[7]首次用新生小鼠試驗(yàn)證實(shí)金葡菌分泌的ET與 SSSS發(fā)病的相關(guān)性，隨后的研究確定ET是導(dǎo)致SSSS的致病物質(zhì)[8]。ETA和ETB與人類SSSS的發(fā)病有關(guān)。編碼基因ETA和ETB具有 40%的序列同源性，分別產(chǎn)生242個(gè)氨基酸(分子量分別為26.9 kDa)的ETA與246個(gè)氨基酸(分子量為27.3 kDa)的ETB[9-11]。ETA和 ETB屬絲氨酸蛋白酶[12-13]，均可直接作用于表皮顆粒層細(xì)胞橋粒，導(dǎo)致細(xì)胞間的橋粒連接斷裂，從而產(chǎn)生水皰和剝脫。ELISA具有簡(jiǎn)便快速、不需要特殊的儀器設(shè)備、可在短時(shí)間內(nèi)定性或定量檢測(cè)大量標(biāo)本的特點(diǎn)。常規(guī)的病原學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷、表皮病理檢查技術(shù)存在耗時(shí)長(zhǎng)、陽(yáng)性率不高、檢測(cè)過(guò)程繁瑣、有創(chuàng)等缺點(diǎn)[14]。反向被動(dòng)膠乳凝聚試驗(yàn)(RPLA) 檢測(cè)ET雖有簡(jiǎn)單快速的優(yōu)點(diǎn)，但其特異性差，假陽(yáng)性率高[15]。目前國(guó)外對(duì)(ETA/ETB)的快速檢測(cè)多采用RPLA或PCR擴(kuò)增ETA/ETB基因的原理，前者有日本生研與美國(guó)Thermo科學(xué)公司的EXT-RPLA試劑盒，后者以多重PCR的應(yīng)用為多，需要較繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行DNA提取與目的基因擴(kuò)增與檢測(cè)，而國(guó)內(nèi)雖有PCR擴(kuò)增ETA/ETB基因從而診斷SSSS的實(shí)驗(yàn)研究個(gè)別報(bào)道，但ETA/ETB的ELISA快速檢測(cè)試劑盒的研究及其臨床應(yīng)用尚屬空白。

本研究以抗原抗體結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，比較SSSS患者與正常人血清中ETA的含量,為研發(fā)一種快速檢測(cè)SSSS患者血清中ETA的ELISA方法進(jìn)行初步探索，通過(guò)ELISA固相載體的制備、酶標(biāo)二抗的制備，然后對(duì)包被抗體的包被濃度進(jìn)行滴定，獲得了最佳的包被濃度(10 μg·mL-1)，對(duì)二抗的濃度進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，選擇出最佳工作濃度為1∶100，在條件優(yōu)化好后，進(jìn)行酶標(biāo)板初步檢測(cè)，評(píng)判所制備的酶標(biāo)板的穩(wěn)定性，避免因酶標(biāo)板包被存在的問(wèn)題影響到結(jié)果的判定。通過(guò)對(duì)已知正常人血清的檢測(cè)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定了臨界值，進(jìn)行了加封閉液與不加封閉液的檢測(cè)，結(jié)果得出封閉液可以使ELISA更加穩(wěn)定的結(jié)論。然后與正常人血清及內(nèi)毒素陽(yáng)性患者血清進(jìn)行比較，得出SSSS患者血清組和正常人血清組OD值無(wú)差別，可以認(rèn)為單純包被Anti-ETA尚不能作為SSSS的有效檢測(cè)。該方法的建立，成功測(cè)定出SSSS患者血清存在ETA，并與正常人血清及內(nèi)毒素陽(yáng)性患者血清進(jìn)行比較，為SSSS的快速檢測(cè)試劑盒的建立奠定了基礎(chǔ)。在未來(lái)的研究中，需加大樣本量，并進(jìn)一步結(jié)合Anti-ETB作為共同包被抗體，以期成功研發(fā)能夠適用于臨床的SSSS快速診斷試劑盒。