茶枯餅提取物對骨髓來源巨噬細胞炎癥反應(yīng)的作用研究*

王 斐，何偉亮，謝 璐，曾招林，陳水親，宋 濤，劉志平

(贛南醫(yī)學(xué)院1.2017級碩士研究生；2.2016級生物技術(shù)本科生；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis, UC)和克羅恩病(Crohn's Diseases, CD)，是一種慢性反復(fù)發(fā)作的炎癥性腸道疾病，表現(xiàn)為腹瀉、腹痛和便血等癥狀,其病變主要累及回腸和結(jié)直腸。IBD病情反復(fù)發(fā)作,遷延不愈，嚴重影響患者正常的生活質(zhì)量[1-2]。IBD 的發(fā)病機制非常復(fù)雜,至今仍未被完全闡明,主要可能與遺傳的缺陷、免疫功能的紊亂以及腸道菌群的失調(diào)等有關(guān)[2-4]。因此，干預(yù)上述環(huán)節(jié)，可能延緩或減弱炎癥反應(yīng)過程。5-氨基水楊酸類化合物、皮質(zhì)類固醇類激素、多種免疫抑制劑和鈣調(diào)磷酸酶抑制劑等為臨床常用治療IBD的藥物[5]。然而，這些藥物存在療效有限且不良反應(yīng)多,甚至有致癌作用[6-7]。因此, 尋找一種新型有效且不良反應(yīng)小的藥物成為當(dāng)務(wù)之急。

油茶是山茶科山茶屬植物,是中國南方的特色樹種[8-9]。油茶樹產(chǎn)出的果稱為油茶籽,其提煉的油即是茶油。茶油是一種綠色、原生態(tài)、高營養(yǎng)的物質(zhì)，是廣為認可的保健食用油,有“東方橄欖油”之稱[10]。近年研究顯示油茶中含有抗腫瘤、抗氧化、殺菌和抗炎癥作用的多種特殊成分[11-14]。茶枯餅為油茶果實榨取茶油后的殘渣, 在中藥大辭典和嶺南草藥志中記載茶枯餅含有多種藥用成分[15]，但具體作用尚不清楚。本研究對茶枯餅進行處理后，獲得茶枯餅提取物(Camellia cake extracts, CCEs)，以細菌脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的C57 BL/6小鼠骨髓來源的巨噬細胞(Bone marrow derived macrophages,BMDM)為研究對象，探究CCEs對LPS誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1小鼠的來源C57 BL/6小鼠從南京模式動物研究所購買(N000013)，之后飼養(yǎng)在贛南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1茶枯餅提取物的提取和純化CCEs的提取和純化根據(jù)文獻描述的方法[16-17]。取油茶籽粕(油茶籽榨取完油后的茶餅),碎粉,過60目篩,加入6倍量的濃度為75%的乙醇溶液回流提取2.5 h。剩余殘渣加入4倍量的濃度為75%的乙醇溶液回流提取2 h。然后合并乙醇提取液。將提取液濃縮到原體積的1/5,逐步加入丙酮至不再產(chǎn)生明顯沉淀(約為2倍量),放置過夜。濾取沉淀,在50 ℃下,邊振邊搖加入70%甲醇至剛好溶解,過濾,濾液置于5 ℃左右的環(huán)境中靜置8 h以上,濾取結(jié)晶,得CCEs粗品。取CCEs粗品,過D-101型大孔樹脂,10%、30%、50%、70%的乙醇溶液洗脫,TCL檢識,得CCEs精制品。

1.2.2BMDM的培養(yǎng)根據(jù)文獻的方法[18], 取得骨髓細胞，培養(yǎng)在有L-細胞液體的IMDM加入10% FBS、1%的非必需氨基酸和1%的盤尼西林-鏈霉素, 培養(yǎng)5 d制備BMDM。我們將使用0、30和50 μg·mL-1SQS處理BMDM 12 h，然后用LPS刺激，在0、10、30、60和120 min后收集細胞，用Western-blot測定NF-κB的激活水平。在0、1、4和8 h后收集細胞，測定細胞因子mRNA表達水平。

1.2.3PCR測定目標基因表達在特定時間收集樣品，使用Trizol提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 然后通過目標基因如細胞因子的特定引物使用Sybergreen試劑盒檢測基因表達情況。

2 結(jié) 果

2.1LPS刺激BMDM的合適時間點測定為了研究CCEs能否抑制NF-κB信號通路和促炎癥細胞因子產(chǎn)生，我們按照文獻方法[19-20]利用LPS刺激下的BMDM來研究。我們探究了LPS刺激BMDM細胞的最適時間與CCEs能夠影響LPS刺激的BMDM細胞的最適濃度。我們首先采用1 μg·mL-1的LPS分別刺激BMDM細胞1、2、 4、8和16 h，細胞數(shù)量為1×106每組，Control組未受LPS刺激。收細胞后用PCR測白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、角質(zhì)細胞趨化因子(KC)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達水平，發(fā)現(xiàn)炎癥細胞因子IL-6, TNF-α均在LPS刺激4 h時存在炎癥因子峰值，并且抗氧化指標因子iNOS在8 h后呈現(xiàn)下降趨勢。各炎癥細胞因子峰值均出現(xiàn)在LPS刺激4 h或4 h之前，故本次實驗選用4 h之前為LPS刺激BMDM的合適時間點(圖1)。

2.2LPS刺激BMDM的合適CCEs濃度測定首先，將CCEs分別稀釋為0.625、1.25、2.5、 5、10、20和40 μg·mL-1，分別刺激1×106BMDM 12 h，之后再用濃度為1 μg·mL-1的LPS刺激4 h，其中Control組為未加CCEs與LPS，LPS組為未加CCEs只加LPS，收細胞后用PCR測IL-6和 TNF-α的表達水平。結(jié)果顯示，當(dāng)CCEs濃度大約在0.6～1 μg·mL-1左右時，IL-6、TNF-α細胞因子表達水平較單純LPS刺激有低的趨勢，但在高濃度時候，細胞因子表達均處在上升階段，這也可能與細胞過量刺激有關(guān)，因此我們選取CCEs濃度為0.625～2.5 μg·mL-1為刺激BMDM的合適濃度(圖2)。

2.3CCEs對LPS刺激的BMDM細胞因子表達的影響當(dāng)選定出了LPS的最佳刺激時間與CCEs最佳刺激濃度后，為了更加系統(tǒng)全面的研究CCE對于促炎癥細胞因子產(chǎn)生的影響，我們將CCEs濃度分為3組，其中0.5 μg·mL-1為低濃度組(CCEs-L)，1 μg·mL-1為中濃度組(CCEs-M)，2 μg·mL-1為高濃度組(CCEs-H)。之后，我們將3組CCEs濃度分別刺激細胞數(shù)為1×106的BMDM細胞12 h之后， 再用1 μg·mL-1LPS刺激4 h，使用PCR測定各類經(jīng)典炎癥細胞因子，其中未加CCEs與LPS刺激設(shè)為對照組，單純LPS刺激4 h設(shè)為LPS組。收細胞后用PCR測相關(guān)經(jīng)典炎癥細胞因子IL-6、TNF-α、KC和單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)的表達水平。經(jīng)綜合對照后發(fā)現(xiàn)，3組CCEs濃度刺激中，IL-6、TNF-α、KC、MCP-1炎性細胞因子表達水平與LPS組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，也未出現(xiàn)劑量效應(yīng)。這些研究結(jié)果表明，CCEs在LPS刺激后的BMDM細胞中沒有明顯的抑制炎癥效果(圖3、表1)。

所有LPS刺激組均與Control組比較， ***P<0.001；****P<0.0001。

所有LPS+CCEs刺激組均與Control組比較，*P<0.05；***P<0.001；****P<0.0001。

圖3 CCEs對LPS刺激的BMDM細胞因子表達的影響

組別IL-6TNF-αKCMCP-1Control0.00004±0.00001?0.00458±0.00005??0.00006±0.00000?0.04160±0.00283?LPS0.05508±0.061520.53990±0.011840.05618±0.028450.70740±0.15940LPS+CCEs-L0.08681±0.10490#0.58170±0.22780#0.05414±0.00692#0.81950±0.25590#LPS+CCEs-M0.04192±0.04164#0.47780±0.06635#0.04834±0.03528#0.61320±0.09711#LPS+CCEs-H0.06648±0.07233#0.59100±0.09551#0.06552±0.03937#1.06600±0.13400#F0.484409.297001.82112.19

注：與LPS組比較，*P<0.05；**P<0.01；#表示差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

研究表明，許多植物中茶多酚和茶皂素能夠抑制NF-κB信號通路和相關(guān)促炎癥細胞因子來抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展。油茶三萜醇等油茶果提取物能夠抑制十四酰佛波乙酯所誘導(dǎo)的小鼠耳炎[21]；油茶根提取物能夠通過環(huán)氧酶與脂肪氧合酶通路抑制花生四烯酸誘導(dǎo)的大鼠的爪部水腫[22]。在我們的研究中，通過參考文獻，先用最適濃度的油茶餅提取物與BMDM細胞共培養(yǎng)，然后用LPS刺激，CCEs并沒有產(chǎn)生預(yù)想的抑制炎癥效果，各濃度組CCEs與LPS組在炎癥細胞因子表達水平上并未出現(xiàn)明顯差別，因此推測CCEs在LPS刺激的BMDM細胞中并未產(chǎn)生相應(yīng)抑炎影響。我們分析出現(xiàn)這種情況的可能原因是因為我們本次CCEs采用油茶中榨油殘渣茶枯餅所得，而文獻中多采用植物的籽、莖、根、果等提取，可能后者提取物抗炎成分相對較充足。另外，我們本次實驗采用75%乙醇溶劑提取CCEs，而在其它文獻中提取方法各異，而在兩次實驗中[21-22]均采用甲醇溶劑提取油茶果或根所得提取物。提取部位、溶劑和提取時間的不同都能影響提取物成分的不同?？墒牵臀覀兡壳暗难芯織l件下，75%乙醇所提取的茶枯餅提取物并不能在LPS刺激的BMDM細胞中產(chǎn)生抑制炎癥的作用。