農(nóng)藥殘留免疫分析技術(shù)研究進展

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(1.黑龍江大學(xué),農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心,黑龍江哈爾濱 150500;2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150080)

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和糧食生產(chǎn)中需要使用農(nóng)藥等化學(xué)物質(zhì),但這些化學(xué)物質(zhì)的不合理或過度使用對人類和生物體造成嚴重危害,引起嚴重的環(huán)境和食品安全問題[1-2]。目前有機磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在市場上應(yīng)用廣泛,特別是有機磷類殺蟲劑仍在生產(chǎn)上起主導(dǎo)作用。近年來,在各種基質(zhì)中農(nóng)藥的檢測取得了許多進展[3],如高效液相色譜(HPLC)[4-5]、氣相色譜(GC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[6-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[10-11]等。這些方法精密度與靈敏度很高,但對檢測人員技術(shù)要求高,設(shè)備昂貴,前處理過程復(fù)雜費時,不適用于現(xiàn)場快速檢測。免疫分析方法樣品前處理簡單、結(jié)果呈現(xiàn)快速、現(xiàn)場攜帶方便,受到越來越多的關(guān)注。本文將對免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用及研究進展進行綜述,以期為農(nóng)藥殘留快速檢測工作提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 標記免疫分析技術(shù)

標記免疫分析一般是將酶、熒光素等標記物對抗體或抗原進行標記,保持抗體或抗原的活性的同時也不影響標記物的活性,當相應(yīng)抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)后,可以直接測定復(fù)合物中的標記物而對目標物質(zhì)進行定量分析。標記物的信號放大作用可以提高免疫分析技術(shù)的敏感性[12]。檢測領(lǐng)域的免疫分析標記方法主要有酶標記、納米金標記、免疫熒光標記等。

1.1 酶聯(lián)免疫吸附分析

酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是將已知抗原或抗體結(jié)合到如聚苯乙烯等固相載體表面,利用抗原抗體結(jié)合的特異性,使酶標記的抗原抗體在固相表面進行反應(yīng)。

圖1 酶聯(lián)免疫分析檢測技術(shù)分類Fig.1 Classification of ELISA techniques

檢測農(nóng)藥酶聯(lián)免疫方法多數(shù)為競爭ELISA和間接競爭ELISA(圖2)。

圖2 競爭(a)和間接競爭ELISA(b)原理圖Fig.2 Competitive(a)and indirect competition ELISA schematic

采用針對某一抗原表位的單克隆抗體進行阻斷ELISA試驗,大大提高了ELISA的特異性,加上電腦化程度極高的ELISA檢測儀的使用,使ELISA更為簡便實用和標準化,從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢測方法之一。何方洋等[13]針對快速檢測蔬菜、茶葉中呋喃丹殘留通過合成呋喃丹半抗原,并與載體蛋白偶聯(lián)合成人工抗原,制備其單克隆抗體,建立的酶聯(lián)免疫檢測方法對蔬菜、茶葉樣本的檢測限分別為10、5 μg/kg,加標回收率為79.2%～102.7%。Zhu等[14]對比了三種ELISA形式(抗原包被、抗體包被和二抗包被),從三種ELISA形式生成的標準曲線可以看出,抗體包被形式具有最好的標準曲線,抗體包被和二抗包被形式之間的靈敏度差異并不顯著,但二抗包被形式變異系數(shù)最小;基于標準曲線的靈敏度和可重復(fù)性考慮,選擇二抗包被形式對于加標樣品進行檢測,檢出限為3.44 ng/mL,回收率為85.24～106.9%。Watanabe等[15]針對土壤中三種水溶性(植物可利用)新煙堿類殺蟲劑(呋蟲胺,噻蟲胺和吡蟲啉)開發(fā)了一種簡單、快速的基于試劑盒ELISA的定量檢測方法,可用水直接提取待測物,該方法測定的IC50值分別為:呋蟲胺3 ng/mL、噻蟲胺1.8 ng/mL、吡蟲啉2.2 ng/mL,但與結(jié)構(gòu)相關(guān)的新煙堿類似物發(fā)生交叉反應(yīng),可能產(chǎn)生假陽性。

通常一種抗體只能檢測單種農(nóng)藥,難以滿足一次檢測同時檢出多種農(nóng)藥的需求[16]。為了解決這一問題,Xu等[17]通過廣譜特異性直接競爭ELISA快速篩選出多個陽性樣品,結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)對陽性樣品進行定性和定量,基于辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體和固相萃取的直接競爭ELISA可同時分析42個樣品,同時進行12個有機磷農(nóng)藥的檢測,在40 min內(nèi)完成檢測,檢測限為20 μg/L,回收率為70.0%～133.3%,具有良好的準確性和重現(xiàn)性。文孟棠等[18]針對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥制備了廣譜性抗體,建立了用于蔬菜中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的檢測的半定量ELISA 免疫檢測方法,以間苯氧基苯甲酸為半抗原,分別用活性酯法、混合酸酐法和6-氨基己酸法三種方法偶聯(lián)OVA制備出的3種包被抗原;該方法可在45 min內(nèi)同時完成多種農(nóng)藥的檢測,IC50為6.30 μg/ml。該方法具備對大量樣品快速初篩的應(yīng)用潛力,但只適用于半定量,其結(jié)果的準確性和重現(xiàn)性有待提高。

1.2 納米金標記

膠體金側(cè)向流免疫層析試紙條是納米金標記應(yīng)用最廣的手段之一,是一種低成本、易操作、快速的測定和篩選的用戶友好型測量工具[19]。堿性條件下,帶負電荷的膠體金與帶正電荷基團的蛋白質(zhì)分子通過靜電力的作用而牢固地結(jié)合。以硝酸纖維素膜為載體,滴加在膜條樣品墊上的待測樣品通過毛細管的作用慢慢向另一端滲移,通過抗原抗體結(jié)合,并利用膠體金呈現(xiàn)顏色反應(yīng),檢測抗原/抗體。農(nóng)藥屬于小分子物質(zhì),基于試紙條檢測時多采用競爭法,如圖3所示。

圖3 膠體金側(cè)向流免疫層析試紙條競爭法原理圖Fig.3 Competition method schematic of colloidal goldlateral flow immunochromatographic test strip

1.2.1 單一物質(zhì)檢測試紙條 為了快速簡便地檢測出食品中的農(nóng)藥殘留,王菡等[20]制備出抗廣譜有機磷農(nóng)藥的組特異性單克隆抗體,鞣酸-檸檬酸三鈉還原法制備膠體金標記單克隆抗體,組裝膠體金免疫層析試紙條,建立了對有機磷農(nóng)藥的快速檢測方法。該方法對毒死蜱檢測限為4 μg/mL,檢測時間僅需5 min。3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)是合成擬除蟲菊酯的一般代謝產(chǎn)物,可以用作擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留物的通用生物標志物,Liu等[21]通過使用PBA-BSA作為免疫原制備針對3-PBA的單克隆抗體,建立基于膠體金的側(cè)向流動免疫測定試紙條。在不需要任何樣品預(yù)處理情況下10 min可完成檢測,檢測限為1 μg/mL。這種側(cè)向流動免疫測定可用于監(jiān)測環(huán)境樣品中3-PBA或擬除蟲菊酯殘留物。

表1 酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)與膠體金側(cè)向流免疫層析技術(shù)在農(nóng)藥殘留快速檢測中的應(yīng)用Table 1 Application of enzyme-linked immunosorbent assay and colloidal gold lateralflow immunochromatography in rapid detection of pesticide residues

注:/代表文獻中未提及。1.2.2 多重免疫檢測試紙條 在檢測單個待測物的基礎(chǔ)上,Xu等[22]將納米膠體金標記的吡蟲啉和噻蟲嗪單克隆抗體固定于結(jié)合墊,吡蟲啉-BSA、噻蟲嗪-BSA和山羊抗小鼠IgG的結(jié)合物分別用作兩條測試線和控制線,可在一個條帶上同時篩選農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉和噻蟲嗪。Shu等[19]制備了能夠同時識別甲基對硫磷和吡蟲啉的新型雙功能抗體,開發(fā)了基于時間分辨化學(xué)發(fā)光策略的多重免疫色譜測試條,用于定量檢測農(nóng)藥殘留。該方法將辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶分別標記甲基對硫磷和吡蟲啉的半抗原,由于兩種酶不同的動力學(xué)特征,可在2.5和300 s收集甲基對硫磷和吡蟲啉檢測的信號。該方法可以在單個測試線上實現(xiàn)多重免疫測定。

1.2.3 試紙條結(jié)合光譜 ICA技術(shù)雖然可實現(xiàn)農(nóng)藥的現(xiàn)場快速檢測,但該方法是半定量的并且靈敏度低。因此,開發(fā)高靈敏度檢測新型ICA產(chǎn)品是該技術(shù)發(fā)展方向。表面增強拉曼光譜(Saurface enhancement of Raman scattering,SERS)由于其超靈敏特性而在生物檢測中開始興起。SERS可以將吸附在Ag或Au金屬納米結(jié)構(gòu)上,目標物拉曼信號增強多達6到14個數(shù)量級,甚至可以檢測單個分子[23-24]。ICA技術(shù)可以通過NC膜和膠體金為紐帶與SERS技術(shù)有機結(jié)合,實現(xiàn)對目標物高靈敏檢測。Li等[25]在試紙條的基礎(chǔ)上開發(fā)了基于SERS的免疫色譜測定方法,可用于檢測兩種擬除蟲菊酯農(nóng)藥(氯氰菊酯和氰戊菊酯)。在抗體綴合的膠體金顆粒上添加了拉曼標記分子,通過在試紙條上固定檢測兩種農(nóng)藥的兩條測試線,完成了同時雙重檢測,檢測測試線上的SERS信號對待測物進行定量分析。靈敏度比使用相同間接競爭性免疫測定方法的ELISA和ICA方法高3～4倍。該方法將ICA與SERS有機結(jié)合,在保留傳統(tǒng)ICA簡便、快捷等優(yōu)點的基礎(chǔ)上,實現(xiàn)了對待測物的定量檢測,而且獲得了極低的檢出限。

1.2.4 ELISA與試紙條對比 酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)與膠體金側(cè)向流免疫層析技術(shù)因其方便快速、高特異性、應(yīng)用范圍廣等有點得到廣泛應(yīng)用。如表1所示,膠體金側(cè)向流免疫層析技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)相比所需的檢測時間更短,成本低,標記物穩(wěn)定,適合大批量的初篩檢查。膠體金本身為紅色,無需加入發(fā)色試劑、酶標的致癌性底物及終止液。而電腦化程度極高的ELISA檢測儀的使用,使ELISA更為標準化。

1.2.5 納米金結(jié)合生物條形碼技術(shù) 隨著納米技術(shù)領(lǐng)域快速發(fā)展,生物條形碼技術(shù)已成為新的診斷工具,并逐漸被用于蛋白質(zhì),核酸靶標和小分子化合物的超靈敏檢測[26]。生物條形碼技術(shù)是利用磁場作用使“金納米顆粒-目標物-磁納米顆?！睆?fù)合物聚合,之后釋放金納米顆粒表面的寡聚核苷酸以達到信號放大的目的,從而實現(xiàn)對目標物的檢測,應(yīng)用于食品安全和傳感檢測領(lǐng)域[27]。Du等[28]提出了一種新型免疫測定法檢測三唑磷。該方法基于生物條形碼擴增競爭性免疫分析,并以微孔板方法量化條形碼鏈進行目標物的定量分析。利用兩種探針檢測三唑磷,分別是:針對三唑磷的單克隆抗體和數(shù)百個硫醇化單鏈寡核苷酸條形碼雙標記的AuNPs;人工抗原標記的磁性微粒。標記在磁性微粒上表面的抗原與三唑磷競爭標記在AuNPs表面的單克隆抗體。用磁選法去除多余的農(nóng)藥和探針,通過添加二硫蘇息醇釋放條形碼。隨后,半互補生物素化DNA和單標記AuNP探針與雜交條形碼以三明治形式捆綁,通過鏈霉抗生物素蛋白-生物素將雜交復(fù)合物固定在微孔板上。最后,通過微孔板讀數(shù)器記錄金納米顆粒的銀增強信號,檢出限為1.96×10-2ng/mL。在這種方法中,少量的目標已經(jīng)轉(zhuǎn)換成大量條形碼鏈而是信號顯著放大,靈敏度高,特異性強。此外,在沒有專用儀器的情況下可通過微孔板讀數(shù)器檢測結(jié)果。

1.3 免疫熒光分析技術(shù)

免疫熒光分析技術(shù)是將熒光物質(zhì)標記到抗原或抗體上,與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后通過檢測熒光強度確定待測物濃度的一種檢測方法。熒光具有獨特的發(fā)光特性,可大大減少背景信號并顯著提高靈敏度[29]。Zhang等[30]為了提高測定準確度,使用具有時間分辨熒光特征的銪顆粒來降低背景信號,將呋喃丹特異性抗體與銪顆粒結(jié)合固定于測試線(T),將小鼠IgG與銪顆粒結(jié)合固定于對照線(C)。建立呋喃丹濃度與T/C比之間的定量關(guān)系以確定分析物濃度。LOD為0.04～0.76 mg/L,農(nóng)產(chǎn)品中呋喃丹的加標回收率為81%～103%,結(jié)果與標準HPLC方法一致。Zhang等[31]開發(fā)并驗證了使用多重修飾的金納米顆粒和熒光擴增進行三唑磷檢測。用單克隆抗體和6-羧基熒光素標記的單鏈硫醇-寡核苷酸修飾通過AuNP淬滅6-羧基熒光素的熒光。將OVA連接的半抗原包被在微孔板的底部與樣品中的三唑磷競爭結(jié)合AuNP探針上的抗體,熒光強度與分析物濃度成反比。本方法成功應(yīng)用于水、蔬菜、水果和谷物中的三唑磷檢測,IC50可達0.25 mg/L,且工作范圍廣。該研究中的競爭性熒光生物條形碼免疫測定提供了小分子檢測模型。

大多數(shù)有機熒光分子都受到聚集引起的猝滅的影響,其在高濃度或固態(tài)下的熒光效率大大降低。Peng等[32]發(fā)現(xiàn)了一組具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)特征的熒光分子。與常規(guī)熒光團相比,這種分子在聚集狀態(tài)下表現(xiàn)出強熒光。其獨特的性能為AIE探針提供了顯著的優(yōu)勢,例如較低的背景和較高的光穩(wěn)定性[33]。四苯乙烯(TPE)是一種AIE代表性分子,Cai等[29]合成了TPE衍生物,根據(jù)其AIE效應(yīng)表征其結(jié)構(gòu)并敏感地檢測pH。在乙酰膽堿酯酶存在下,乙酰硫代膽堿碘化物可以水解產(chǎn)生乙酸,改變?nèi)芤旱膒H,從而影響熒光。因有機磷可以抑制乙酰膽堿酯酶的酶促能力,從而可以間接實現(xiàn)有機磷的熒光檢測,檢出限為0.008 mg/L,為pH敏感熒光探針的設(shè)計提供了新的方法。

量子點作為一種新型的熒光標記材料,因其具有較好的熒光特性,廣泛應(yīng)用于發(fā)光生物探針領(lǐng)域量,以用來提高檢測靈敏度[34]。胡華軍等[35]將抗克倫特羅多克隆抗體連接到已合成的CdTe/ZnSe核殼量子點上,將該偶聯(lián)物作為指示克倫特羅分子的熒光標記物,制備出檢測克倫特羅分子的免疫層析試紙條,其最低檢測量可達1 μg/L。定量檢測的量子點試紙條靈敏度比膠體金免疫層析試紙條要高,逐漸成為免疫層析分析技術(shù)研究的熱點[36]。

2 免疫傳感器

免疫傳感器是基于轉(zhuǎn)換器表面上的抗體和抗原之間的相互作用的生物傳感器。抗體或抗原都可以是固定在換能器上以檢測抗原或抗體的物種[37]。生物傳感器由于其靈敏高、選擇性好、分析速度快、成本低等優(yōu)點在農(nóng)殘檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速[38]。

2.1 電化學(xué)免疫傳感器

電化學(xué)免疫傳感器探索在電化學(xué)轉(zhuǎn)換器上產(chǎn)生的電信號的測量。韓恩等[39]開發(fā)了一種免標記電化學(xué)免疫傳感器用于多種蔬菜樣品中呋喃丹的快速、高靈敏檢測。呋喃丹分子通過特異性的免疫反應(yīng)在抗體功能化電極表面生成免疫復(fù)合物,阻礙了電化學(xué)探針在電極表面的電子傳遞,減小了該免疫傳感器的電流響應(yīng)。通過電流響應(yīng)的變化和農(nóng)藥分子濃度的關(guān)系可以實現(xiàn)被測物的檢測。在優(yōu)化的試驗條件下,該免疫傳感器對呋喃丹農(nóng)藥表現(xiàn)出了較為寬廣的濃度檢測范圍(1～105μg/L)和較低的檢測下限(1 μg/L)。Valera等[40]制備了百草枯特異性抗體,利用帶有半導(dǎo)體納米晶和抗原生物功能化磁珠的抗體,使用石墨復(fù)合電極進行電化學(xué)測量,用于百草枯的檢測。免疫化學(xué)反應(yīng)后,半導(dǎo)體納米晶被溶解,釋放的金屬離子在電極上被還原,讀取電荷信號。由于半導(dǎo)體納米晶對庫倫信號的放大效應(yīng),使其具有很高的檢測能力。Mehta等[41]基于功能化石墨烯量子點的絲網(wǎng)印刷電化學(xué)免疫傳感器,用于檢測對硫磷。該免疫傳感器對對硫磷的動態(tài)線性響應(yīng)為0.01～106ng/L,檢測限為46 pg/L。在保持極低檢出限的基礎(chǔ)上,石墨烯量子點的應(yīng)用提高了傳感器的穩(wěn)定性,響應(yīng)再現(xiàn)性和可再現(xiàn)性。Zon等[42]將非競爭性免疫檢測和磁電化學(xué)免疫傳感器檢測相結(jié)合,開發(fā)了新的噬菌體抗免疫復(fù)合物電化學(xué)免疫傳感器,用于定量檢測阿特拉津。該方法檢出限為0.2 pg/mL,比常規(guī)競爭ELISA中相同抗體得到的檢出限要好200倍。Talan等[43]基于膠體金技術(shù)研制了新型氟摻雜氧化錫電極(FTO)納米傳感器可實現(xiàn)毒死蜱農(nóng)藥的快速靈敏檢測。將金納米粒子固定在FTO表面以固定抗毒死蜱抗體,同時金納米粒子與FTO的協(xié)同作用可以使Ag-抗體相互作用的信號放大。AuNPs提供高電導(dǎo)率和電阻率,從而提高免疫測定的靈敏度,同時抗體提高了傳感器的特異性。該傳感器的線性范圍為1 fmol/L至1 μmol/L,LOD高達10 fmol/L。金納米粒子和FTO等智能元件的耦合提供了更好的傳感平臺,從而顯著改善了農(nóng)藥的檢測范圍。

而與水溶液相比,許多農(nóng)藥更易溶于有機溶劑或溶劑混合物,為了解決這一問題,Martini等[44]開發(fā)了用于有機溶劑混合物的新型免疫傳感器用于分析農(nóng)藥,可在疏水基質(zhì)中檢查痕量的農(nóng)藥。使用Clark電極作為轉(zhuǎn)導(dǎo)物,過氧化物酶作為標記物。競爭過程在氯仿-己烷50%(V/V)混合物中進行,而隨后的酶促最終測量在癸烷中進行并使用叔丁基過氧化氫作為酶促反應(yīng)的底物。通常在橄欖油存在下獲得約10 nmol/L至5.0 μmol/L的線性響應(yīng)。

2.2 表面等離子共振傳感器

在過去的幾十年中,表面等離子共振(Surface plasmon resonance,SPR)生物傳感器因其可實時、原位和動態(tài)觀測各種生物分子而受到越來越多的關(guān)注[45]。SPR方法基于與樣品中分析物分子結(jié)合相關(guān)的折射率變化的光學(xué)測量,以識別固定在SPR傳感器上的分子[46]。該技術(shù)已被廣泛用于研究DNA-蛋白質(zhì)、抗體-微生物、抗體-抗原等之間的相互作用。與ELISA方法相比,SPR方法操作簡單,檢測快速,樣品消耗低[47]。Gouzy等[48]將抗異丙隆-鼠單克隆抗體固定在SPR芯片表面,應(yīng)用競爭法對異丙隆進行檢測,檢出限為0.1 μg/L。該實驗中抗鼠(k鏈)單克隆抗體在保持抗體活性的同時可循環(huán)再生120次。宋洋等[49]使用SPR傳感器檢測亞胺硫磷,檢測時間為30 min,最低檢出限為0.1 μg/L。SPR反應(yīng)芯片在3 d內(nèi)可反復(fù)檢測30次,有效降低了檢測成本。Guo等[50]使用直接SPR生物傳感器進行三唑磷痕量檢測的非競爭性免疫測定。將兩種抗三唑磷單克隆抗體固定在傳感器芯片上,并通過基于SPR的動力學(xué)分析進行表征。具有相對慢的解離速率的單克隆抗體用于三唑磷的直接免疫傳感。該方法可用于測定加標環(huán)境水和農(nóng)產(chǎn)品中的三唑磷,以及未知的現(xiàn)實樣品(包括大白菜,黃瓜和蘋果),檢出限為0.096 ng/mL。與酶聯(lián)免疫方法相比,SPR方法在檢測限、精確度、靈敏度等方面有著一定優(yōu)勢,但對于單殘留樣品的檢測,在時間上不具有明顯優(yōu)勢,更適合于高通量、多殘留的檢測。

2.3 新型免疫傳感器

2.3.1 光纖免疫傳感器 近年來,光纖免疫傳感器由于具有很高的靈敏度,成本效益和實時快速檢測等優(yōu)勢而受到廣泛關(guān)注,Tang等[51]通過使用基于間接競爭免疫測定的光纖免疫傳感器,開發(fā)了一種快速靈敏的鄰苯二甲酸酯(PAEs)檢測方法。該傳感器通過光纖表面與涂層抗原共價結(jié)合構(gòu)建,并通過雪崩光電二極管檢測PAEs對涂層抗原與熒光標記抗體之間免疫反應(yīng)的抑制信號。8種PAEs的檢測限范圍為19～51 ng/L,加標平均回收率為61.5%～106.7%,所得結(jié)果與氣相色譜-質(zhì)譜法得到的結(jié)果一致。該光纖免疫傳感器具有良好的再生性能,重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和較寬的線性范圍,靈敏度高,檢測PAEs檢測時間短的特點,已成功應(yīng)用于溫室土壤中多種PAEs的測定。

2.3.2 無標記免疫傳感器 在無標記方法中,固定化受體優(yōu)先結(jié)合靶分子,并直接測量換能器表面上產(chǎn)生的物理性質(zhì)變化。與依賴性標記免疫檢測方法相比,這種無標記的直接檢測方法具有簡單、成本低、響應(yīng)實時等優(yōu)點,是免疫傳感器的一個重要優(yōu)勢[52]。

2.3.2.1 晶體管免疫傳感器 Belkhamssa等[53]針對于快速測定阿特拉津建立了一種無標記免疫傳感器,該免疫傳感器利用單壁碳納米管(SWCNT)充當導(dǎo)體通道,結(jié)合場效應(yīng)晶體管(FET)構(gòu)成碳納米管場效應(yīng)晶體管(CNTFET)。免疫反應(yīng)的原理在于將阿特拉津特異性抗體直接吸附到SWCNT網(wǎng)絡(luò)上,CNTFET可用作檢測阿特拉津的有用的無標記平臺。在最佳條件下,檢測限為0.001 ng/mL。加標平均回收率為87.3%～108.0%。SWCNT是一維納米結(jié)構(gòu),由于其表面存在的碳原子顯示出高電子轉(zhuǎn)移反應(yīng),因此,巨大的表面積以及不同分子功能化的可能性使其成為理想的傳感器,用于特異性檢測各種分析物甚至病毒。

2.3.2.2 微懸臂梁免疫傳感器 Dai等[54]報道了一種基于微懸臂梁的免疫傳感器可用于檢測呋喃丹,且無需用熒光或放射性分子標記。該工作的分析原理基于抗體-抗原復(fù)合物的形成,并且它可以降低電極和電活性探針分子之間的電子轉(zhuǎn)移速率,導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移電阻的進一步增加。測量免疫前后的電子轉(zhuǎn)移抗性的差異以實現(xiàn)靶分析物的感測。通過使用單克隆抗體將呋喃丹作為受體分子,定量檢測呋喃丹,檢出限為0.1 ng/mL。但其體積大或使用位置敏感激光器的復(fù)雜檢測方法,使其不易配置,不易快速檢測。

2.3.2.3 諧振器免疫傳感器 為了實現(xiàn)快速靈敏的檢測,Wang等[52]開發(fā)一種基于薄膜體聲諧振器的高靈敏度免標記免疫傳感器,將人工抗原固定在諧振器的傳感表面上,采用競爭形式進行免疫測定。通過測量諧振器頻率變化實時觀察競爭性免疫反應(yīng),獲得的對硫磷的超低檢測限低至0.08 μg/L。所提出的免疫傳感器是一種快速方便的檢測方法,具有與氣相色譜相當?shù)母呔取?/p>

3 仿生免疫

單克隆和多克隆抗體穩(wěn)定性差而且壽命短?？茖W(xué)家們設(shè)計并合成了人工抗體代替天然抗體,以試圖克服這些問題。通過分子印跡技術(shù)來獲得人工抗體的方法引起了人們很大的關(guān)注。近年來已經(jīng)報道了許多仿生酶聯(lián)免疫吸附測定方法,這些方法提高了識別能力并降低了成本[55]。Li等[56]使用聚合物材料作為仿生抗體,開發(fā)了一種仿生免疫測定-毛細管電泳方法,檢出限為0.16 mg/L;將仿生免疫分析技術(shù)與毛細管電泳結(jié)合,可以在利用仿生免疫分析特異性的同時,具備毛細管電泳高分離效率的特點,以此提高仿生免疫分析的靈敏度和準確性。

分子印跡聚合物是一種含特異性識別位點的高分子材料,因為它的高穩(wěn)定性、低成本、制備簡單和可重復(fù)利用等特點,常被作為仿生抗體應(yīng)用于免疫分析[57]。由于結(jié)構(gòu)可預(yù)測性,識別特異性和應(yīng)用普遍性的獨特特征,分子印跡技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域[58]。Liu等[55]建立了一種基于分子印跡聚合物的直接競爭仿生免疫吸附測定方法,用于韭菜和黃瓜樣品中敵百蟲殘留的測定。使用CdSe/ZnS量子點標記作為標記。在96孔板表面合成親水印跡薄膜,并通過傅里葉變換紅外光譜和熱重分析進行表征。通過該方法提取并測定加入敵百蟲的菠菜和油菜樣品回收率為83.6～91.1%,檢出限為0.1 mg/kg。該方法中,代替抗體的印跡膜是穩(wěn)定的,但識別能力明顯低于生物抗體。

上述兩種仿生免疫方法檢測的結(jié)果與氣相色譜法都呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。

4 總結(jié)與展望

免疫分析檢測技術(shù)是基于抗原抗體特異性結(jié)合建立的,常用的ELISA具有較好的準確性和重復(fù)性,但檢測過程中仍需大量的孵育時間;膠體金側(cè)向流免疫層析技術(shù)操作簡單,無需專業(yè)人員操作,檢測結(jié)果可快速呈現(xiàn),不需要大型儀器,攜帶方便適用于現(xiàn)場檢測。但該方法仍存在一定的局限性,如靈敏度和精確度普遍較低,大多用于半定量及定性檢測。相對來說,結(jié)合光譜定量可在實現(xiàn)快速檢測的同時大大提高其精確度和靈敏度。而隨著分子印跡技術(shù)、基因重組技術(shù)、表面等離子共振技術(shù)的快速發(fā)展,與之相結(jié)合來建立高精確度、高靈敏度的免疫檢測方法,實現(xiàn)農(nóng)藥多殘留的檢測成為免疫分析檢測技術(shù)新的發(fā)展方向。因此,在保留免疫分析技術(shù)自身優(yōu)勢的基礎(chǔ)上不斷進行完善,會使其在農(nóng)藥殘留的快速檢測方面發(fā)揮越來越重要的作用。