山刺玫果多糖抗疲勞及抗氧自由基水平機制研究

秦汝蘭1,關(guān)穎麗1,呂重寧

(1.通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院,吉林通化 134002;2.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院,遼寧沈陽 110016)

山刺玫果多為球形或卵形,又名刺玫果,野薔薇果,為薔薇科屬山刺玫(RosadavuricaPall.)的成熟果實。因其酸甜可食,營養(yǎng)豐富,在民間深受喜愛,常用于泡茶、泡酒等,是一種高營養(yǎng)價值、藥食同源的野生果類。其分布廣泛,在中國的東北、內(nèi)蒙古、山西、河北等地區(qū)均有生長[1]?，F(xiàn)代研究表明,山刺玫果中含有豐富的維生素、多糖、黃酮、皂苷等成分,具有預(yù)防心血管疾病,抗氧化,提高免疫力等功效?；诖堂倒臓I養(yǎng)價值,以其為主要原料開發(fā)的食品、保健品和功能性飲品受到廣泛關(guān)注[2-4]。

多糖是以醛糖或酮糖通過糖苷鍵鏈接成高分子化合物,所以又稱為多聚糖。經(jīng)實驗研究發(fā)現(xiàn),多糖不僅具有抗氧化、抗腫瘤等作用,尤其在抗疲勞方面,表現(xiàn)出顯著的功效。石娟等[5]研究發(fā)現(xiàn),黃精粗多糖有利于延長小鼠負重游泳時間,同時能夠降低運動后小鼠血清尿素氮含量及增加小鼠肝糖原含量。此外,黃精粗多糖亦可顯著降低溴苯所致小鼠肝損傷的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量、增加過氧化物歧化酶GSH-Px含量;梁啟超等[6]研究發(fā)現(xiàn)玫瑰花多糖能夠在顯著提高衰老小鼠血清和肝組織中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活力的同時,顯著降低丙二醛含量,表現(xiàn)出良好的體內(nèi)抗氧化活性;王維[7]研究發(fā)現(xiàn),黃蘑多糖在減緩疲勞和清除氧自由基方面也具有較好的作用,能夠顯著延長小鼠的力竭游泳時間、顯著降低血乳酸含量,加快運動后小鼠體內(nèi)血乳酸的消除速度,提高小鼠全血中超氧化物歧化酶活性,降低丙二醛含量。近年來,國外對于植物或菌類藥物中多糖抗氧化作用的研究不斷報道[8-9]。

前期化學(xué)成分以及體外活性實驗研究發(fā)現(xiàn),山刺玫果中含有豐富的多糖且具有顯著的體外抗氧化活性。本文旨在通過檢測小鼠竭游泳時間、轉(zhuǎn)棒時間,血乳酸(BLA)、肝糖原(LG)、肌糖原(MG)、血尿素氮(BUN)含量及肝臟與血清中總抗氧能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物歧化酶(GSH-Px)的活性、丙二醛(MDA)含量,進一步從體內(nèi)藥理方面探討山刺玫果多糖對小鼠抗疲勞作用及抗氧自由基水平的影響,為刺玫果資源進一步的開發(fā)利用提供有利的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山刺玫果 采于通化師范學(xué)院周邊,經(jīng)通化師范學(xué)院于俊林教授鑒定為刺玫果(RosadavuricaPall.);生曬參 購于通化縣人參交易市場,產(chǎn)區(qū)為通化縣,陰干,粉碎備用。BLA(血乳酸)試劑盒;LG(肝糖原)試劑盒;MG(肌糖原)試劑盒;BUN(血尿素氮)試劑盒;T-AOC(總抗氧化能力)試劑盒;SOD(超氧化物歧化酶)試劑盒;GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物歧化酶試)劑盒;MDA(丙二醛)試劑盒 均購于南京建成生物工程研究所;潔凈級健康雄性KM小鼠 150只,體重18～22 g,購于長春高新醫(yī)學(xué)動物實驗研究中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(吉)2017-0004。

KQ-250E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;TGL-16B高速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;Bio-TekELX800酶標(biāo)儀 上海賽默生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山刺玫果多糖的制備 新鮮山刺玫果→陰干→粉碎過20目篩→95%乙醇脫脂3 h→50 ℃烘干→加水提取(提取溫度80 ℃,料液比1∶30,提取時間3 h)→離心→抽濾→取上清液濃縮至原來體積的1/5→加入4倍體積無水乙醇,4 ℃靜置過夜→抽濾→冷凍干燥→山刺玫果粗多糖[10]。

1.2.2 葡萄糖對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品10.02 mg,置于50 mL的容量瓶中,加入蒸餾水溶解并定容至刻度,配制成濃度為0.204 mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液,冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取“1.2.2”項下葡萄糖對照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置于50 mL容量瓶中,蒸餾水稀釋至刻度。取上述各對照品溶液2.0 mL于具塞試管中;加入4%苯酚溶液1.0 mL搖勻;迅速滴加7.0 mL的濃硫酸,搖勻靜置5 min后于40 ℃的水浴中加熱30 min,冷卻至室溫,測定在490 nm波長處的吸光度值[11],以葡萄糖對照品溶液濃度C為橫坐標(biāo),吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=14.575C+0.0141,r=0.9991,結(jié)果表明,葡萄糖對照品溶液在濃度為0.008～0.041 mg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.4 山刺玫果多糖含量測定 準(zhǔn)確稱取“1.2.1”項下得到的山刺玫果粗多糖,用蒸餾水溶解后制成濃度為0.04 mg·mL-1的粗多糖溶液。吸取2 mL粗多糖溶液,按照“1.2.3”項下實驗方法操作,平行3次,按照下列公式計算總多糖含量:

總多糖含量(%)=C1×V1×100/M

式中:C1為樣品中總多糖濃度(mg·mL-1);V1為測定樣品溶液體積(mL);M為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.5 人參水煎液的制備 稱取27 g人參粉末,加入200 mL蒸餾水煎煮30 min,2次,合并濾液配制成濃度為0.135 g·mL-1的溶液,冰箱冷藏放置,備用。

1.2.6 動物分組及給藥方法 將小鼠隨機分為空白組,陽性對照組(0.135 g·mL-1的自制人參水煎液),山刺玫果多糖低劑量組(25 mg·kg-1)、中劑量組(50 mg·kg-1)、高劑量組(100 mg·kg-1),每組8～10只。按照0.1 mL·10 g-1劑量灌胃給予小鼠,空白組灌服等劑量生理鹽水,每日1次,連續(xù)給藥21 d,灌胃期間小鼠自由飲水和攝食。

1.2.7 小鼠負重游泳實驗 第21 d給藥30 min后,將重量為小鼠體重5%的鉛絲附于小鼠尾部,隨后將小鼠放入水槽內(nèi),保持水溫(25±2) ℃,以小鼠放入水槽開始計時,記錄小鼠力竭時間(小鼠完全沉入水面10 s不能上浮的時間為力竭時間)[12]。

1.2.8 小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒實驗 連續(xù)給藥21 d時,進行小鼠疲勞轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練,3次。給藥30 min后,進行轉(zhuǎn)棒實驗,記錄25 r·min-1的轉(zhuǎn)速下,小鼠置于轉(zhuǎn)棒至跌落的時間[13]。

1.2.9 小鼠肌肉中MG及肝臟中LG含量的測定 稱取100 mg“1.2.7”項下取出的各組小鼠肝臟。用生理鹽水沖洗各組小鼠取出的股四頭肌,濾紙吸干,稱取100 mg。小鼠肌肉與肝臟均用錫箔紙包裹,-80 ℃冷藏,備用。測定各組小鼠肌肉及肝臟中MG和LG的含量。

1.2.10 小鼠血清及肝臟勻漿液中SOD、T-AOC、GSH-Px活性及MDA、BLA、BUN含量的測定 各組小鼠經(jīng)口給藥21 d,于末次給藥30 min后,將小鼠置于[(25±2) ℃]

水槽中進行游泳實驗,游泳60 min后取出小鼠,休息10 min后,摘眼球取血,12000 r·min-1離心10 min,得到血清。小鼠按照40 mg·kg-1劑量給予1%戊巴比妥鈉麻醉后,迅速取出肝臟。部分肝臟用生理鹽水按照1∶9比例制成10%的肝臟組織勻漿液,12000 r·min-1離心10 min,取上清液,備用。按要求測定各組小鼠血清及肝臟勻漿液中BUN、BLA、SOD、MDA和T-AOC、GSH-Px活性[14-16]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 山刺玫果多糖含量測定結(jié)果

按照“1.2.4”多糖含量公式計算得出山刺玫果多糖含量為36.2%。

2.2 山刺玫果多糖對小鼠負重游泳時間及轉(zhuǎn)棒時間的影響

如表1所示,通過負重游泳時間的比較可知,與空白對照組相比,山刺玫果多糖低、中、高劑量組的小鼠負重游泳時間均顯著增加(P<0.05),其中,山刺玫果多糖高劑量組和陽性對照組游泳時間均顯著長于空白對照組(P<0.01),表明山刺玫果多糖具有較強的增強疲勞小鼠運動耐力作用。此外,山刺玫果多糖中劑量組和高劑量組的轉(zhuǎn)棒時間均較空白對照組明顯延長(P<0.05),說明山刺玫果多糖具有抗疲勞作用。

表1 山刺玫果多糖對小鼠負重游泳時間及轉(zhuǎn)棒時間的影響Table 1 Effects of polysaccharides on loading swimmingtime and rod turning time in

注:*與空白對照組相比差異顯著(P<0.05),**與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01);圖2～圖5同。

2.3 山刺玫果多糖對小鼠肌肉中LG及肝臟中MG含量的影響

由表2可知,與空白對照組相比,山刺玫果多糖低劑量組對疲勞小鼠肝糖原、肌糖原的儲備量幾乎沒有影響(P>0.05),而中劑量組、高劑量組小鼠肌肉中MG及肝臟中LG含量均明顯增加(P<0.05)。其中高劑量組和陽性對照組肝糖原儲備量增加更為明顯(P<0.01)。實驗結(jié)果表明,山刺玫果多糖在一定程度上具有增強機體肌肉強健力和肝臟活力的作用。

表2 山刺玫果多糖對小鼠LG及MG含量的影響Table 2 Effects of polysaccharides on thecontent of LG and MG in

2.4 山刺玫果多糖對小鼠血清中BUN及BLA含量的影響

由表3數(shù)據(jù)可知,與空白對照組相比,高劑量組小鼠血清中BUN含量明顯降低(P<0.05),其中,陽性對照組小鼠血清中BUN含量降低更加顯著(P<0.01),表明山刺玫果多糖能減少蛋白質(zhì)分解,降低疲勞小鼠血清尿素氮的生成;與空白組比較,山刺玫果多糖中劑量組、高劑量組小鼠游泳后血乳酸濃度均降低(P<0.05),其中陽性組最為明顯(P<0.01),表明山刺玫果多糖能夠降低游泳小鼠血乳酸的生成,加快乳酸代謝。

表3 山刺玫果多糖對小鼠BUN及BLA含量的影響Table 3 Effects of polysaccharides on thecontent of BUN and BLA in

2.5 山刺玫果多糖對小鼠肝臟、血清中SOD活性、MDA含量的影響

表4表明,隨著山刺玫果多糖劑量的增加,小鼠血清及肝臟中SOD活力提高,MDA含量降低。與空白對照組比較,山刺玫果多糖中劑量組及高劑量組小鼠肝臟中SOD活力明顯提高(P<0.05),陽性組提高更為顯著(P<0.01),并且高劑量組和陽性組小鼠血清中SOD活力明顯提高(P<0.05),說明山刺玫果多糖可以提高體內(nèi)SOD活力,清除體內(nèi)自由基能力;與空白對照組相比,山刺玫果多糖高劑量組小鼠肝臟中MDA含量明顯降低(P<0.05),陽性組降低更為顯著(P<0.01),此外,中劑量和高劑量組小鼠血清中MDA含量的降低具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果提示,山刺玫果多糖能夠避免小鼠劇烈運動后,大量MDA的積累對細胞所造成的傷害。

表4 山刺玫果多糖對小鼠肝臟、血清中SOD活性及MDA含量的影響Table 4 Effects of polysaccharides on the activity of SOD and content of MDA in liver and

表5 山刺玫果多糖對小鼠肝臟、血清T-AOC及GSH-Px的活力的影響Table 5 Effects of polysaccharides on the activity of T-AOC and GSH-Px in liver and

2.6 山刺玫果多糖對小鼠肝臟、血清T-AOC及GSH-Px的活力的影響

由表5可見,與空白對照組相比,山刺玫果多糖中劑量、高劑量可使肝臟中T-AOC能力均有所增加(P<0.05),低劑量組未發(fā)現(xiàn)有明顯優(yōu)勢。小鼠血清T-AOC活力測定結(jié)果中,低劑量組與中劑量組小鼠血清中T-AOC能力均顯著增加(P<0.05),提示山刺玫果多糖可提高機體總抗氧化能力,減輕大強度運動所致氧化應(yīng)激損傷,對運動引起的過氧化反應(yīng)以及組織損傷具有一定的保護作用;小鼠肝臟及血清GSH-Px活力測定結(jié)果可知,高劑量組及陽性對照組肝臟與血清中的GSH-Px的活力顯著提高(P<0.05),提示山刺玫果多糖能夠產(chǎn)生較強的抗氧化作用,可防止酶分子氧化,維持并提高GSH-PX活性,加速自由基的消除。

3 結(jié)論與討論

疲勞為一種狀態(tài),發(fā)生在機體生理過程不能維持及其機能在某一特定的水平或不能維持預(yù)定的運動強度時?？蛊诘姆绞街饕醒泳徠诘漠a(chǎn)生或加速疲勞的消除[17]。當(dāng)小鼠運動過度后,會出現(xiàn)機體的機能減弱,同時伴隨血糖濃度的降低,這種現(xiàn)象和癥狀表明其機體處于疲勞狀態(tài)。隨著藥理研究的不斷深入,中藥多糖的應(yīng)用更加廣泛,不但能夠明顯提高小鼠運動能力,緩解運動疲勞,還具有顯著的抗氧化和清除自由基的作用。

目前,常采用小鼠轉(zhuǎn)棒實驗和負重游泳實驗對小鼠運動耐力和疲勞狀況進行測試,兩種實驗?zāi)Ｐ拖嘟Y(jié)合能夠比較客觀地反映出小鼠運動疲勞的程度[18];當(dāng)機體經(jīng)過長時間運動后,為提供機體運動所需的能量,體內(nèi)的糖原會進行分解,轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?從而維持機體正常狀態(tài)。而當(dāng)糖原含量不足,不能為機體活動提供充足能量時,機體活動水平就會低于正常狀態(tài),出現(xiàn)疲勞現(xiàn)象。肝糖原能夠為機體提供大量能量,機體內(nèi)肝糖原的含量決定了能夠為機體提供能量的多少。肌糖原則決定了機體耐力,肌糖原的含量越多,機體的耐力越好,運動時間也越長。當(dāng)機體沒有得到充分的能量供給時,機體內(nèi)的糖會進行無氧代謝,蛋白質(zhì)則進行分解代謝為機體提供能量,這就導(dǎo)致了體內(nèi)BUN含量的增加。因此,BUN的含量在一定程度上可以反映機體的疲勞程度[19]。在無氧條件下,肌肉中的糖原會被分解產(chǎn)生乳酸,為機體提供能量,但大量乳酸的產(chǎn)生則會引起肌肉酸痛,從而導(dǎo)致肌肉運動能力的下降,緩解機體的疲勞狀態(tài)也可以從減少乳酸含量的角度出發(fā)。本實驗結(jié)果顯示,山刺玫果多糖可延長小鼠負重力竭游泳時間,增加肝糖原含量而提高機體運動能力,增加血乳酸脫氫酶的活性,從而加快乳酸的分解,降低血清尿素氮和血乳酸的含量,延緩疲勞的發(fā)生,具有明顯的抗疲勞作用。

運動性疲勞產(chǎn)生的重要原因是運動中超氧陰離子自由基的產(chǎn)生和血漿脂質(zhì)過氧化物的升高[20]。因此,抗氧化作用的物質(zhì),不但可以提高體內(nèi)抗氧化酶的活性,還可以清除超氧陰離子自由基以及降低血漿脂質(zhì)的過氧化物,從而達到抗疲勞的效果。自由基作為一種強氧化能力的物質(zhì),其含量的變化與人體系統(tǒng)衰老密切相關(guān)。大量研究表明,小鼠體內(nèi)本身具有SOD、GSH-Px等多種清除多余自由基的抗氧化活性酶,可降低小鼠體內(nèi)活性氧自由基的活性,減弱其對機體的攻擊力,抗氧酶活性的提高能夠延緩運動疲勞[21]。生物體內(nèi),MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物,當(dāng)細胞受自由基氧化破壞時,其含量增加,由于細胞損傷,抑制了三磷酸腺苷(ATP)的釋放,阻礙了機體能量的供應(yīng),機體疲勞隨之產(chǎn)生[22]。T-AOC常用于反映機體抗氧化系統(tǒng)的功能狀況,其大小與機體抗氧化能力息息相關(guān),是機體狀態(tài)表現(xiàn)的重要指標(biāo);同樣,GSH-Px也可以反應(yīng)機體對自由基的清除能力,能夠降低機體過氧化氫的含量,使脂質(zhì)的過氧化作用減弱[23]。實驗結(jié)果可知,山刺玫果多糖可使小鼠肝臟和血清中SOD和GSH-Px活力提高,T-AOC能力增強,MDA含量降低,進一步表明山刺玫果多糖具有抗氧化作用。

本研究表明,山刺玫果多糖能夠提高機體抗氧化酶活性,緩解機體運動疲勞狀態(tài),具有明顯的抗疲勞作用。因此,作為藥食兩用中藥山刺玫果的有效部位,山刺玫果多糖在用于抗疲勞、抗氧化藥物和保健食品方面有著廣泛的應(yīng)用前景,本實驗為進一步開發(fā)利用山刺玫果資源提供了理論依據(jù)。