小分子阿膠肽的免疫調(diào)節(jié)作用

梁 榮,樊 琛,李 燕,曾慶華,劉 冉,郭興峰

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山東聊城 252000)

阿膠(Collacoriiasini)為馬科動物驢(EquusasinusL.)的干皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠,與人參、鹿茸并稱為滋補(bǔ)三寶,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。阿膠含明膠、蛋白質(zhì)、微量元素等多種有效成分,具有抗疲勞、抗氧化、增強(qiáng)免疫、促進(jìn)造血功能等多種功效[2-5]。

目前,通常采用直接加入阿膠原粉的方式制成阿膠制劑,如口服液、泡騰片、軟膠囊等[6-7]。阿膠蛋白需要經(jīng)蛋白酶降解為小分子肽后才能被吸收,但對于脾胃虛弱、消化能力低下的人群,直接服用阿膠或其制劑不但給胃腸帶來較大負(fù)擔(dān),而且阿膠的功效也得不到充分發(fā)揮[8]。因此,通過可控酶解技術(shù)將阿膠水解成小分子肽,能夠有效增強(qiáng)阿膠的生物利用度[9-10]。近代科研工作者運用現(xiàn)代化技術(shù)手段,對阿膠化學(xué)成分、功效物質(zhì)、藥理作用及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等進(jìn)行了多方面的探討和研究,并取得了顯著的研究成果[11-14]。然而,長期以來受到技術(shù)條件和傳統(tǒng)思想的限制,阿膠的很多功效還未得到足夠的現(xiàn)代科學(xué)理論和實驗的證實。特別是在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面,雖然已經(jīng)有相關(guān)的實驗研究報道,但是研究內(nèi)容不夠充分[15-16]。黃宏軼等[17]研究發(fā)現(xiàn)參苓阿膠復(fù)方膏對氣虛體質(zhì)小鼠免疫調(diào)節(jié)能力具有改善作用;李志等[18]研究發(fā)現(xiàn)阿膠口服液能提高小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。關(guān)于阿膠免疫調(diào)節(jié)的研究多集中在一些阿膠制劑的生理活性方面,并且這些研究對阿膠免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究并不深入。

因此,本研究以小分子阿膠肽(LMWPC)為實驗對象,通過研究LMWPC對小鼠體液免疫及細(xì)胞免疫兩方面的影響,深入探討和解析LMWPC對機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)機(jī)制,為阿膠新型制劑及保健品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小分子阿膠肽(LMWPC,MW<1000 Da) 東阿阿膠股份有限公司;SPF級健康ICR雌性小鼠,體重18～22 g 實驗動物合格證號SCXK(京)2012-0001,北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司;動物飼料(許可證號:SCXK(京)2014-0008) 北京華阜康生物科技股份有限公司;Yac-1細(xì)胞 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院;INT、PMS、NAD、Giemsa染液 美國Sigma公司;0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液、Hanks液、SA緩沖液、PBS緩沖液、1% NP40、RPMI1640培養(yǎng)液 美國Gibco公司;YAC-l細(xì)胞、綿羊紅細(xì)胞(SRBC)、補(bǔ)體(豚鼠血清)、ConA、小牛血清、都氏試劑 杭州四季青生物材料有限公司;其他試劑 均為分析純。

上海晟聲K1301 K1302半自動凱氏定氮儀 上海雙旭電子有限公司;Waters 1515 GPC凝膠色譜儀 美國Waters公司;SPECTRAMAX plus 酶標(biāo)儀 美國MD公司;PL203 型電子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;Thermo 3111 CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;SW振蕩水浴槽 優(yōu)萊博技術(shù)(北京)有限公司;Sorvall ST8R高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司;BDS-300倒置生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量的測定 采用凱氏定氮法測定LMWPC中的蛋白質(zhì)含量[19]。樣品消解:用電子天平分別稱取0.1 g硫酸銅、3 g硫酸鉀、0.3 g粉末樣品、10 mL硫酸加入定氮管中,放入消解爐逐漸升溫至400 ℃待內(nèi)容物全部炭化,泡沫全部停止后,液體變成澄清透明藍(lán)綠色后繼續(xù)加熱30 min,停止加熱,冷卻取出。定氮蒸餾:用半自動凱氏定氮儀進(jìn)行定氮蒸餾,經(jīng)計算確定蒸餾參數(shù),稀釋水量為10 mL、硼酸體積為10 mL、加堿體積為30 mL、蒸餾時間為210 s、淋洗水量為8 mL。鹽酸滴定:選用濃度為0.1 mol/L鹽酸對吸收氨氣后的硼酸溶液進(jìn)行滴定,利用滴定管記錄滴定體積。

蛋白質(zhì)含量(g/100 g)=(V1-V2)×C×0.0140×6.25×100/(M×10/100)

式中:V1是滴定時消耗鹽酸的量(mL);V2是空白實驗所消耗的鹽酸量(mL);C是鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度(mol/L);M是樣品質(zhì)量(g);6.25為氮換算為蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。

1.2.2 分子量分布的測定 應(yīng)用高效凝膠色譜法對LMWPC的分子量(MW)分布進(jìn)行測定[20]。色譜柱:TSKgel 2000 SWXL;流動相:乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1 (v/v);流速:0.5 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL,分別以乙胺酸-乙胺酸-乙胺酸(MW=189)、乙胺酸-乙胺酸-酪氨酸-精氨酸(MW=451)、桿菌酶(MW=1450)、抑肽酶(MW=6500)、細(xì)胞色素C(MW=12500)5種樣品為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 實驗動物分組與給藥 小鼠在溫度20～22 ℃,相對濕度45%～65%環(huán)境中飼養(yǎng),適應(yīng)飼養(yǎng)7 d,適應(yīng)期內(nèi)小鼠自由攝食和取水,適應(yīng)期結(jié)束后按體重采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計分組法分為五組,即對照組、免疫一組(血清溶血素測定)、免疫二組(進(jìn)行抗體生成細(xì)胞檢測)、免疫三組(遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗)和免疫四組(小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗)。阿膠人體推薦量為每天2.1 g/60 kg·bw[21],實驗設(shè)計低、中、高三個劑量組,即0.18、0.35、1.05 g/kg·bw,三組劑量分別相當(dāng)于人體推薦攝入量的5倍、10倍、30倍(每小組均為6只小鼠)[22]。以蒸餾水為溶劑將樣品分別配至所需濃度,同時設(shè)立蒸餾水溶劑對照組,按每天0.2 mL/10 g·bw連續(xù)經(jīng)口灌胃30 d 后,測各項免疫指標(biāo)。

1.2.4 血清溶血素測定 實驗結(jié)束前5 d,小鼠腹腔注射綿羊紅細(xì)胞(SRBC),摘眼球取血,離心取血清稀釋100倍,進(jìn)行半數(shù)溶血值(HC50)測定。實驗組加入稀釋后的血清100 μL,對照孔加入100 μL SA 緩沖液(5倍稀釋),而后依次加入 50 μL 10% SRBC和100 μL補(bǔ)體。37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min后,離心 5 min(1500 r/min)取上清液50 μL,加入150 μL都氏試劑,半數(shù)溶血孔設(shè)置為12.5 μL 10%(v/v)SRBC,加入200 μL都氏試劑。采用微量振蕩器混合均勻,靜置 10 min 后,應(yīng)用酶標(biāo)儀測定540 nm波長處的光密度值[23]并依據(jù)如下公式計算其HC50。

HC50=樣品光密度值/SRBC半數(shù)溶血光密度值×稀釋倍數(shù)

1.2.5 抗體生成細(xì)胞檢測 根據(jù)Jerne改良玻片法檢測抗體生成細(xì)胞[24]。SRBC免疫后的小鼠頸椎脫臼處死,取出脾臟制備脾細(xì)胞懸液。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后,50 ℃水浴保溫,與等量pH7.2～7.4的2倍濃度Hank’s液混合,并分裝于小試管(每管0.5 mL)。向管內(nèi)加入50 μL 10% SRBC,20 μL 脾細(xì)胞懸液(5×106個/mL)迅速混勻,而后傾倒于玻片上做平行片。待瓊脂凝固后,將玻片水平扣放在片架上,放入CO2培養(yǎng)箱溫育1.5 h,加補(bǔ)體后繼續(xù)溫育1.5 h后,計數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.2.6 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH) 實驗結(jié)束前5 d,小鼠腹腔注射2%(V/V)綿羊紅細(xì)胞(SRBC),致敏后4 d測量左后足距厚度,然后在測量部位皮下注射20%(VN)SRBC,每鼠注射20 μL,注射后24 h測量左后足距部厚度,同一部位測量三次,取均值。以攻擊前后足蹈厚度差值(足距腫脹度)來表示DTH的程度[25]。

1.2.7 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化 無菌環(huán)境下取出小鼠脾臟,置于裝有 5 mL Hank’s 液(無菌)的平皿中,并將紗布置于脾臟上方,用一次性注射器內(nèi)芯,輕微用力將脾臟磨碎,制備脾細(xì)胞懸液。用Hanks液洗2次,每次離心10 min(1000 r/min),將細(xì)胞懸浮于1 mL RPMI1640完全培養(yǎng)液中,調(diào)整細(xì)胞濃度為 3×l06個/mL。將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中,每孔1 mL,一孔加入75 μL ConA液,另一孔作為對照,置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h,每孔吸取上清液0.7 mL,加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,同時加入MTT 50 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入l mL酸性異丙醇,吹打均勻使紫色結(jié)晶完全溶解,在570 nm波長處測定OD值,以加 ConA孔的OD值減去不加ConA孔的OD值表示淋巴細(xì)胞增殖能力[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復(fù)3次以上,以Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫,使用SPSS軟件中Dunnett檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計分析,實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 小分子阿膠肽(LMWPC)蛋白質(zhì)含量及分子量分布的測定結(jié)果

采用凱氏定氮法測定了LMWPC中的蛋白質(zhì)含量,結(jié)果顯示LMWPC中的主要成分為蛋白質(zhì),含量高達(dá)(88.84±1.77) g/100 g。應(yīng)用高效凝膠色譜法對小分子肽分子量(MW)分布進(jìn)行測定,獲得LMWPC的分子量分布如圖1所示。測定標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間(如圖2所示),用各自標(biāo)準(zhǔn)樣品的分子量取對數(shù)的lgMw并與保留時間作圖得到線性關(guān)系,回歸方程為:y=-0.227x+6.991,R2=0.963。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果,經(jīng)回歸方程計算發(fā)現(xiàn)LMWPC的分子量絕大部分分布在1000 Da以下,并由4個主要片段組成,由右向左四個峰對應(yīng)的分子量分別為:66、105、223和581 Da。

圖1 小分子阿膠肽的高效凝膠色譜圖Fig.1 High performance gel chromatogram of LMWPC

圖2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效凝膠色譜圖Fig.2 High performance gel chromatogram of standard samples

LMWPC是以阿膠為原料,使用現(xiàn)代生物酶解技術(shù),將傳統(tǒng)阿膠大分子蛋白或多肽,進(jìn)行進(jìn)一步的水解,使其分子量進(jìn)一步減小,以期減弱阿膠的滋膩之性[27]。經(jīng)本研究的測定發(fā)現(xiàn),LMWPC不但蛋白質(zhì)含量豐富,而且酶解后的相對分子量分布在1000 Da以下。分子質(zhì)量的降低使阿膠具有較好的溶解性,減輕了阿膠的滋膩性,使機(jī)體更容易消化吸收,從而提高了阿膠的生物利用度[28]。劉元濤等[29]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)仿生酶解后的阿膠<3000 Da的小肽含量增加、分子量降低,且仿生酶解后的阿膠比普通阿膠具有更好的提高小鼠抗缺氧能力、游泳時間、胸腺和脾臟指數(shù)以及耐寒能力的效果。

2.2 小分子阿膠肽(LMWPC)對小鼠血清溶血素水平的影響

研究表明,阿膠能夠顯著提高血液白細(xì)胞水平,從而提高機(jī)體的免疫能力[30]。小分子阿膠為阿膠水解物,同樣具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能。血清溶血數(shù)(半數(shù)溶血值,HC50)和抗體生成細(xì)胞檢驗(溶血空斑實驗是體外檢測單個抗體形成細(xì)胞B淋巴細(xì)胞)的測定常被用來檢測機(jī)體體液免疫的功能狀態(tài)[31]。LMWPC對小鼠血清溶血素水平的影響如圖3所示,高劑量組(1.05 g/kg·bw)小鼠的半數(shù)溶血值(HC50)與對照組(63.6±5.5)比較差異性極顯著(P<0.01),可達(dá)76.8±4.2;低劑量組和中劑量組的小鼠HC50分別為69.3±4.1和68.6±5.7,與對照組相比差異顯著(P<0.05)。該實驗結(jié)果表明LMWPC能明顯增加小鼠血清溶血素水平,對小鼠的體液免疫功能有增強(qiáng)作用。崔金玉[32]研究發(fā)現(xiàn)阿膠丁、蛤粉炒阿膠珠和微波制阿膠珠都可以提高正常小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù),同樣證明阿膠可以提高小鼠的免疫能力。

圖3 小分子阿膠肽對小鼠血清溶血素水平的影響Fig.3 Effect of LMWPC on the rite ofblood serum hemolysin in mice注:*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05);**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01);圖4～圖6同。

2.3 小分子阿膠肽(LMWPC)對小鼠脾細(xì)胞抗體生成的影響

圖4為LMWPC對小鼠脾細(xì)胞抗體生成的影響結(jié)果,小分子阿膠低聚肽0.35 g/kg·bw中劑量組小鼠的溶血空斑數(shù)(×103/全脾)與對照組比較差異性顯著(P<0.05);低、高劑量組小鼠的溶血空斑數(shù)與對照組的差異均無顯著性(P>0.05),這可能是由于低劑量下的LMWPC對小鼠脾細(xì)胞抗體生成的影響不顯著,而高劑量的LMWPC抑制小鼠脾細(xì)胞抗體生成導(dǎo)致的。實驗結(jié)果表明,中劑量(0.35 g/kg)的LMWPC顯著增加了空斑的形成,進(jìn)一步促進(jìn)B細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能。付英杰等[33]研究表明,不同給藥途徑的阿膠低肽均可顯著增加模型小鼠脾重指數(shù),表現(xiàn)出一定的免疫增強(qiáng)作用。盧艷等[22]研究發(fā)現(xiàn)阿膠棗能夠調(diào)節(jié)小鼠體液免疫功能,調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力,同時不同劑量的阿膠棗未見免疫抑制現(xiàn)象。LMWPC源于阿膠,在某種程度上能夠代表阿膠的功能活性,因此本研究的實驗對象LMWPC和阿膠棗均表現(xiàn)出了類似的免疫調(diào)節(jié)能力。

圖4 小分子阿膠肽對小鼠脾細(xì)胞抗體生成的影響Fig.4 Effect of LMWPC on hemolytic antibody in mice

2.4 小分子阿膠肽(LMWPC)對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響

狹義的細(xì)胞免疫(cellular immunity)僅指T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,其特征是出現(xiàn)以單核細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)和/或特異性的細(xì)胞毒性[34]。廣義的細(xì)胞免疫還包括原始的吞噬作用以及NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。細(xì)胞免疫是清除細(xì)胞內(nèi)寄生微生物的最為有效的防御反應(yīng),也是排斥同種移植物或腫瘤抗原的有效手段[35]。小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗和ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的測定常被用來檢測細(xì)胞免疫的功能狀態(tài)[18]。圖5為LMWPC對小鼠DTH的影響結(jié)果,由圖5可知對照組小鼠足趾腫脹為(0.27±0.06) mm,低劑量組小鼠足趾腫脹與對照組比較無顯著性差異;中、高劑量組小鼠足趾腫脹分別為(0.34±0.07) mm和(0.35±0.03) mm,與對照組相比差異極顯著(P<0.01),因此0.35 g/kg中劑量組和1.05 g/kg高劑量組LMWPC對SRBC誘導(dǎo)的小鼠足趾腫脹厚度具有明顯增強(qiáng)作用。由于SRBC是細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)劑,實驗組小鼠足趾腫脹程度的增加,說明LMWPC能夠通過增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能而增加足趾的腫脹。張珣等[36]研究表明,阿膠同樣能夠增加小鼠血清溶血素含量,增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和脾淋巴細(xì)胞的增殖能力;并且能顯著提升免疫低下模型小鼠的胸腺指數(shù)、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù);還能調(diào)節(jié)血清中免疫細(xì)胞因子的水平,表明阿膠對小鼠特異性及非特異性免疫機(jī)能具有顯著調(diào)節(jié)作用。

圖5 小分子阿膠肽對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響Fig.5 Effect of LMWPC on thedelayed hypersensitivity in mice

2.5 小分子阿膠肽(LMWPC)對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

LMWPC對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響結(jié)果如圖6所示,實驗小鼠經(jīng)口灌胃LMWPC 30 d后,與對照組OD值(0.253±0.082)比較,低劑量組OD值(0.280±0.074)和中劑量組OD值(0.315±0.067)小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化差異均無顯著性(P>0.05);而高劑量組(OD值0.344±0.052)對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng),差異極顯著(P<0.01)。因此,1.05 g/kg高劑量LMWPC能夠明顯增加脾淋巴細(xì)胞的成熟,從而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng),最終增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。安夢培等[37]發(fā)現(xiàn)阿膠能顯著提高免疫低下小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫,提高CD3+、CD3+CD4+陽性細(xì)胞比例,但是對非特異性免疫無明顯影響。巢警殳[38]研究發(fā)現(xiàn)林蛙皮生物活性肽能夠提高誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力和ConA誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力,具有增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能。小分子阿膠肽與林蛙皮生物活性肽均來源于動物皮,因此可能均有相似的免疫調(diào)節(jié)功能。

圖6 小分子阿膠肽對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響Fig.6 Effect of LMWPC on theblastisation of spleen lymphocyte in mice

3 結(jié)論

本研究通過凱氏定氮及分子量分析實驗證明LMWPC的蛋白質(zhì)含量豐富,分子量主要集中在1000 Da以下;利用小鼠免疫實驗?zāi)Ｐ?發(fā)現(xiàn)LMWPC能夠通過增加小鼠血清溶血素水平、增加小鼠脾細(xì)胞抗體生成、增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖,提高小鼠的體液免疫及細(xì)胞免疫功能,對小鼠的免疫功能有正向調(diào)節(jié)作用。本研究為LMWPC及相關(guān)系列食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。