杜仲雄花超微粉碎破壁條件優(yōu)化

魏媛媛,李偉業(yè),溫 曉,于華忠

(吉首大學(xué)林產(chǎn)化學(xué)加工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南張家界 427000)

杜仲雄花,雌雄雙株,杜仲雄蕊的萌發(fā)先于杜仲新枝新葉,避免了在營(yíng)養(yǎng)供給上與枝葉生長(zhǎng)的矛盾,因此,杜仲雄花的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富且全面。近幾十年,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)杜仲雄花茶中的天然活性物質(zhì)和功效作用已進(jìn)行大量研究。杜仲雄花富含次生代謝產(chǎn)物,主要有總黃酮、木質(zhì)素類(lèi)、苯丙素類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、三萜、甾類(lèi)等,具有抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠、降血壓、降血脂、抗疲勞、抑菌、抗氧化及抗衰老等作用[1-4]。目前市場(chǎng)上杜仲雄花相關(guān)產(chǎn)品主要以杜仲雄花茶為主,對(duì)杜仲雄花的活性成分不能最大化利用,因此考慮對(duì)杜仲雄花進(jìn)行破壁,從而提高其活性成分的利用率。目前,破壁技術(shù)應(yīng)用廣泛,在食品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍較小,在中藥加工和制藥工業(yè)方面研究和應(yīng)用較多,主要以中藥破壁飲片和花粉破壁為主。

細(xì)胞破壁技術(shù)是采用一定的技術(shù)手段,破壞細(xì)胞外壁和內(nèi)膜囊都,使其內(nèi)容物在破壁后滲透而出,從而使有效成分易于被提取或吸收。破壁技術(shù)可分為物理法、生物法和化學(xué)法。超微粉碎是通過(guò)機(jī)械對(duì)物料的物理作用,將物料粉碎至微米級(jí)別。超微粉碎能有效減小物料粉體顆粒粒度,增加粉體的表面積和孔隙率,使超微粉末具有良好的吸附性、溶解性和分散性等多方面的理化新特性[5],有利于方便食品和速溶食品的加工,以滿足現(xiàn)代食品生產(chǎn)所需,此外,經(jīng)超微粉生產(chǎn)的產(chǎn)品更容易被人體消化吸收[6-7]。因此,本研究采用響應(yīng)面曲線法,以杜仲雄花的破壁率為指標(biāo),確定超微粉碎破壁杜仲雄花的最優(yōu)條件,為杜仲雄花的綜合利用提供工藝基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲鮮雄花 2018年3月下旬采自湖南省張家界市慈利縣江埡林場(chǎng),去除鮮葉和枝梗密封袋儲(chǔ)存于-10 ℃冰箱冷藏室,保存?zhèn)溆?湖南張家界慈利江埡茶葉合作社提供;蘆丁、桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷等標(biāo)準(zhǔn)品 純度>99%,中國(guó)生物制品鑒定院;無(wú)水乙醇、甲醇等試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī) 濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司;Nikon ECLIPSE E200光學(xué)顯微鏡 上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;Thermo Evolution 220型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海輔澤商貿(mào)有限公司);Agilent 1260高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;XD-5200DT型超聲波清洗儀 南京先歐儀器制造有限公司;HH型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;Hei-VAP value旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀表有限責(zé)任公司;AL204型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;AEL-40SM型半微量天平 南京萊步科技實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超微粉碎破壁杜仲雄花工藝 低溫儲(chǔ)存的鮮雄花→真空干燥→粗粉碎→過(guò)篩→超微粉碎破壁。

操作要點(diǎn):

真空干燥:稱(chēng)取低溫儲(chǔ)存的杜仲鮮雄花36 g,薄層且均勻地?cái)偡旁诎霃綖?5 cm的不銹鋼圓盤(pán)中,將其置于真空干燥箱中,在真空度為-0.1 Mpa,溫度為40 ℃下,對(duì)杜仲雄花鮮花進(jìn)行干燥[8],間隔攪拌,并測(cè)定其水分,控制到實(shí)驗(yàn)所需水分含量,備用;

粗粉碎:將真空干燥后的杜仲雄花進(jìn)行粗粉碎,過(guò)100目篩,備用;

超微粉碎破壁:開(kāi)啟超微粉碎機(jī)降溫系統(tǒng),設(shè)置實(shí)驗(yàn)溫度值,打開(kāi)主機(jī)預(yù)熱30 min至機(jī)器達(dá)到正常運(yùn)轉(zhuǎn)。稱(chēng)量過(guò)100目篩的雄花物料裝罐,將物料罐裝機(jī)后設(shè)置粉碎時(shí)間,啟動(dòng)粉碎機(jī)粉碎系統(tǒng),粉碎完成后自動(dòng)停止,取少量破壁后的物料進(jìn)行破壁率的檢測(cè)。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 粉碎時(shí)間的篩選 取低溫冷凍室儲(chǔ)存的鮮雄花,真空干燥至水分4%,精密稱(chēng)量100 g,分別粉碎1、2、4、6、8、10 min。通過(guò)顯微鏡下觀察其破壁率,得到在最短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最高破壁率的粉碎時(shí)間范圍。

1.2.2.2 投料量的篩選 投料量的篩選可根據(jù)超微粉碎儀器物料罐的大小和儀器使用注意事項(xiàng)以及雄花破壁率的高低來(lái)設(shè)定,取處理后超低溫冷凍室儲(chǔ)存的鮮雄花,真空干燥至水分4%,分別稱(chēng)量100、120、140、160、180、200 g,粉碎6 min。(本實(shí)驗(yàn)所用儀器的儲(chǔ)料罐的容量小于等于200 g),得到達(dá)到最高破壁率的投料量。

1.2.2.3 物料水分的篩選 取低溫冷凍室儲(chǔ)存的鮮雄花,通過(guò)真空干燥控制鮮雄花水分含量,分別干燥至水分含量為2%、4%、6%、8%、10%、12%,精密稱(chēng)取各水分含量的雄花100 g,粉碎6 min。通過(guò)顯微鏡觀察其破壁率,得到達(dá)到最高破壁率的雄花水分范圍。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為了使超微粉碎破壁杜仲雄花方法更加科學(xué)可靠,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇粉碎時(shí)間、投料量和雄花水分含量為影響因素,雄花破壁率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),利用Design-Expert 8.0.6軟件,根據(jù)Box-Behnken中心實(shí)驗(yàn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and l evels in response surface test

1.2.4 破壁前后雄花有效成分對(duì)比

1.2.4.1 總黃酮含量測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:稱(chēng)取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品12.0 mg于100 mL容量瓶中,加適量甲醇,置于40 ℃水浴微熱溶解,放冷至室溫,加甲醇至刻度,搖勻,即得質(zhì)量濃度為12 mg·mL-1的蘆丁對(duì)照品母液,精密量取蘆丁對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 mL,分別置于25 mL容量瓶中,各加水至6 mL,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法進(jìn)行顯色:先加入5%亞硝酸溶液1 mL,混勻,放置6 min;后加入10%硝酸鋁溶液1 mL,搖勻,放置6 min;然后加入4%氫氧化鈉溶液10 mL,最后加水至刻度,搖勻,放置15 min,測(cè)定[9]。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),得蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C=0.01185A-0.00333,R2=0.99996。蘆丁在4.8～28.8 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.4.2 桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷含量測(cè)定 色譜條件:Thermal Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 um);以0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相A,乙腈為流動(dòng)相B,按下表1中的規(guī)定梯度洗脫,體積流量1.0 mL·min-1;柱溫26 ℃;多波長(zhǎng)檢測(cè):206、238、327 nm;檢測(cè)時(shí)間為25 min,進(jìn)樣量為20 μL。

表2 梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions

表3 3種活性成分線性回歸方程Table 3 Linear regression equation of Three active ingredients

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別精密稱(chēng)取桃葉珊瑚苷對(duì)照品京尼平苷8.02 mg,綠原酸對(duì)照品7.88 mg,京尼平苷對(duì)照品4.33 mg,置同一5 mL棕色量瓶中,超純水定容,搖勻,即得。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL定容至10 mL容量瓶中,再經(jīng)0.45 μm微孔膜濾過(guò),依次進(jìn)樣20 μL測(cè)定其峰面積。分別以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo),色譜峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程?；貧w方程與線性范圍見(jiàn)下表3。結(jié)果表明,桃葉珊瑚苷、綠原酸、京尼平苷對(duì)照品濃度與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

1.2.5 破壁率的計(jì)算 配制4%的花粉液,制作玻片,直接顯微鏡下觀察。

取破壁后的杜仲雄花粉末(超微粉碎破壁和和破壁前相同雄花粉末作為對(duì)照)各0.5 g,加入12.5 mL蒸餾水,制作玻片;直接吸取攪拌均勻的破壁處理液,制作玻片;將制作好的玻片置于10×40目的顯微鏡下觀察。每種破壁處理液觀察3～4個(gè)玻片,每個(gè)玻片取3個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)計(jì)算[10]。按下式計(jì)算花粉的破壁率:

破壁率(%)=視野中已破壁雄花粉末粒數(shù)/同視野總雄花粉末顆粒數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行分析,使用wps 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 粉碎時(shí)間對(duì)超微粉碎破壁率的影響 由圖1可見(jiàn),超微粉碎時(shí)間對(duì)其破壁率有一定影響,隨粉碎時(shí)間的加長(zhǎng),破壁率越高,但2 min后其破壁率差異不大,到8 min破壁率可達(dá)100%,粉碎時(shí)間越長(zhǎng),超微粉轉(zhuǎn)子與物料的摩擦幾率越大,雄花粉碎越徹底[11]。粉碎至6 min左右破壁率基本變化不明顯,因此最佳粉碎時(shí)間為2～8 min。

圖1 不同粉碎時(shí)間對(duì)雄花破壁率的影響Fig.1 Effect of different grinding time on wall breakingrate of Eucommia ulmoides male flower

2.1.2 投料量對(duì)超微粉碎破壁率的影響 超微粉碎投料量的多少與超微粉碎機(jī)的性能密不可分[12]。如圖2所示,隨投料量的增加,破壁率先升高后降低。原料投放量至物料罐的2/3(160 g)處最佳。投料量少于物料罐的1/3(100 g)會(huì)對(duì)機(jī)器轉(zhuǎn)子損傷較大,投料量過(guò)多,原料易堆積[13],從而影響雄花粉碎程度,因此超微粉破壁雄花最佳投料量為100～200 g。

圖2 不同投料量對(duì)雄花破壁率的影響Fig.2 Effect of different dosageon Eucommia ulmoides male flower wall breaking rate

2.1.3 雄花水分含量對(duì)超微粉碎破壁率的影響 由圖3可見(jiàn),雄花水分含量對(duì)超微粉碎破壁率有一定影響,隨雄花水分含量的升高,破壁率呈先升高再降低的趨勢(shì)。水分含量在3%～9%左右,破壁率達(dá)到最大。水分過(guò)低或過(guò)高,超微粉轉(zhuǎn)子與物料的摩擦力減小,破壁率較低。因此最佳粉碎雄花水分含量為3%～9%左右。物料水分含量越高,由于物料粉碎倉(cāng)內(nèi)溫度和物料停留時(shí)間的影響,使得物料水分不能完全蒸發(fā),且蒸發(fā)的水蒸氣不能及時(shí)排出,必然造成粘轉(zhuǎn)子、粘壁和減小轉(zhuǎn)子摩擦力等現(xiàn)象,不但降低了粉碎效果,而且破壞了物料在粉碎倉(cāng)內(nèi)的平衡狀態(tài)[14]。

圖3 雄花不同水分含量對(duì)其破壁率的影響Fig.3 Effect of Different Water Contenton Wall Breaking Rate of Eucommia Ulmoides Male Flower

2.2 響應(yīng)面分析

表5 回歸方程方差分析表Table 5 Variance analysis of regression equation

2.2.1 二次多元回歸模型分析 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元化回歸擬合分析得到3個(gè)因素與雄花破壁率之間二次回歸模擬方程為:

Y=99.44+8.85A-2.17B-3.10C+1.02AB+4.43AC+0.53BC-6.51A2-1.21B2-3.11C2

回歸方程顯著性檢驗(yàn)及方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。二次回歸模擬方程其中一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都有顯著性影響因素,所以實(shí)驗(yàn)各因子對(duì)響應(yīng)值的影響并不是線性關(guān)系。

表4 Response surface中心組合方案及響應(yīng)值Table 4 Response surface central combinationproject and response values

響應(yīng)面圖可以直觀地觀察各影響因素之間的相互關(guān)系,響應(yīng)曲面圖形越陡峭,即其交互作用越顯著,圖形平穩(wěn)則說(shuō)明交互作用比較微弱。兩因素交互作用對(duì)超微粉破壁杜仲雄花破壁率影響的響應(yīng)曲面見(jiàn)圖3,粉碎時(shí)間和雄花水分含量交互作用最強(qiáng),即對(duì)破壁率的影響最為顯著;投料量和雄花水分含量交互作用最弱。由圖3可見(jiàn),當(dāng)粉碎時(shí)間為8 min左右,投料量為100 g左右時(shí),超微粉破壁杜仲雄花破壁率達(dá)到100%;雄花水分含量在3%左右,粉碎時(shí)間為8 min左右,超微粉破壁杜仲雄花破壁率可達(dá)100%;雄花水分在3%左右,投料量為100 g左右時(shí),超微粉破壁杜仲雄花雄花破壁率可達(dá)100%。

圖3 各兩因素交互對(duì)超微粉破壁杜仲雄花破壁率的影響Fig.3 Effect of interaction of two factors on the wall-breakingrate of ultrafine powder broken Eucommia ulmoides male flowers

圖4 杜仲雄花破壁前后顯微鏡視野圖Fig.4 Microscopic field of view of Eucommia ulmoides male flowers before and after wall breaking

2.2.2 最優(yōu)條件確定以及驗(yàn)證 通過(guò)響應(yīng)曲面法分析得到最大響應(yīng)值(Y)時(shí),調(diào)整后A、B、C對(duì)應(yīng)的值分別為A=8 min,B=100 g,C=6%。為檢測(cè)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),破壁率為100%,采用優(yōu)化條件,實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差RSD為1.69%。

2.3 超微粉破壁杜仲雄花前后顯微鏡視野對(duì)比

不同破壁方法對(duì)雄花細(xì)胞破壁方式不同,因此顯微鏡下視野狀態(tài)不同。由下圖4中超微粉碎破壁雄花顯微鏡視野圖可見(jiàn),雄花細(xì)胞呈碎末狀、碎片狀等,由此可見(jiàn)超微粉碎破壁是通過(guò)物料與介質(zhì)的混合振動(dòng),并受到強(qiáng)烈的振動(dòng)、沖擊、剪貼、撕扯等作用,從而達(dá)到破壁效果。

2.4 超微粉破壁杜仲雄花前后有效成分含量對(duì)比

杜仲雄花破壁前后提取成分含量對(duì)比見(jiàn)表6,由表6可見(jiàn),破壁后杜仲雄花中的總黃酮、桃葉珊瑚苷、綠原酸和京尼平苷溶出率均明顯高于破壁前,破壁后的杜仲雄花總黃酮含量為2.59%,比破壁前高出60%多。由此可見(jiàn),應(yīng)用超微粉碎破壁杜仲雄花細(xì)胞壁有利于活性成分的溶出。

表6 雄花破壁前后成分對(duì)比Table 6 Comparison of components of Eucommia ulmoidesmale flowers before and after wall breaking

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,回歸模型呈現(xiàn)高度顯著(P<0.0001),失擬項(xiàng)不顯著,可知回歸方程的擬合度和可信度均較高,能夠很好預(yù)測(cè)各條件下超微粉破壁杜仲雄花的破壁率。從F值的分析結(jié)果可以看出,在所選的各因素水平范圍內(nèi),粉碎時(shí)間對(duì)雄花破壁率的影響最大;由響應(yīng)曲面法分析得到最大響應(yīng)值(Y)時(shí),破壁條件:粉碎時(shí)間8 min,投料量為100 g,雄花水分含量為6%,其破壁率可達(dá)100%,驗(yàn)證試驗(yàn)可靠。杜仲雄花破壁前后顯微鏡視野圖表明超微粉具有很好的破壁作用,改善了杜仲雄花細(xì)胞壁的通透性,有利于其有效成分的溶出,為杜仲雄花的應(yīng)用提供可靠依據(jù)。