響應(yīng)面優(yōu)化庸鰈魚骨酶解條件及氨基酸組成分析

衣美艷,侯 虎2,毛 毛,郭 紅

(1.山東東方海洋科技股份有限公司,國家海水魚類加工技術(shù)研發(fā)中心分中心,山東煙臺 264003;2.中國海洋大學(xué),山東青島 266003)

庸鰈(Hippoglossus)是鰈科庸鰈屬最大的一種比目魚,主要分布于拉布拉多及格陵蘭至冰島的北大西洋深海海域,其口感獨(dú)特,風(fēng)味良好且營養(yǎng)豐富[1]。目前庸鰈主要以加工成無骨魚片的形式出口,其在加工生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生魚皮、魚頭與魚骨等大量副產(chǎn)物,其中含有豐富的蛋白質(zhì)、磷脂質(zhì)、軟骨素、維生素等[2],這些營養(yǎng)物質(zhì)和有用成分是重要的生物資源,但目前這些下腳料主要用來生產(chǎn)魚貯飼料、魚粉等[3-5],對其中有價值的成分尚未充分利用。因此,如何深度開發(fā)魚下腳料的利用途徑,對水產(chǎn)品加工綜合利用和保護(hù)環(huán)境有重要的意義。

庸鰈作為一種規(guī)模化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)名貴魚類,2004年被引入我國開始進(jìn)行養(yǎng)殖技術(shù)積累和市場開發(fā)研究[6],目前我國鲆鰈類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)已處于蓬勃發(fā)展時期[7],在此背景下,開展對庸鰈潛在價值開發(fā)及其應(yīng)用的研究將具有很好的市場前景及現(xiàn)實意義。然而,目前對于庸鰈的相關(guān)研究較少,只有少數(shù)主要針對庸鰈繁殖的研究[6,8-9]和李文婧等人對大西洋庸鰈皮膚粘液中hipposin抗菌肽分離純化的研究[10]。本文將針對庸鰈自身鮮美無魚腥味、富含膠原的品質(zhì)特性,利用其在加工過程中產(chǎn)生的約占魚體重的 15%[11]的魚骨副產(chǎn)物,通過響應(yīng)面法進(jìn)行酶解工藝研究,并對其酶解液氨基酸組成進(jìn)行分析,探究其特性及開發(fā)應(yīng)用前景,為庸鰈魚骨的開發(fā)提供新思路,為其深入研究提供理論支持,同時提高庸鰈加工副產(chǎn)物附加值,促進(jìn)海水魚加工產(chǎn)業(yè)的技術(shù)升級及快速、健康發(fā)展,提高水產(chǎn)加工業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

庸鰈魚骨 由煙臺山海食品有限公司(煙臺,山東省)提供;動物蛋白酶(90000 U/g) 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;甲醛 分析純,邁瑞化學(xué)試劑有限公司。

日立L-8500氨基酸自動分析儀 日本Hitachi公司;HH4恒溫水浴鍋 金壇天瑞公司;A4103型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;K9860凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司;FA1104N電子分析天平 上海菁海儀器有限公司;TDZ4低速大容量離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 庸鰈魚骨→預(yù)處理→酶解→滅酶→離心→酶解液

1.2.2 工藝要點(diǎn) 將庸鰈魚骨解凍,自來水清洗干凈,斬碎呈1～2 cm左右小塊,按照一定的液料比加入清水,然后加入一定百分比(總物料質(zhì)量)的動物蛋白酶攪拌均勻,在一定溫度條件下攪拌酶解一定時間后,滅酶處理10 min,待酶解液降到常溫,以3000 r/min離心10 min,倒掉最下層沉淀,然后將中上層液體以5000 r/min離心15 min,濾除最上層油液,保留下層酶解液待用。

1.2.3 單因素試驗 根據(jù)現(xiàn)實生產(chǎn)加工條件及前期預(yù)實驗結(jié)果,以水解度為指標(biāo),利用動物蛋白酶對庸鰈魚骨進(jìn)行酶解工藝研究,分別考察液料比(質(zhì)量比)、加酶量(總物料質(zhì)量)、酶解時間和酶解溫度對酶解效果的影響。

1.2.3.1 液料比對酶解效果的影響 在加酶量0.1%、酶解溫度50 ℃、酶解時間1 h、pH=7條件下,分別設(shè)定液料比為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1和1∶2,考察液料比對水解度的影響。

1.2.3.2 加酶量對酶解效果的影響 在液料比2∶1、酶解溫度50 ℃、酶解時間1 h、pH=7條件下,加酶量分別設(shè)定為總物料的0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%,考察加酶量對水解度的影響。

1.2.3.3 酶解時間對酶解效果的影響 在液料比2∶1、加酶量0.15%、酶解溫度50 ℃、pH=7條件下,酶解時間分別設(shè)定為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h,考察酶解時間對水解度的影響。

1.2.3.4 酶解溫度對酶解效果的影響 在液料比2∶1、加酶量0.15%、酶解時間2 h、pH=7條件下,酶解溫度分別設(shè)定為40、45、50、55 和60 ℃,考察酶解溫度對水解度的影響。

1.2.4 庸鰈魚骨酶解工藝條件優(yōu)化 在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計方案,以液料比(質(zhì)量比)(A)、加酶量(B)、酶解時間(C)為試驗因素,并以1、0、-1分別代表變量的水平,以水解度作為響應(yīng)值。采用Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。實驗因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.5 酶解液水解度的測定 酶解液中總氮含量采用GB/T 5009.5-2010凱氏定氮法,酶解液中的氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛電位滴定法測定,具體根據(jù)公式(1)計算其水解度(DH)[12]。

式(1)

1.2.6 游離氨基酸測定 待測酶解液樣品不經(jīng)酸堿水解,直接加水定容之后,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上樣至日立L-8500氨基酸自動分析儀進(jìn)行測定,取樣量可視含量高低而定,待測液單種氨基酸濃度<1 μg/mL為宜[13]。

1.2.7 滋味貢獻(xiàn)評價方法 采用呈味強(qiáng)度值(Taste Activity Value,TAV)法評價單個游離氨基酸對不同酶解液滋味的貢獻(xiàn),TAV指樣品中各呈味物質(zhì)的測定值與該物質(zhì)味道閾值之比[14],計算公式如下:

式(2)

式中:C1為滋味化合物的質(zhì)量濃度,g/100 g;C2為滋味閾值濃度,g/100 g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以P<0.05為差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 液料比對庸鰈酶解液水解度影響 由圖1可以看出,隨著液料比的降低即底物濃度的升高,水解度逐漸增大,在液料比為2∶1時,水解度最大,當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)升高,水解度則呈下降趨勢。這是因為隨著底物濃度的增加,底物與酶分子接觸點(diǎn)增多,酶解效率增加,水解度增大;但是當(dāng)?shù)孜餄舛冗^大時,底物的黏度影響酶與底物的充分接觸,酶解效率下降,水解度降低[15-18]。因此,選取2∶1作為庸鰈魚骨酶解最適液料比。

圖1 液料比對水解度的影響Fig.1 Effect of different liquid ratios on hydrolysis degree

2.1.2 加酶量對庸鰈酶解液水解度影響 由圖2可以看出,隨著加酶量的不斷增加,水解度呈先升高后緩慢降低的趨勢。在加酶量為0.05%～0.15%時,隨著加酶量增大,致使水解能力增強(qiáng),水解度增加;但加酶量過高時,由于酶是蛋白質(zhì)的屬性,當(dāng)達(dá)到一定濃度會發(fā)生相互水解現(xiàn)象,導(dǎo)致酶解效果下降,從而使水解度減小。因此,庸鰈魚骨酶解最適加酶量為0.15%。

圖2 加酶量對水解度影響Fig.2 Effect of different enzyme dosage on hydrolysis degree

2.1.3 酶解時間對庸鰈酶解液水解度影響 由圖3可以看出,水解度隨酶解時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢,在前1.5 h內(nèi),水解速率最快,在2 h后水解度的增加不明顯,這是因為隨著時間的延長,底物濃度逐漸降低,酶解活動基本趨于平穩(wěn)甚至結(jié)束,所以綜合考慮,選擇2 h為最適酶解時間。

圖3 酶解時間對水解度的影響Fig.3 Effect of different enzymetic time on hydrolysis degree

圖4 酶解溫度對水解度的影響Fig.4 Effect of different enzymetictemperature on hydrolysis degree

2.1.4 酶解溫度對庸鰈酶解液水解度影響 由圖4可以看出,隨著溫度的增大,水解度先增大后減小,在50 ℃時,達(dá)到最大值。這是因為隨著溫度的升高,酶的活性增加,反應(yīng)速率增大,可使水解度升高,但溫度再高會導(dǎo)致酶活性減弱甚至喪失,反應(yīng)速率下降[19-20]。因此,選取50 ℃作為庸鰈魚骨酶解的最適溫度。

2.2 響應(yīng)面試驗

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件,根據(jù)單因素實驗結(jié)果及Box-Behnken試驗設(shè)計原理,以液料比、加酶量和酶解時間作為研究因素,采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法確定庸鰈魚骨最佳酶解工藝條件,實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Program and experimental results of Box-Behnken test

表3 回歸模型方差及可信度分析Table 3 Analysis of variance and reliability of regression model

注:**差異極顯著,P<0.01;*差異顯著,P<0.05。 利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到提取率對液料比(A)、加酶量(B)和酶解時間(C)的二次多項回歸模型:

Y=33.02+0.43A+1.36B+1.06C+1.00AB-0.30AC-0.075BC-2.25A2-4.37B2-2.67C2

由圖5可知,水解度隨著液料比、加酶量和酶解時間的增大呈先增后減趨勢,說明該模型具有極大值。響應(yīng)面的陡峭程度隨著加酶量、酶解時間的變化起伏較大,說明加酶量、酶解時間對水解度的影響大于液料比。以上分析與表3的方差分析結(jié)論一致。

圖5 各因素交互作用對水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface for the effects ofcordycepene on hydrolysis degree

通過上述數(shù)學(xué)模型對庸鰈魚骨酶解工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析,得到最佳工藝條件為液料比2.12∶1,加酶量0.16%,酶解時間2.10 h,此條件下庸鰈魚骨酶解液水解度為33.26%?？紤]到實際操作情況,將酶解工藝參數(shù)修正為液料比2∶1,加酶量為0.16%,酶解時間2 h。為檢測模型的可靠性,對優(yōu)化條件進(jìn)行驗證試驗,得到庸鰈酶解液水解度平均值為32.79%±0.33%,與預(yù)測值相近,偏差較小,說明通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的庸鰈魚骨酶解條件有效。

2.3 庸鰈魚骨酶解液中氨基酸組成分析

由表4可知,庸鰈魚骨酶解液中含有人體8種必需氨基酸且相對含量占33.3%,高于欒君笑等人測出的鰈魚骨蛋白胨中必需氨基酸含量28.17%[24],這可能與鰈魚種類、不同生長時期或者酶解條件不同等因素有關(guān)。因為牛奶中乳蛋白的必需氨基酸含量與FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)的必需氨基酸含量(1991)非常接近,被認(rèn)為牛奶是營養(yǎng)價值最高的食品之一[25],由表5可以看出,庸鰈魚骨酶解液中異亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、亮氨酸與FAO/WHO提出的理想含量基本接近,又因異亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、組氨酸、蘇氨酸與牛奶乳蛋白中含量基本接近,因此可以認(rèn)為,庸鰈魚骨酶解液的氨基酸組成合理,能夠滿足人體對必需氨基酸的營養(yǎng)需求,可利用價值較高。

表4 庸鰈魚骨酶解液氨基酸組成Table 4 Amino acid composition in enzymatic solution

注:a甜味氨基酸;b苦味氨基酸;c鮮味氨基酸;d藥效氨基酸;-呈味不明;*必需氨基酸。

表6 庸鰈酶解液主要游離氨基酸分別與南極磷蝦酶解液及三種貝類[13]游離氨基酸TAV比較Table 6 Comparison of the the taste activity values of free amino acids in enzymatic solution of hippoglossus boneand krill protein enzyme-hydrolysates and three common shellfish[13]

表5 庸鰈魚骨酶解液與乳蛋白中必需氨基酸含量和FAO/WHO推薦量比較Table 5 Comparison of the content of essential amino acidsin enzymatic solution and lactoproteinand recommended amount of FAO/WHO

另外,由表4可知,庸鰈酶解液中藥效氨基酸含量為34.2%,高于海參內(nèi)臟酶解粉中藥效氨基酸含量10.27%[22],其中含量最高的谷氨酸是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的重要神經(jīng)遞質(zhì),通過與其受體作用,調(diào)節(jié)正常腦內(nèi)幾乎所有的功能,包括學(xué)習(xí)功能和記憶功能[26]。甘氨酸則對大鼠TBI具有神經(jīng)保護(hù)作用,對TBI后相關(guān)炎癥因子過度增高的抑制可能部分解釋其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制[27]。而精氨酸對人體營養(yǎng)代謝與調(diào)控也有重要作用,如精氨酸是維持嬰兒生長發(fā)育不可缺少的氨基酸,對治療肝昏迷起到重要促進(jìn)作用[28]。因此,庸鰈酶解液可作為功能性食品基料用于特殊醫(yī)學(xué)用途食品、保健藥及保健食品中。

庸鰈魚骨酶解液除了具有較高的營養(yǎng)價值外,還具有豐富的呈味氨基酸。根據(jù)氨基酸的呈味特性,分為鮮味、甜味、苦味三種[29],甜味氨基酸和鮮味氨基酸作為良好呈味基料的基礎(chǔ),可呈現(xiàn)出良好滋味[30-31]。由表4可知,庸鰈魚骨酶解液中鮮味氨基酸含量為52.6%,甜味氨基酸含量為41.4%,分別高于南極磷蝦酶解液中鮮味氨基酸含量13.27%,甜味氨基酸含量30.24%,而庸鰈酶解液中苦味氨基酸為38.2%,則低于南極磷蝦酶解液中苦味氨基酸含量45.50%[14],說明庸鰈酶解液具有較好的風(fēng)味特性。

目前,采用呈味強(qiáng)度值(TAV)法評價單個游離氨基酸對不同酶解液滋味的貢獻(xiàn)大小,通常認(rèn)為,當(dāng)TAV大于1時,該物質(zhì)對樣品呈味有重要影響,并且數(shù)值越大,貢獻(xiàn)越大。由表6可以看出,谷氨酸的TAV(17.33)對庸鰈酶解液鮮味貢獻(xiàn)最大,并且遠(yuǎn)高于另外四種酶解液中TAV值,說明庸鰈酶解液鮮味顯著。通過TAV比較可知,丙氨酸對庸鰈酶解液甜味貢獻(xiàn)較大,另外,其與谷氨酸等鮮味物質(zhì)相互作用還具有提鮮效果[32],甘氨酸的TAV雖相對較小,但其本身具有的爽快甜味,不僅能減少苦味,還能從食物中去除不良的口味[33]。庸鰈酶解液中的苦味主要由賴氨酸和精氨酸呈現(xiàn),但精氨酸并不是苦味的貢獻(xiàn)者,其有增加呈味復(fù)雜性和提高鮮度的作用[34]。綜上,庸鰈魚骨中含量豐富的呈味氨基酸互相作用,使其呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的鮮味,品之味道鮮美。由此可得,庸鰈魚骨酶解液不僅具有很高的營養(yǎng)價值,而且風(fēng)味良好,既可以作為優(yōu)質(zhì)蛋白來源或特醫(yī)食品與其它功能食品呈味改良劑,也可以作為呈鮮調(diào)味料的研發(fā)基料。

3 結(jié)論

本研究通過對庸鰈魚骨酶解工藝條件研究,確定最佳酶解條件為液料比2∶1,加酶量為0.16%,酶解時間2 h,庸鰈魚骨酶解液水解度達(dá)到32.79%±0.33%;對其氨基酸組成進(jìn)行分析研究,發(fā)現(xiàn)庸鰈魚骨酶解液中含有人體所需的8種必需氨基酸且相對含量占33.3%,其中必需氨基酸的含量與牛奶中乳蛋白必需氨基酸含量及FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)的必需氨基酸含量(1991)基本接近,說明庸鰈魚骨的營養(yǎng)價值較高,另外,藥效氨基酸含量為34.2%,甜味氨基酸含量為41.4%,苦味氨基酸為38.2%,鮮味氨基酸含量為52.6%,其中含量最高的谷氨酸不僅具有很強(qiáng)的生物活性功能,而且其與天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸等鮮味氨基酸一起作用,使庸鰈魚骨酶解液呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的鮮味。表明庸鰈魚骨酶解液不僅具有很高的營養(yǎng)價值,而且風(fēng)味良好,既可以作為優(yōu)質(zhì)蛋白的來源或特醫(yī)食品與其它功能食品呈味改良劑,也可以作為呈鮮調(diào)味料的研發(fā)基料,具有很高的應(yīng)用和開發(fā)價值。