污水中絮凝細(xì)菌的分離及鑒定

雒曉芳1,蘇 強(qiáng),陳麗華3,*,張 巍,田瑜琳

(1.西北民族大學(xué)實驗教學(xué)部,甘肅蘭州 730030;2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730030;3.西北民族大學(xué)化工學(xué)院,甘肅蘭州 730030)

我國城市化進(jìn)程發(fā)展越來越快,水資源需求量也越來越大,水污染的程度也在大大的加深,污水處理就成了目前急需解決的大問題。絮凝沉淀法與生物處理、離子交換、吸附、化學(xué)氧化、電滲析、超濾和等方法相比較之下較為廉價、操作更為簡便。研究發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生絮凝劑的微生物種類很多[1],有文獻(xiàn)報道的絮凝微生物種類已達(dá)50多種。常見的細(xì)菌微生物絮凝劑產(chǎn)生菌有熒光單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、糞便假單胞菌(Pseudomonasfaecalic)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、糞便產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)等[2]。目前,在微生物處理水污染取得一定的進(jìn)展,現(xiàn)有很多生物科技公司已應(yīng)用污水的處理。吳迪[3]研究發(fā)現(xiàn)在污水中分離出的低溫菌種在適宜的環(huán)境條件下對污水COD、總磷去除率高達(dá)50%;曹惠忠等[4]研發(fā)出一種微生物處理污水的工藝,對污水有明顯的凈化,且無二次污染;霍前坤等[5]在活性污泥中篩選出幾株具有絮凝效果的微生物對污水的絮凝效果十分明顯,并研究了其影響絮凝作用的因素。楊勁峰等[6]將微生物絮凝劑M-127用于自來水原水處理,其處理效果優(yōu)于常規(guī)絮凝劑,而且對原水濁度的最大去除率高達(dá)93.89%。

因此,微生物絮凝劑作為一類新型絮凝劑,由于具有廣譜絮凝活性、可生物降解性以及使用的安全性,顯示了其在各種原水、廢水及污泥處理過程中的應(yīng)用前景,已成為國內(nèi)外新型水處理劑研究和開發(fā)的熱點[7]。王偉[8]從土壤中篩選出的一株圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)中提取到出絮凝劑GYS-9,該絮凝劑的絮凝率達(dá)到90%以上,其絮凝作用總體表現(xiàn)為對黏土類礦物具有較好的絮凝效果,對石英的絮凝過程中,絮凝劑GSY-9對石英主要起到分散作用。絮凝微生物對于煤泥水的絮凝過程,煤泥水中各組分以不同作用力在絮凝劑GSY-9分子上的各吸附位點進(jìn)行吸附[9-10]。楊琳等[11]從洱海底泥中篩選出的EH-5 菌株,其所產(chǎn)絮凝劑對啤酒廢水COD(化學(xué)需氧量)、色度、濁度的去除率分別為64.15%、69.57%、95.91%,對乳品廢水中 COD、色度、濁度的去除率分別達(dá)74.49%、75.00%、93.78%。Xing等[12]采用Klebsiellasp.對去除水溶液中的磺胺甲口惡唑進(jìn)行了研究,在最優(yōu)條件下磺胺甲口惡唑的去除率為53.27%。

本文以山東臨淄金嶺回族鎮(zhèn)的污水和淤泥為樣品,分離篩選具有絮凝作用的微生物菌株,并通過形態(tài)學(xué)觀察,生理生化特性和分子生物學(xué)測定的方法進(jìn)行了鑒定,希望能為研究絮凝微生物提供良好的菌種資源,并對污水治理提供良好的應(yīng)用潛能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所需污水、淤泥 采自于山東省臨淄區(qū)金嶺回族鎮(zhèn)的水渠;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、細(xì)菌生化鑒定管 杭州微生物有限責(zé)任公司;無水CaCl2、高嶺土、硫酸鋁鉀(明礬) 化學(xué)純,杭州微生物有限責(zé)任公司。

YXQ-LS-立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DHG-9140A新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 寧波江南儀器廠;干燥箱 寧波江南儀器廠;LRH-150B生化培養(yǎng)箱;ZWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;G10S UV-VIS雙光束紫外可見分光光度計 Thermo Fisher Scientific有限公司;S.SW-CJ-2F凈化工作臺 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;BA210生物顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物的分離純化 在污水渠的上中下游三處采集污水和淤泥,裝入密封袋4 ℃冰箱保藏。將采集的污水和淤泥分別以(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)七個梯度稀釋,每個梯度取100 μL涂布到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板中,30 ℃培養(yǎng)48 h觀察。

取涂布平板中不同形態(tài)的單個菌落以四區(qū)劃線法接種在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上,30 ℃培養(yǎng)48 h后對平板中出現(xiàn)的不同形態(tài)的單個菌落進(jìn)行連續(xù)多次的分離劃線培養(yǎng),直至菌落形態(tài)穩(wěn)定且單一,對分離的菌株,通過簡單染色,在顯微鏡下觀察其基本形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 絮凝微生物的篩選 硫酸鋁鉀組:分別取200、400、600、800、1000 mg/L的硫酸鋁鉀各2 mL,濃度為1%的氯化鈣溶液5 mL和4 g/L高嶺土懸濁液93 mL于250 mL三角燒瓶中,空白組以2 mL蒸餾水代替2 mL的硫酸鋁鉀。將三角瓶充分震蕩2 min后靜置8 min,再用微量加樣器吸取上清液,測定OD550值。通過公式(1)計算絮凝率[13-15]。

式(1)

式中:A1:空白組在OD550下的吸光度值;A2:試驗組在OD550下的吸光度值。

微生物絮凝組:挑取分離純化的菌株富集培養(yǎng):30 ℃、100 r/min條件下,震蕩培養(yǎng)48 h得到菌液。以高嶺土懸濁液模擬實際廢水作為絮凝對象,取4 g/L高嶺土懸濁液93 mL,濃度為1%的氯化鈣溶液5 mL、菌液2 mL加入250 mL三角瓶中。同時,用2 mL蒸餾水代替2 mL菌液其他條件不變作為空白組。將三角瓶充分震蕩2 min后靜置8 min,再用微量加樣器吸取上清液,測定OD550值。通過公式(1)計算得到絮凝率。

將初篩獲得的具有較高絮凝活性的菌種在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中30 ℃、100 r/min條件下擴(kuò)大富集培養(yǎng),獲得絮凝率穩(wěn)定且遺傳效果穩(wěn)定的菌株。

1.2.3 絮凝細(xì)菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將篩選得到的菌種接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,在30 ℃下培養(yǎng)48 h,對菌株進(jìn)行革蘭氏染色,油鏡下觀察菌體形態(tài)并拍照記錄。

1.2.3.2 生化鑒定 對經(jīng)篩選獲得的絮凝作用最優(yōu)的兩株菌以營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基30 ℃下培養(yǎng)24 h至對數(shù)生長期,將菌液按照無菌操作技術(shù)接入細(xì)菌生化鑒定管中,30 ℃、100 r/min條件下震蕩培養(yǎng)48 h后進(jìn)行觀察,并記錄其結(jié)果。

1.2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 將基因組對16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物為16S:27-F:AGAGTTTGATCM TGGCTCAG,1492-R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT PCR。擴(kuò)增得到的絮凝菌的PCR產(chǎn)物在濃度為1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,電泳電壓設(shè)置120 V,電泳時間設(shè)置30 min。之后在320 nm波長紫外燈下進(jìn)行觀察,將結(jié)果進(jìn)行拍照、分析,將目的片段進(jìn)行回收,送于武漢金開瑞生物工程有限公司做序列測序。

圖1 各菌株劃線培養(yǎng)Fig.1 The sub-culture plates of strains

表1 各菌株形態(tài)特征Table 1 Morphology characteristics of strains

PCR體系條件:H2O 17.8 μL,DNA Buffer 3 μL,dNTP 2 μL,上下引物均3 μL,DNA模板1 μL,DNA聚合酶0.2 μL,總體積30 μL。

PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s;60 ℃ 30 s;72 ℃ 1 min;35次循環(huán);72 ℃ 10 min;12 ℃ 保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將測序結(jié)果進(jìn)行正反序列拼接得到全序列,再將測序結(jié)果經(jīng)NCBI進(jìn)行Blast比對,選擇與比對序列相似度高的菌株,以MEGA5.1軟件進(jìn)行分析。利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行分析,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌株的形態(tài)學(xué)特征

經(jīng)分離純化所得的20株菌株進(jìn)行革蘭氏染色確定菌體形狀。劃線菌落形態(tài)見圖1,單菌落形態(tài)學(xué)描述見表1。菌株ZF1、ZF2、ZF3、ZF5、ZF8、ZF12、ZF15、ZF18和ZF20均為桿狀細(xì)菌,其他均為球狀;各菌落形態(tài)以圓形為主,且光滑濕潤;各菌落顏色多樣,大小不一。

2.2 菌株絮凝率比較

由圖2可知,硫酸鋁鉀濃度從200～1000 mg/L時,絮凝率持續(xù)上升,當(dāng)硫酸鋁鉀濃度為1000 mg/L時,絮凝率達(dá)到最高值,為58.91%,硫酸鋁鉀濃度在1000～1200 mg/L時,絮凝率下降。由表2可知,20株菌的絮凝率與硫酸鋁鉀絮凝率接近的只有兩株,分別為:ZF 1和ZF18,其絮凝率分別為57.68%、57.20%,其他18株的絮凝率均較低。

圖2 硫酸鋁鉀絮凝率Fig.2 The flocculation rate of KAl(SO4)2

試驗號B(絮凝率/%)試驗號B(絮凝率/%)空白-ZF 1123.78ZF 157.68ZF 1244.41ZF 237.31ZF 1351.85ZF 340.53ZF 1431.62ZF 430.00ZF 1541.47ZF 54.90ZF 1651.03ZF 642.23ZF 1722.95ZF 727.29ZF 1857.20ZF 842.06ZF 1945.60ZF 936.57ZF 2048.46ZF 1038.04

2.3 兩株菌的形態(tài)學(xué)結(jié)果

2.3.1 革蘭氏染色 將復(fù)篩得到的兩株菌絮凝能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行革蘭氏染色觀察,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,ZF 1為革蘭氏陰性短桿菌,ZF18為革蘭氏陽性長桿菌。

圖3 ZF 1(左)和ZF18(右)的革蘭氏染色 Fig.3 Gram stain of the strains

2.3.2 生理生化特性 由表3可知,ZF1分解麥芽糖、甘露醇、棉籽糖和山梨醇,不分解蔗糖、衛(wèi)矛醇、肌醇和乳糖;氧化酶沒反應(yīng)可能為腸桿菌科;靛基質(zhì)無反應(yīng);可產(chǎn)生DNA酶;硝酸鹽未還原;枸櫞酸鹽陰性為腸桿菌科的埃希菌屬、志賀菌屬和愛德華菌屬等;硫化氫為陰性可排除愛德華菌屬;明膠未液化;O/F實驗陽性發(fā)酵型,進(jìn)一步確認(rèn)為腸桿菌。ZF18不分解麥芽糖、甘露醇、棉籽糖、山梨醇、蔗糖、衛(wèi)矛醇、肌醇和乳糖;氧化酶陽性為假單胞菌;靛基質(zhì)有氣泡;可產(chǎn)生DNA酶;硝酸鹽被還原;枸櫞酸鹽為陽性;O/F實驗為陰性;硫化氫為陽性;明膠液化進(jìn)一步確定其為假單胞菌。

表3 兩株菌的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemicalcharacteristics of these two strains

注:+代表反應(yīng)呈陽性;-代表 反應(yīng)呈陰性。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 ZF 1和ZF18的PCR擴(kuò)增 將篩選得到的兩株菌絮凝能力較強(qiáng)的菌株ZF1和ZF18進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,結(jié)果如圖4所示,可知,ZF1的擴(kuò)增條帶大約為500 bp左右,ZF18的擴(kuò)增條帶為1800 bp左右。

圖4 ZF 1和ZF18的 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electropherogram of PCR products of ZF 1 and ZF18

2.4.2 ZF 1和ZF18菌株的16S rDNA序列比對 ZF1菌株的16S rDNA PCR產(chǎn)物序列與該屬多個種的相似度均很高,與Shigellasp.、Escherichiacoli等相似度均為99%;而ZF18菌株的16S rDNA PCR產(chǎn)物序列與該屬多個種的相似度均很高,與Pseudomonassp. hswX21、Bacterium FK2等相似度均為100%,其余均為99%;由于兩株菌與序列比對的其他菌屬的相似程度均高于99%,因此對兩株菌建立系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行確定。

表4 ZF1菌株的16S rDNA PCR產(chǎn)物在NCBI上進(jìn)行序列比對Table 4 The sequence alignment of the ZF1 strain

表5 ZF18菌株的16srDNA PCR產(chǎn)物在NCBI上進(jìn)行序列比對Table 5 The sequence alignment of the ZF18 strain

2.4.3 ZF 1和ZF18菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 利用MEGA5.1軟件對ZF1和ZF18兩株菌的16S rDNA的核酸序列和BLAST結(jié)果中的20個序列進(jìn)行多重比對并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖5,ZF1與Shigellasp.(志賀氏菌)位于同一個分支上,與其同源性高達(dá)99%,具有較進(jìn)的遺傳距離,結(jié)合生化鑒定結(jié)果分析,將ZF1絮凝菌歸屬于志賀氏菌菌屬。圖6中ZF18與Pseudomonasfluorescens(假單胞菌)親源關(guān)系最近,與其同源性達(dá)到100%。根據(jù)革蘭氏染色和生化鑒定等實驗結(jié)果綜合分析,確定ZF18菌株歸屬于假單胞菌菌屬。

圖5 ZF1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree of the ZF1 strain

圖6 ZF18系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 The phylogenetic tree of the ZF18 strain

3 討論與結(jié)論

本研究從山東省臨淄區(qū)金嶺回族鎮(zhèn)的水渠中采集水樣,經(jīng)分離、篩選并富集培養(yǎng)后獲得2株絮凝性能穩(wěn)定且活性良好的微生物絮凝菌ZF1和ZF18,其絮凝率分別為為57.68%、57.20%。與周禮等[18]從活性污泥種篩選出一株高效絮凝劑產(chǎn)生菌株,在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基中絮凝率達(dá)95%相比而言,本實驗篩選到的菌株仍需深入研究,例如對大顆粒物絮凝率的高低、菌株生長和絮凝所需要的最佳條件和適宜的外界環(huán)境的優(yōu)化處理,絮凝微生物的絮凝分子提取工藝以及絮凝劑的開發(fā)利用等[19]。

本實驗獲得的ZF1(Shigellasp.)屬于志賀氏菌菌屬,是一類革蘭氏陰性桿菌,是人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌[20],不僅具有很強(qiáng)的致病力、具有強(qiáng)烈的內(nèi)毒素且志賀氏菌A群Ⅰ型及部分Ⅱ型菌株還可產(chǎn)生外毒素,后續(xù)研究變得較為復(fù)雜。ZF18屬于熒光假單胞桿菌菌屬(Pseudomonasfluorescens),是奶類、蛋類在低溫條件下腐敗變質(zhì)的主要細(xì)菌之一。在臨床上最多見的是血液及血制品被熒光假單胞菌污染,當(dāng)病人輸入了被熒光假單胞菌污染的血液及血制品后,可出現(xiàn)敗血癥、感染性休克和血管內(nèi)凝血等嚴(yán)重后果。隨著我國城市化進(jìn)程的不斷加快和經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展,工業(yè)廢水、生活污水、畜業(yè)廢水產(chǎn)生以及排放量都在不斷地增加。所以,污水處理的問題也變得十分嚴(yán)峻,勢在必行?，F(xiàn)階段,微生物絮凝劑對于污水處理的效果十分良好而且不容易產(chǎn)生污染[21]。在廣大廢水處理方式中,微生物絮凝劑憑借該優(yōu)勢脫穎而出,污泥脫水率從75.60%提高到84.2%,污泥含水率從95.82%降至76.21%[22]?？梢?我們的研究不僅豐富了污水中絮凝微生物的品種,而且在后期治理污水等方面研究也有一定借鑒價值和應(yīng)用潛力。