腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)、抑菌和黏附能力的影響

劉 娜,安曉萍,張倩茹,王 園,王瑞芳,齊景偉

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

腐植酸是一類廣泛存在于自然界中的結(jié)構(gòu)功能十分復(fù)雜的化合物[1],常以鈉鹽形式存在,極易溶于水,具有弱酸性、絡(luò)合性、膠體性和吸附性等特性[2]。腐植酸類物質(zhì)是多功能的高分子化合物,具有很大的內(nèi)表面積,吸附、交換、絡(luò)合和螯合的能力較強(qiáng),多在農(nóng)業(yè)上作為農(nóng)藥、肥料、土壤改良劑等使用。腐植酸在動(dòng)物生產(chǎn)上具有提高動(dòng)物免疫力、抗病力,保護(hù)動(dòng)物胃腸道功能,吸附霉菌毒素、促進(jìn)瘤胃氮循環(huán)、提高尿素利用率,減輕動(dòng)物糞便等生物學(xué)功能,在單胃動(dòng)物和反芻動(dòng)物生產(chǎn)中有一定的應(yīng)用[3]。腐植酸鈉具有抗菌、抗炎和抗病毒等作用,有相關(guān)研究報(bào)道其具有促進(jìn)益生菌生長(zhǎng),抑制有害菌繁殖的作用[4-7],但近幾年腐植酸鈉作用于微生物領(lǐng)域的研究鮮有報(bào)道。

植物乳桿菌作為大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵菌株,常見(jiàn)于許多蔬菜、牛奶和肉類等發(fā)酵制品中,能通過(guò)胃定植于腸道中發(fā)揮重要作用[8]。植物乳桿菌在腸黏膜的黏附是其在機(jī)體內(nèi)定植并產(chǎn)生生物屏障作用的第一步,具有抑制病原菌入侵和增殖等重要生理功能,因此黏附能力是評(píng)價(jià)植物乳桿菌定植形成穩(wěn)定的菌群發(fā)揮益生作用的重要指標(biāo)之一。黏附能力又與菌株的凝集能力和表面疏水性有關(guān)。表面疏水性是通過(guò)測(cè)定菌體細(xì)胞表面的物化性質(zhì)來(lái)間接反映其黏附性強(qiáng)弱的。菌株的凝集包括自凝集和與致病菌的共凝集,分別指同一菌株之間的凝集現(xiàn)象及不同菌株之間的凝集現(xiàn)象。研究證明,具有較強(qiáng)凝集能力的菌株可能具有更強(qiáng)的腸道定殖能力和抑制病原菌的能力[9]。

腐植酸鈉來(lái)源天然,無(wú)污染、無(wú)殘留,無(wú)毒副作用,應(yīng)用前景廣闊。但近幾年在微生物發(fā)酵領(lǐng)域研究較少,尤其是腐植酸鈉對(duì)益生菌的抑菌和黏附作用研究鮮有報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)在液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的腐植酸鈉,首次研究其對(duì)植物乳桿菌的抑菌率、自凝集率、與大腸桿菌的共凝集率和表面疏水性的影響,為腐植酸鈉在益生菌發(fā)酵領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù),并對(duì)腐植酸鈉作用于益生菌開(kāi)發(fā)功能性食品或飼料添加劑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌P8(LactobacillusplantarumP8) 由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供,大腸桿菌A2分離于羔羊腸道內(nèi),由內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心保存提供;腐植酸鈉 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;高碘酸鈉、氯化鋰、甲醇 均為分析純;MRS液體培養(yǎng)基、022010營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

JJ-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;SYQ-DSX-28OB手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廣;CP224C電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司;GX2智力光照培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司;Epoch2酶標(biāo)儀 雷康恒泰(北京)商貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的制備和菌數(shù)的調(diào)整 將-20 ℃冷凍保存的植物乳桿菌P8菌種接種于MRS斜面培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)48 h,待形成菌落后挑取單個(gè)菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h,即得P8種子液。將-20 ℃冷凍保存的大腸桿菌A2菌種接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯斜面培養(yǎng)基中,36 ℃靜置培養(yǎng)48 h,待形成菌落后挑取單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基,置于搖床中36 ℃,120 r/min培養(yǎng)24 h,即得A2種子液。

使用平板計(jì)數(shù)法得出P8種子液中的菌落數(shù)為4×109cfu/mL,A2種子液中菌落數(shù)為1×109cfu/mL。將P8和A2菌落數(shù)均調(diào)整為108cfu/mL進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 不同濃度腐植酸鈉溶液的配制 準(zhǔn)確稱取0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 g的腐植酸鈉,分別放入99.5、99.0、98.0、96.0和92.0 mL滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中,攪拌均勻,使腐植酸鈉充分溶解,過(guò)濾,去掉濾渣,得到添加0%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%和8.0%(m/v)腐植酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基。

1.2.3 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線的影響 在添加不同濃度腐植酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基中分別接種5%的P8種子液,靜置培養(yǎng)48 h,每4 h測(cè)定其600 nm下的OD值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)點(diǎn)的OD值為縱坐標(biāo),繪制出各組植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線。以不添加腐植酸鈉組作為對(duì)照組,對(duì)比添加不同濃度腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線的影響。

1.2.4 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌抑菌能力的影響 在添加不同濃度腐植酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基中分別接種5%的P8種子液,靜置培養(yǎng)24 h。分別吸取培養(yǎng)好的P8菌液和A2菌液各10 mL,以5000 r/min的速度離心10 min,取上清液待用。取96孔板,每孔分別加入100 μL P8上清液和100 μL相同濃度的A2上清液,置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h,分別在0和24 h測(cè)定其在600 nm下的吸光光度值。抑菌率計(jì)算公式如下:

式(1)

式中:B0為初始時(shí)間時(shí)600 nm下的吸光光度值;B1為24 h時(shí) 600 nm下的吸光光度值。

1.2.5 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌凝集能力的影響

1.2.5.1 自凝集能力的影響 在添加不同濃度腐植酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基中分別接種5%的P8種子液,靜置培養(yǎng)24 h。以5000 r/min的速度離心10 min后收集菌體,使用pH為7.2的PBS洗滌2次后于PBS中重懸,調(diào)整菌數(shù)為108cfu/mL。取5 mL等量的細(xì)胞菌懸液裝入離心管中,混勻后在室溫下靜置。在0、2、4、6和8 h分別取0.5 mL上部菌懸液,加到1.5 mL的PBS中,混勻后測(cè)定該菌懸液在600 nm下的吸光值,以PBS緩沖液為空白對(duì)照。凝集率的計(jì)算公式如下[10]:

式(2)

式中:A0為0 h測(cè)定的600 nm下的吸光光度值;At為不同時(shí)間在600 nm的吸光光度值。

1.2.5.2 與大腸桿菌共聚集能力的影響 P8菌懸液的制備同1.2.5.1,A2采用同樣的方法,重懸于PBS中,調(diào)整菌數(shù)為108cfu/mL。分別吸取3 mL P8菌懸液和A2菌懸液于試管中,漩渦混合30 s,分別于 0、2、4、6、8 h吸取上部菌懸液測(cè)定其在600 nm下的吸光值[11]。對(duì)A2的凝集率計(jì)算公式如下:

式(3)

式中:A0為P8和A2混合0 h時(shí)在600 nm下測(cè)定的吸光光度值;At為混合液在不同時(shí)間的吸光光度值。

1.2.6 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌表面疏水能力的影響 表面疏水性能的測(cè)定采用微生物黏附碳?xì)浠衔锓?BacteriaAdhesion To Hydrocarbons,BATH)[12]。P8菌懸液的制備同1.2.5.1,分別吸取6 mL P8菌懸液與1 mL二甲苯渦旋混合60 s,停頓10 s,再渦旋混合60 s,室溫下靜置60 min分層。取下層水相,測(cè)定其在600 nm下的吸光值,以PBS緩沖液為空白對(duì)照。表面疏水率計(jì)算公式如下:

式(4)

式中:H0為與二甲苯混合前600 nm下的吸光光度值;H1為與二甲苯混合后600 nm的吸光光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以運(yùn)用SAS 9.2軟件,采用方差分析(ANOVA)并用Duncan’s方法對(duì)各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較,P<0.05為差異顯著,采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線的影響

由圖1可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),各組間菌體數(shù)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在0～20 h之間,各時(shí)間點(diǎn)的OD值較為接近;在24～48 h之間,各時(shí)間點(diǎn)的OD值有一定差別,總體趨勢(shì)上是0.5%腐植酸鈉組>對(duì)照組>1%組>2%～8%組。雖然在24～48 h腐植酸鈉0.5%組吸光度值高于對(duì)照組,但差異不顯著。

圖1 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1 Effects of sodium humate on thegrowth of Lactobacillus plantarum

2.2 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌抑菌作用的影響

腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌抑菌作用的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知,各組的植物乳桿菌上清液對(duì)大腸桿菌均有抑制作用。添加0.5%～1.0%腐植酸鈉組的抑菌率顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而添加2%～8%腐植酸鈉組抑菌率顯著(P<0.05)低于對(duì)照組。添加0.5%和1.0%腐植酸鈉組的抑菌率分別為26.10%和39.10%,比對(duì)照組的21.9%提高了19.18%和75.53%。說(shuō)明添加0.5%～1.0%腐植酸鈉可使植物乳桿菌的抑菌率提高19.18%～75.53%。

圖2 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌抑菌率的影響Fig.2 Effect of sodium humate on theantibacterial rate of Lactobacillus plantarum注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05);圖4～圖7同。

圖3 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌自凝集率的影響Fig.3 Effects of sodium humate on theauto-aggregation of Lactobacillus plantarum注:相同添加量不同字母表示差異顯著,P<0.05;相同添加量相同字母表示差異不顯著,P>0.05。

2.3 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌凝集能力的影響

2.3.1 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌自凝能力的影響 圖3為腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌自凝能力的影響。各組的自凝集率隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)出不同的規(guī)律。對(duì)照組的自凝率隨著時(shí)間的增加而增加,在8 h時(shí)最高,為61.01%;腐植酸鈉0.5%～8.0%組的自凝率則先增加后降低,其中,0.5%～1.0%組在4 h時(shí)自凝集率最高,分別為44.84%和48.51%,而2%～8%組的自凝集率在6 h最高,分別為63.45%和66.77%。說(shuō)明添加0.5%～8.0%腐植酸鈉能使植物乳桿菌的自凝集率提前2～4 h達(dá)到最高。

進(jìn)一步對(duì)比不同時(shí)間點(diǎn)腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌自凝集率的影響。由圖4可知,在2 h時(shí),添加4%～8%腐植酸鈉可顯著提高植物乳桿菌的自凝集率(P<0.05),比對(duì)照組提高45.21%～95.98%;在4 h時(shí),添加4%～8%腐植酸鈉可顯著提高植物乳桿菌的自凝集率(P<0.05),比對(duì)照組提高16.89%～22%;在6 h時(shí),添加4%～8%腐植酸鈉可顯著提高植物乳桿菌的自凝集率(P<0.05),比對(duì)照組提高28.81%～35.55%;在8 h時(shí),添加4%～8%腐植酸鈉與對(duì)照組的自凝集率差異不顯著(P>0.05),而0.5%～2.0%腐植酸鈉組的自凝集率則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)合圖3和圖4可知,添加4%～8%腐植酸鈉在2～6 h可顯著提高植物乳桿菌的自凝集率(P<0.05)。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌自凝集率的影響.Fig.4 Effects of sodium humate on the auto-aggregation of Lactobacillus plantarumat different points in time注:(1)～(4)分別為2、4、6、8 h;圖6同。

2.3.2 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌與大腸桿菌共聚能力的影響 圖5為腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌與大腸桿菌共凝集能力的影響。由圖5可知,在靜置凝集的8 h過(guò)程中,各組的凝集率均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,在8 h達(dá)到最大。不同時(shí)間點(diǎn)各組的差異見(jiàn)圖6。由圖6可知,在2 h時(shí),添加4%～8%腐植酸鈉組植物乳桿菌與大腸桿菌的共凝集率顯著高于對(duì)照組(P<0.05),0.5%～1.0%組則顯著低于對(duì)照組(P<0.05),2.0%添加量組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05);在4 h時(shí),添加0.5%～8%腐植酸鈉可顯著提高植物乳桿菌的自凝集率(P<0.05);在6 h時(shí),添加1%～8%腐植酸鈉組的共凝集率顯著高于對(duì)照組(P<0.05);在8 h時(shí),添加0.5%～4.0%腐植酸鈉組的共凝集率顯著高于對(duì)照組(P>0.05)。說(shuō)明添加不同濃度的腐植酸鈉在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)植物乳桿菌與大腸桿菌的共凝集率由不同的影響。結(jié)合圖5和圖6可得,添加4%～8%腐植酸鈉在2～6 h可提高植物乳桿菌與大腸桿菌的共凝集率,說(shuō)明添加一定濃度的腐植酸鈉具有促進(jìn)液態(tài)基質(zhì)中植物乳桿菌與致病菌聚集的能力。

圖5 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌與大腸桿菌共凝集能力的影響Fig.5 Effects of sodium humate on the co-agglutinationrate with Escherichia coli of Lactobacillus plantarum

2.4 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌表面疏水能力的影響

由圖7可知,添加2%～4%腐植酸鈉組的表面疏水率顯著高于對(duì)照組(P<0.05),較對(duì)照組提高了112.5%～128.57%;添加0.5%組的表面疏水率顯著(P<0.05)低于腐植酸鈉組,添加1%和8%組的表面疏水率與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明添加2%～4%腐植酸鈉可使植物乳桿菌的表面疏水率提高112.5%～128.57%。

圖7 腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌表面疏水能力的影響Fig.7 Effects of sodium humate on thesurface hydrophobicity of Lactobacillus plantarum

3 討論

生長(zhǎng)曲線直觀地顯示了細(xì)菌在培養(yǎng)過(guò)程中所表現(xiàn)出來(lái)的生長(zhǎng)規(guī)律。同一種細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下,其生長(zhǎng)曲線和菌體活力不同[13]。本試驗(yàn)中,添加不同濃度的腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的影響,但差異不顯著。原因可能是在液體培養(yǎng)過(guò)程中,不同濃度腐植酸鈉的膠體特性和吸附能力不同,對(duì)植物乳桿菌的吸光度值產(chǎn)生了影響。該結(jié)果還需進(jìn)一步采用活菌計(jì)數(shù)的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌與大腸桿菌共凝集率的影響Fig.6 Effects of sodium humate on the co-agglutination rate with Escherichia coli of Lactobacillus plantarumat different points in time

添加0.5%～1.0%腐植酸鈉可使植物乳桿菌的抑菌率提高19.18%～75.53%。其中1.0%的添加量抑菌效果最好?？赡苁怯捎诟菜徕c提高了植物乳桿菌的自凝集能力和與大腸桿菌的共凝集能力。自凝集能力提高可能使植物乳桿菌定殖能力更好,而共聚能力提高可能掩蓋大腸桿菌的表面物質(zhì),使大腸桿菌不能特異性的與宿主細(xì)胞表面分子受體結(jié)合,從而達(dá)到抑制大腸桿菌的作用[14]。

大量研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌的黏附能力與其自凝集能力和表面疏水性相關(guān),具有較強(qiáng)的自凝集能力和表面疏水性的菌株具有更高的黏附能力,反之則黏附能力較低[14,10]。乳酸菌的凝集能力與病原菌共凝集的能力和其黏附宿主細(xì)胞的能力具有相關(guān)性,凝集能力較強(qiáng)的菌株可能定殖能力更好,可以更有效借助共凝集能力清除致病菌[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加4.0%～8.0%腐植酸鈉在2～6 h可顯著提高植物乳桿菌的自凝集率和與大腸桿菌的共聚集率。菌體的自聚集能力可促進(jìn)其生物膜的形成,使菌體在腸道內(nèi)提前占位,進(jìn)而抑制病原菌的入侵[16]。菌株的表面疏水性是評(píng)價(jià)細(xì)菌黏附性的重要指標(biāo)[17]。通過(guò)測(cè)定腐植酸鈉對(duì)植物乳桿菌表面疏水率的影響,得到了添加2.0%～4.0%腐植酸鈉可使植物乳桿菌的表面疏水性提高112.5%～128.57%的結(jié)果。說(shuō)明了添加一定濃度的腐植酸鈉可以提高植物乳桿菌的黏附能力。

4 結(jié)論

添加0.5%～1.0%腐植酸鈉可使植物乳桿菌的抑菌率提高19.18%～75.53%;添加4%～8%腐植酸鈉在2～6 h可以提高植物乳桿菌的自凝集率和與大腸桿菌的共聚集率。添加2%～4%腐植酸鈉可使植物乳桿菌的表面疏水率提高112.5%～128.57%。綜上所述,選擇合適濃度的腐植酸鈉可提高植物乳桿菌的抑菌和黏附能力。本研究可為腐植酸鈉在益生菌發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù),并對(duì)利用腐植酸鈉作用于益生菌開(kāi)發(fā)功能性食品或飼料添加劑奠定了基礎(chǔ)。