百里香酚對食源陰溝腸桿菌生物膜形成的抑制作用

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(1.東北農業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030;2.江蘇省農業(yè)科學院農產品加工研究所,江蘇南京 210014)

陰溝腸桿菌是一種革蘭氏陰性短桿菌,廣泛存在于環(huán)境和動物腸道中的條件致病菌,同時也是肉制品中的一種主要腐敗菌,同肉制品中分離得到的多數腐敗菌相比,該菌具有很強的生物膜形成能力[1-2]。自1978年Costerton首先發(fā)現并提出了生物膜(biofilm)理論以來[3]。研究發(fā)現引起人類、畜禽疾病的許多細菌都可以形成生物膜[4-5],在食品加工生產中,多數食源性致病菌可以在不同的加工材料表面形成生物膜,以生物膜形式存在的致病菌,耐受性更強,在加工過程中固著在加工設備表面成為潛在的污染源[6-9],中國食源性疾病監(jiān)測網的調查結果顯示,27%微生物污染來自于食品加工設備等造成的交叉污染,是最主要的污染途徑[10]。林學海[11]等對嬰幼兒食品生產環(huán)境中可能存在的陰溝腸桿菌污染點取樣并進行了溯源分析,發(fā)現生產環(huán)境可能成為陰溝腸桿菌二次污染源,原料品中污染的陰溝腸桿菌經過一系列工序加工后,仍然存在于后續(xù)半成品或成品中。

近年來,植物精油作為開發(fā)天然食品防腐和抑菌物質的主要來源而受到食品加工工業(yè)的關注,百里香酚是牛至和百里香等植物精油的主要成分,大量研究表明,百里香酚對食源性致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌[12]、沙門氏菌[13-14]、紫色色桿菌[15]等有抑菌作用并且對其生物膜的形成有抑制作用。百里香酚目前已被歐盟委員會認定可作為食品中的調味劑(Regulation EU 872/2012),且被美國食品藥品管理局認定為公認安全的食品添加劑(21 CFR 182.60)。但百里香酚對食源性致病菌陰溝腸桿菌生物膜的抑制作用國內外未見報道。

本研究以從低溫肉制品中分離的優(yōu)勢腐敗菌陰溝腸桿菌C4為研究對象,研究百里香酚在亞抑菌濃度下對陰溝腸桿菌生物膜形成的抑制作用。為低溫食品的防腐保鮮新技術開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

陰溝腸桿菌C4 為本實驗室從低溫肉制品中分離并保存;百里香酚(純度>99%) 由湖北鑫潤德化工有限公司提取自植物百里香;胰蛋白胨大豆肉湯(Trypticase Soy Broth TSB)培養(yǎng)基 北京陸橋技術責任有限公司;NuncTMLab-TekTM8孔腔室蓋玻片 美國賽默飛;LIVE/DEAD Bac LightTM試劑盒 美國賽默飛;Costar 24孔/96孔細胞培養(yǎng)板 美國Corning公司;RNA prep Pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒 TaKaRa。

Bio Photo meter plus核酸蛋白測定儀 德國 Eppendorf;EVO-LS10掃描電子顯微鏡 德國蔡司;PE(Ultra View VOX)轉盤式激光共聚焦顯微鏡 鉑金埃爾默公司;Gen5 全波長酶標儀 美國博騰。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化和配制百里香酚溶液 將陰溝腸桿菌C4接種于TSB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對數期后在TSB瓊脂平板上劃線,37 ℃過夜培養(yǎng)后挑選典型單菌落接種到5 mL新鮮TSB培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,制成含40%甘油的菌懸液,凍存在-40 ℃冰箱中。每次試驗前,取凍存的菌液1%接種于5 mL 新鮮TSB培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min活化12 h備用。百里香酚使用無水乙醇配制濃度為20480 μg/mL的母液置于4 ℃ 冰箱中,后續(xù)每次試驗前稀釋備用并使用0.22 μm 濾膜過濾。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)及生長曲線的測定 將活化后的菌液按照1%接種到5 mL新鮮TSB培養(yǎng)基中,加入過濾后的百里香酚,菌液和百里香酚按比例混合,二倍稀釋法,試管內百里香酚終濃度分別為256、128、64、32 μg/mL,對照組為未加入百里香酚的菌液。37 ℃,200 r/min,每隔2 h取各梯度菌液200 μL加入到96孔板中,Gen5全波長酶標儀測定24 h內孔內吸光度OD600值,繪制陰溝腸桿菌生長曲線,確定百里香酚對陰溝腸桿菌C4的MIC。

1.2.3 對陰溝腸桿菌C4泳動能力的抑制作用 采用軟瓊脂平板法[16-18]測定泳動能力(swimming和swarming),分別配制swimming培養(yǎng)基(10 g/L胰蛋白胨、5 g/L氯化鈉、2.5 g/L葡萄糖和0.3%瓊脂)和swarming培養(yǎng)基(25 g/L LB培養(yǎng)基、0.5 g/L葡萄糖和0.5%瓊脂),高溫滅菌冷卻至60 ℃以下后加入百里香酚母液,使其培養(yǎng)基內百里香酚濃度為32、64、128 μg/mL,對照組為不添加百里香酚的培養(yǎng)基。取活化后的菌液1%接種到5 mL新鮮TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數期,12000×g離心5 min,移除上清液,無菌PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌三次,用無菌生理鹽水調節(jié)菌懸液的OD600為0.8～1.0之間,每個配制的平板中心表面滴加3 μL菌懸液,分別于37 ℃下靜置培養(yǎng)8、20 h。拍照測定細菌擴散菌圈的直徑大小。

1.2.4 對陰溝腸桿菌C4生物膜形成的抑制作用

1.2.4.1 對生物膜內活菌總數的測定 按1.2.2的方法配制百里香酚終濃度為32、64、128 μg/mL的菌液,對照組為不添加百里香酚的菌液,24孔板細胞培養(yǎng)板中,每孔添加1 mL不同濃度的菌液,分別培養(yǎng)至12、24、48、72 h,每隔24 h更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)至待測時間點,將上層培養(yǎng)基緩慢吸出,無菌PBS緩沖液(pH=7.4)輕柔洗滌兩次并吸出多余緩沖液,每孔添加1 mL無菌生理鹽水,采用無菌棉簽仔細擦洗孔壁及孔底邊緣處的生物膜,將棉簽及孔內液體全部轉移到9 mL無菌生理鹽水試管中,渦旋震蕩5 min,便于使棉簽上附著的及生物膜內包裹的細菌充分游離到液體中[19]。10倍梯度稀釋至適宜梯度,吸取100 μL液體到瓊脂平板上,涂布均勻于恒溫培養(yǎng)箱,37 ℃,靜置培養(yǎng)24 h,菌落計數。

1.2.4.2 對生物膜胞外多糖的含量測定 按1.2.2的方法配制百里香酚終濃度為32、64、128 μg/mL的菌液,對照組為不添加百里香酚的培養(yǎng)基,24孔板細胞培養(yǎng)板中,每孔添加1 mL不同梯度的菌液,分別培養(yǎng)至12、24、48、72 h,每隔24 h更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)至待測時間點,將上層培養(yǎng)基緩慢吸出,無菌PBS緩沖液(pH=7.4)輕柔洗滌兩次并吸出多余緩沖液,每孔添加1 mL無菌PBS緩沖液(pH=7.4),沖洗培養(yǎng)孔中的生物膜并收集溶液,4 ℃,5000×g離心20 min,收集菌泥,0.85%(v/v)NaCl水溶液(0.22%(v/v)甲醛)重懸菌泥,80 ℃,加熱30 min,將加熱后的菌懸液4 ℃,15000×g 離心30 min,收集上清液備用[19]。使用苯酚-硫酸法測定生物膜胞外多糖的含量[20]。

1.2.5 對陰溝腸桿菌C4生物膜微觀狀態(tài)的影響

1.2.5.1 掃描電鏡(SEM)觀察 SEM可以用于觀察不同時間點生物膜內菌體聚集后的微觀狀態(tài)。按1.2.2的方法配制百里香酚濃度為1/4 MIC(64 μg/mL)的菌液,對照組為不添加百里香酚的菌液,NuncTMLab-TekTM8孔腔室蓋玻片中每孔添加400 μL菌液,分別培養(yǎng)至12、24、48、72 h,每隔24 h更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)至待測時間點,將上層培養(yǎng)基緩慢吸出,無菌PBS緩沖液(pH=7.4)輕柔洗滌兩次并吸出多余緩沖液,室溫晾干,去除上層隔板,將載玻片按照樣品區(qū)間切割后,2.5%(v/v)戊二醛溶液浸泡,4 ℃固定12 h后晾干,使用1%(v/v)的鋨酸固定90 min,然后使用含量為30%、50%、80%、90%、100%(v/v)乙醇溶液梯度脫水[21],每次10 min,然后再使用100%(v/v)叔丁醇洗滌。將處理后的玻片噴金用于SEM觀察,拍照時選取放大倍數為5000倍[22]。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence for real-time PCR

1.2.5.2 激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察 CLSM可以用來觀察不同培養(yǎng)時間下生物膜成膜厚度的變化。按1.2.2的方法配制梯度為1/4 MIC(64 μg/mL)的菌液,對照組為不含百里香酚的菌液,NuncTMLab-TekTM8孔腔室蓋玻片中每孔添加400 μL菌液,分別培養(yǎng)至12、24、48、72 h,每隔24 h更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)至待測時間點,將上層培養(yǎng)基緩慢吸出,無菌PBS緩沖液(pH=7.4)輕柔洗滌兩次并吸出多余緩沖液,室溫晾干。使用LIVE/DEAD Bac LightTM試劑盒對生物膜進行染色,試劑盒中含有的探針SYTO-9與探針PI能使活、死細胞在激光共聚焦顯微鏡下呈現綠色、紅色熒光,配制染色液,每1 mL無菌 PBS溶液(pH=7.4)中分別加入3 μL試劑盒中的兩種染液,染液現配現用并避光保存。在晾干的8孔腔室板中每孔加入染色液400 μL,避光染色30 min,吸除染液后使用無菌PBS溶液(pH=7.4)洗去多余探針,室溫晾干,加入2.5%(v/v)戊二醛溶液固定30 min,吸除戊二醛后室溫晾干,去除上層腔室隔板,在底板樣品表面滴加Bac LightTMMounting Oil,加蓋玻片,-20 ℃避光保存用于CLSM觀察。觀察時SYTO-9激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為485和498 nm,PI的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為535和637 nm,選取60倍油鏡[22-23]。

1.2.6 對陰溝腸桿菌C4生物相關基因表達量的影響 按1.2.2方法制備處理組為百里香酚濃度為1/4 MIC(64 μg/mL)的菌液,對照組為不添加百里香酚的菌液,每孔1 mL菌液滴加到24孔板中,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,移除上層培養(yǎng)基并洗滌后每孔加入1 mL無菌PBS溶液,充分將孔壁及孔底生物膜沖洗溶于液體中,12000×g,4 ℃離心2 min,收集菌泥,使用RNA prep Pure培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒提取試劑盒按照說明提取菌體總RNA后,立即反轉錄為cDNA,反轉錄反應體系20 μL,其中5×PrimeScript RT Master Mix混合液6 μL、RNA10 μL和RNase Free ddH2O 14 μL。反應條件:37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃ hold。反轉錄后得到的cDNA存放在-20 ℃冰箱中。實時熒光定量PCR反應體系20 μL,其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 L、引物2 μL、cDNA 2 μL、RNase Free ddH2O 6 μL。反應條件:95 ℃ 30 s預變性;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s 40個循環(huán);95 ℃ 5 s,60 ℃ 60 s 1個循環(huán);50 ℃ 30 s延伸。表1為熒光定量PCR引物序列,目標基因的相對表達采用2-ΔΔCt法評估目標基因的相對表達變化,ΔΔCt=Ct處理組(Ct目標基因-Ct管家基因)-Ct對照組(Ct目標基因-Ct管家基因),以Log2(2-ΔΔCt)>1或Log2(2-ΔΔCt)<-1做為基因高表達的評價標準。

1.3 數據處理

每組試驗重復三次,以平均值和標準差表示,試驗數據使用Statistix 8.0軟件進行顯著性分析,(P<0.05為差異顯著)。圖片處理使用Origin 9.0。

2 結果與分析

2.1 對陰溝腸桿菌C4的最小抑菌濃度(MIC)及生長曲線

圖2 百里香酚對陰溝腸桿菌C4泳動能力的影響Fig.2 Effect of thymol on mobile ability of E. cloacae C4注:A:菌體泳動照片;B:Swimming泳動;C:Swarming泳動;大寫字母不同代表不同濃度百里香酚處理差異性顯著(P<0.05)。

圖1表示不同濃度百里香酚處理下陰溝腸桿菌C4的生長曲線,如圖所示百里香酚對陰溝腸桿菌C4的最小抑菌濃度為256 μg/mL。當采用質量濃度為256 μg/mL的百里香酚處理時,陰溝腸桿菌C4生長過程被完全抑制;質量濃度為128 μg/mL的百里香酚處理時,抑制部分細菌的生長,細菌的最大生長量低于對照組;64和32 μg/mL百里香酚處理時,生長曲線與對照組無顯著差異(P>0.05),不會影響浮游狀態(tài)下陰溝腸桿菌C4的生長。

圖1 陰溝腸桿菌C4生長曲線Fig.1 The growth curve of E. cloacae C4

2.2 百里香酚對陰溝腸桿菌C4泳動能力的抑制

圖2表示百里香酚對菌株泳動能力(swarming和swimming)的影響。菌體的泳動能力分為兩種,swarming代表群體菌體運動行為,swimming代表單一菌體運動行為。在本實驗中百里香酚對菌體swarming能力有劑量反應趨勢,百里香酚處理組濃度越高對swarming能力影響越大;如圖2B所示,對菌體swimming能力的影響,1/4 MIC和1/8 MIC百里香酚處理組之間沒有顯著性差異(P>0.05)。使用1/2 MIC處理時,菌體swimming能力被完全抑制。菌體的泳動能力受細菌鞭毛介導,而鞭毛運動在菌體的初始粘附和生物膜形成過程中扮演重要角色[24-26],實驗結果表明百里香酚顯著降低菌體的泳動能力,可能會影響細菌生物膜的形成。

2.3 對陰溝腸桿菌C4生物膜形成的影響

2.3.1 生物膜內菌數的變化 圖3反映百里香酚在72 h內對陰溝腸桿菌C4生物膜內活菌總數的影響。32和64 μg/mL百里香酚處理組和對照組之間活菌總數沒有顯著性差異(P>0.05),128 μg/mL百里香酚在12、24 h取樣點生物膜內活菌總數顯著(P<0.05)低于其他濃度處理組和對照組。培養(yǎng)至48 h之后與對照組無顯著性差異(P>0.05),結合圖1百里香酚對細菌生長曲線的影響分析,可能128 μg/mL百里香酚在生物膜形成初期影響細菌的增殖,而隨著細菌生物膜的成熟,生物膜結構對膜內細菌有保護作用,百里香酚在此濃度下失去了對生物膜內細菌增長的抑制作用。

圖3 百里香酚對陰溝腸桿菌C4生物膜內菌數的影響Fig.3 Effect of thymol on the bacterial countsin E. cloacae C4 biofilm注:大寫字母不同代表相同處理濃度在不同時間點差異顯著;小寫字母不同代表在相同時間點不同處理濃度顯著差異(P<0.05);圖4同。

2.3.2 生物膜內胞外多糖含量的變化 胞外多糖是細菌生物膜維持其三維結構的主要成分,既是生物膜結構的基礎,又是功能的主要承擔者[27-28]。因此,抑制或減少細菌胞外多糖的合成和分泌,是抑制生物膜形成的重要手段。通過苯酚-硫酸法測定葡萄糖糖濃度-吸光度標準曲線作為后期胞外多糖定量標準。線性關系y=0.0086x+0.0753(R2=0.99),如圖4所示,對照組胞外多糖含量隨著培養(yǎng)時間的延長而增加,說明在生物膜的形成過程中,不斷分泌胞外多糖增加生物膜的穩(wěn)定性,提高對外界環(huán)境的適應力。64和128 μg/mL香芹酚處理組胞外多糖含量在不同的培養(yǎng)時間內均顯著低于對照組(P<0.05)。在相同培養(yǎng)時間內,百里香酚處理組濃度越高,抑制生物膜胞外多糖分泌效果越好。

圖4 百里香酚對陰溝腸桿菌C4生物膜胞外多糖合成的影響Fig.4 Effect of thymol on exopolysaccharide ofE. cloacae C4 biofilm

2.4 對陰溝腸桿菌C4生物膜微觀狀態(tài)的影響

圖6 百里香酚對陰溝腸桿菌C4生物膜的抑制作用Fig.6 Effect of thymol on biofilm of E. cloacae C4 注:A:對照組 B:64 μg/mL百里香酚處理組。

2.4.1 SEM觀察生物膜內菌體聚集后的微觀狀態(tài) 圖5表示SEM觀察陰溝腸桿菌C4生物菌膜內菌體的聚集狀態(tài),培養(yǎng)至12 h時,處理組和對照組均呈單層粘附,處理組菌體之間無連接,處理組單層排列,觀察到視野內單個菌體桿狀變長;培養(yǎng)至24 h時,處理組菌體之間互相黏連,依然呈單層排列,對照組菌體之間出現聚集體,形成多層結構;培養(yǎng)至48 h之后,對照組和處理組生物膜成熟,菌體多層包裹在一起,觀察到胞外基質的形成,隨著培養(yǎng)時間的延長,生物膜結構越復雜。

圖5 百里香酚對陰溝腸桿菌C4生物膜菌體聚集狀態(tài)的影響(5000×)Fig.5 Effect of thymol on cell aggregationin E. cloacae C4 biofilm(5000×)注:A:對照組 B:64 μg/mL百里香酚處理組。

2.4.2 CLSM觀察生物膜成膜厚度的變化 如圖6所示,使用CLSM觀察百里香酚對不同培養(yǎng)時間陰溝腸桿菌C4生物膜成膜厚度的影響,發(fā)現對照組和處理組生物膜隨著培養(yǎng)時間的增加,生物膜厚度不斷加厚,膜結構越來越緊密平整,64 μg/mL百里香酚處理的生物膜與同時間段的對照組相比,成膜厚度降低,生物膜有不平整、膜結構松散。

2.5 對陰溝腸桿菌C4生物膜相關基因表達量的影響

圖7表示64 μg/mL百里香酚處理后陰溝腸桿菌C4與生物膜相關基因的表達量變化,培養(yǎng)24 h之后,與生物膜形成相關的6個目的基因的相對表達量高表達下調((Log22-ΔΔCt)<-1);csgB、csgE、csgF是生物膜粘附相關基因,wcaA、wcaM、wza是與胞外多糖合成相關基因,這些目的基因均下調與前邊的生物膜表征變化相一致,進一步說明百里香酚抑制生物膜形成主要通過影響生物膜的初始粘附過程和減少胞外多糖的合成。

圖7 陰溝腸桿菌C4生物膜內菌體細胞內相關基因表達量變化Fig.7 Changes of relative expression levels ofbiofilm-related genes in E.cloacae C4

3 結論

本實驗選取的百里香酚(64 μg/mL)在不影響浮游細菌生長的情況下有效抑制陰溝腸桿菌C4生物膜的形成,避免增加細菌的耐藥性;對照組和64 μg/mL處理組的生物膜內活菌總數無顯著差異(P>0.05),說明百里香酚的抑制作用跟生物膜內粘附菌數沒有關系;SEM和CLSM觀察發(fā)現經百里香酚處理后,與對照組相比,細菌菌體形狀變長,生物膜聚集體形成緩慢,菌體之間連接不緊密,生物膜厚度降低。百里香酚可以顯著(P<0.05)抑制菌體泳動能力和胞外多糖的合成,并且與此相關功能基因的相對表達量下調表明,百里香酚通過調控生物膜相關功能基因的表達來抑制陰溝腸桿菌生物膜的形成,而關于百里香酚如何具體影響鞭毛介導運動的調控通路和胞外多糖合成的調控機制仍需進一步的研究。