蛋清多肽體內(nèi)外抗氧化活性的研究

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

生物活性肽作為一種功能性食品,不僅具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值,而且具有抗氧化、抗癌、抑菌、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性,在人們的日常生活中發(fā)揮著不可或缺的作用[1]。據(jù)研究表明,水解得到的不同種生物活性肽在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮著重要生理作用[2]。

為了避免或延緩食品變質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值的流失,丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、特丁基對苯二酚(TBHQ)、沒食子酸丙酯等合成抗氧化劑由于具有較強(qiáng)的抗氧化能力,被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[3]。然而,由于合成抗氧化劑的毒性,其使用量是受限制的[4]。近年來膳食來源的天然抗氧化劑由于容易吸收和低毒性引起了人們的廣泛關(guān)注,如大豆[5]、羊奶蛋白質(zhì)[6]、鷹嘴豆蛋白水解物[7]、油菜籽[8]等。

蛋清蛋白中生物活性肽含量豐富,可作為一種優(yōu)質(zhì)的食物蛋白質(zhì)來源。蛋清水解物和多肽不僅可以為人類提供基本的營養(yǎng)需求,而且具有多種生物活性,如抗菌[9-10]、抗癌降壓[11-12]以及抗氧化活性[13-15]。除此之外,蛋清蛋白中所含氨基酸的種類和比重更有利于人體生長發(fā)育的需要,是一種理想的食用蛋白,且易于人體腸道消化吸收[16]。采用酶水解蛋清蛋白質(zhì)制備生物活性肽能有效地利用我國豐富的禽蛋資源,提高禽蛋的附加值,產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。我國對雞蛋蛋白的精細(xì)加工研究正逐步深入,但有關(guān)蛋清肽類物質(zhì)發(fā)揮特定功能機(jī)理的研究仍處于初步探索階段,因此本試驗(yàn)以雞蛋清為原料,通過酶解法制備抗氧化肽,對蛋清多肽進(jìn)行體外和體內(nèi)抗氧化活性研究,為蛋清多肽的深度開發(fā)利用提供一定的理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 市售;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Sigma公司;堿性蛋白酶(酶活力160000 U/g)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;SPF昆明雌性小鼠(60只,每只20 g左右,常規(guī)飼養(yǎng)1周后使用) 北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動物有限公司,實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證編號:SCXK(京)2016-0002;其他試劑分析純。

UV-2550PC紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津儀器公司;MK3酶標(biāo)儀 美國BIO-TEK公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;LM-125中空纖維超濾裝置 北京旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司;ST16R冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司;BK-FD12S冷凍干燥機(jī) 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋清多肽(EWP)的制備配制 底物濃度10%的蛋清溶液,用堿性蛋白酶在pH10.0,50 ℃,加酶量1.5%(w/w)的條件下水解3 h,沸水中加熱10 min以終止反應(yīng),8000 r/min離心20 min,上清液經(jīng)過截留分子質(zhì)量為10 kDa的平板膜進(jìn)行超濾分離,收集分子量小于10 kDa的多肽酶解液,冷凍干燥以備后續(xù)使用。

1.3 蛋清多肽體外抗氧化活性的測定

1.3.1 DPPH自由基清除能力的測定 參照文獻(xiàn)的方法,并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷腫17]。將DPPH溶解在95%乙醇中,制備成0.2 mmol/L的DPPH溶液。將2 mL EWP溶液(溶于去離子水中,濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL)和2 mL DPPH溶液混合,在暗處室溫孵育30 min,在517 nm處測定樣品組吸光度。將2 mL乙醇代替樣品與2 mL DPPH溶液混合作為對照組。將2 mL樣品與2 mL乙醇混合作為空白組。使用相同濃度的VC作為陽性對照。

其中:A1為樣品組吸光度,A2為空白組吸光度,A3為對照組吸光度。

1.3.2 羥自由基清除能力的測定 參照文獻(xiàn)的方法,并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷腫18]。反應(yīng)體系(4 mL)由1 mL H2O2(8.8 mmol/L)、1 mL FeSO4(9 mmol/L)、1 mL水楊酸(9 mmol/L)和1 mL樣品溶液(濃度分別為1、2、3、4、5 mg/mL)組成,H2O2最后加入以啟動反應(yīng)。然后37 ℃孵育30 min,在510 nm測定吸光度Am。用蒸餾水代替水楊酸,測定吸光度An。用蒸餾水代替樣品作為空白對照組,測定吸光度Ap。使用相同濃度的VC作為陽性對照。

其中:Am為樣品組吸光度,An為不含水楊酸的吸光度,Ap為空白組的吸光度。

1.3.3 總還原能力的測定 將2.5 mL樣品(濃度分別為2、4、6、8、10、12 mg/mL)加入到2.5 mL 1% K3Fe(CN)6溶液里,再加入2.5 mL pH6.6磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L),在50 ℃下保溫20 min,再加入2.5 mL 10% TCA,混勻后在4000 r/min條件下離心10 min,取上清液5 mL,依次加入5 mL H2O和1 mL 0.1% FeCl3,在700 nm處測定吸光度值A(chǔ)700。使用相同濃度的VC作為對照組。

1.4 蛋清多肽抗氧化動物試驗(yàn)

1.4.1 動物試驗(yàn)設(shè)計(jì) 60只健康小鼠,飼養(yǎng)條件分別為溫度20～22 ℃,濕度保持在40%～60%,明暗交替喂養(yǎng)12 h,自由進(jìn)食進(jìn)水一周。將60只小鼠隨機(jī)分為6組,分別為正常組、模型組、低、中、高劑量組和陽性對照組(VC組)。除正常組每天皮下注射生理鹽水之外,其余各組小鼠每天頸部皮下注射D-半乳糖(200 mg/kg),正常組和模型組每天灌胃0.2 mL 0.9%生理鹽水,低、中、高劑量組分別按照150、300、900 mg/kg的蛋清多肽進(jìn)行給藥,陽性對照組每天灌胃300 mg/kg的VC。連續(xù)注射、灌胃6周,每周稱量一次體重以調(diào)整注射量和灌胃量。

1.4.2 樣品采集 試驗(yàn)期結(jié)束后,禁食不禁水12 h后眼球取血,肝素抗凝,4 ℃ 3500 r/min離心10 min以制備血清。斷頸處死后解剖小鼠,摘取肝臟、心臟,用生理鹽水清洗干凈后,用濾紙吸干多余水分,稱取適量肝臟組織及心臟組織于研磨器中,加入生理鹽水或提取液,迅速研磨以制備10%的組織勻漿,在4 ℃ 3000 r/min離心10 min以獲取上清液。

1.4.3 生化指標(biāo)的測定 小鼠的血清、肝臟及心臟中的超氧化物歧化酶(SOD)的活力、丙二醛(MDA)的含量和還原型谷胱甘肽(GSH)的含量,參考試劑盒說明書。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)結(jié)果均用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋清多肽對DPPH自由基的清除能力

DPPH法用于評價(jià)天然抗氧化劑的自由基清除具有方便快捷等優(yōu)點(diǎn)[19]。從圖1可以看出,蛋清多肽對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加而增加,具有良好的量效關(guān)系,當(dāng)濃度為4 mg/mL時(shí)DPPH自由基的清除率與VC差距進(jìn)一步縮小,可達(dá)到65.7%。說明蛋清多肽具有良好的DPPH自由基的清除能力。

圖1 蛋清多肽對DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging activity of EWP on DPPH radical

2.2 蛋清多肽對羥自由基清除能力

羥自由基作為活性最強(qiáng)的氧自由基能引起相鄰的生物分子間的嚴(yán)重?fù)p傷,從而引起衰老、癌癥和多種疾病[20]。從這個(gè)角度來看,清除羥自由基是最有效的預(yù)防各種疾病的手段之一。從圖2可以看出,蛋清多肽對羥自由基清除能力與濃度呈正相關(guān),當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)清除效果最顯著,達(dá)到68.5%的清除率。說明蛋清多肽對羥自由基清除能力較好。

圖2 蛋清多肽對羥自由基的清除能力Fig.2 Scavenging activity of EWP on hydroxyl radical

2.3 蛋清多肽的總還原能力

從圖3可以看出,蛋清多肽的總還原能力隨著濃度的增加而提高,且具有明顯的量效關(guān)系,在濃度為12 mg/mL的時(shí)候總還原能力OD值為2.032,低于VC(OD值2.88)。說明蛋清多肽具有一定的總還原能力。

圖3 蛋清多肽的總還原能力Fig.3 Deoxidization capacity of EWP

2.4 蛋清多肽對小鼠血清中SOD活力、MDA含量和GSH含量的影響

SOD作為機(jī)體天然存在的自由基清除因子,可阻止因氧自由基產(chǎn)生的細(xì)胞損傷,并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞,它的水平高低與各種疾病發(fā)生有著緊要聯(lián)系[21]。MDA是脂質(zhì)過氧化重要產(chǎn)物之一,其產(chǎn)生會加劇膜損傷,它的含量可以用于評價(jià)脂質(zhì)過氧化程度[22]。GSH可清除掉人體內(nèi)的自由基,保護(hù)許多蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基[23]。

由表1可知,模型組SOD活力、GSH含量相比正常組極顯著下降(P<0.01),MDA含量極顯著上升(P<0.01),說明建模成功。與模型組相比,SOD活力低、中劑量組顯著上升(P<0.05),GSH 含量低劑量組顯著上升(P<0.05),中劑量組極顯著(P<0.01),MDA含量中劑量組顯著降低(P<0.05),高劑量組達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。綜上,蛋清多肽能提高衰老小鼠血清中SOD活力、GSH含量,降低MDA含量,且隨著濃度的增大,活性也增大,其中高劑量組效果最好,GSH含量優(yōu)于VC對照組,SOD活力、MDA含量接近VC對照組。說明蛋清多肽在血清中抗氧化效果較好。

表1 蛋清多肽對小鼠血清中SOD活力、MDA含量和GSH含量的影響Table 1 Effect of EWP on SOD activity,MDA and GSH content in serum of mice

注:*與正常組相比,有顯著性差異(P<0.05);**與正常組相比,有極顯著性差異(P<0.01);#與模型組相比,有顯著性差異(P<0.05);##與模型組相比,有極顯著性差異(P<0.01);表2、表3同。

2.5 蛋清多肽對小鼠肝臟中SOD活力、MDA含量和GSH含量的影響

由表2可知,模型組SOD活力、GSH含量相比正常組極顯著下降(P<0.01),MDA含量極顯著上升(P<0.01),即建模成功。低劑量組與模型組相比差異不顯著(P>0.05),中劑量組MDA含量及GSH含量達(dá)到顯著差異水平(P<0.05)、SOD活力達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01),高劑量組極顯著(P<0.01)。這說明蛋清多肽能提高衰老小鼠肝臟組織中SOD活力、GSH含量,降低MDA含量,且隨著濃度的增大,活性也增大,其中高劑量組效果最好,肝臟中SOD活力與GSH含量接近VC對照組。說明蛋清多肽在肝臟中抗氧化效果較好。

表2 蛋清多肽對小鼠肝臟中SOD活力、MDA含量和GSH含量的影響Table 2 Effect of EWP on SOD activity,MDA and GSH content in liver of mice

2.6 蛋清多肽對小鼠心臟中SOD活力、MDA含量和GSH含量的影響

由表3可知,模型組SOD活力、GSH含量相比正常組極顯著下降(P<0.01),MDA含量極顯著上升(P<0.01),說明建模成功。與模型組相比,GSH含量低、中劑量組顯著上升(P<0.05),SOD活力中劑量組顯著上升(P<0.05),MDA含量中劑量組顯著下降(P<0.05),高劑量組與VC對照組各指標(biāo)達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。綜上,蛋清多肽能提高衰老小鼠心臟組織中SOD活力、GSH含量,降低MDA含量,且且隨著濃度的增大,活性也增大,其中高劑量組效果最好,各指標(biāo)水平接近VC對照組。說明蛋清多肽在心臟中抗氧化效果較好。

表3 蛋清多肽對小鼠心臟中SOD活力、MDA含量和GSH含量的影響Table 3 Effect of EWP on SOD activity,MDA and GSH content in heart of mice

張玲等用歐李仁多肽灌胃小鼠,發(fā)現(xiàn)不同劑量組可顯著提高小鼠血清和肝臟中SOD、GSH-Px活性(P<0.05),顯著降低血清和肝臟中MDA的含量(P<0.05)[24]。萬全等用黃緣盒龜多肽灌胃小鼠,發(fā)現(xiàn)其可提高小鼠血清、肝和腦組織中的SOD活力和 GSH含量,抑制MDA含量的增加,且抗氧化效果與濃度有良好的量效關(guān)系[25]。與本試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)一。

3 結(jié)論

蛋清多肽對DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率和總還原能力效果都較好,其中濃度為5 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率和羥自由基清除率分別達(dá)到69.2%和68.5%,且清除率都隨著濃度的增大而增加,量效關(guān)系較為明顯。動物試驗(yàn)表明,與模型組相比,蛋清多肽可顯著提高衰老小鼠血清、肝臟和心臟組織中SOD活力、GSH含量(P<0.05),顯著降低血清、肝臟和心臟組織中MDA含量(P<0.05),且且隨著濃度的增大,活性也增大,其中高劑量組效果最好。這說明蛋清多肽可以在一定程度上抑制機(jī)體損害,提高衰老小鼠的抗氧化能力。本研究為蛋清多肽的精深研究與加工提供了理論支持,蛋清多肽作為一種天然的抗氧化劑,開發(fā)利用價(jià)值較高。