脈沖電場促進(jìn)黑曲霉生長提高產(chǎn)酶活性

劉振宇，宋艷波，高瑞梅，李林葳，楊 政,賈麗艷

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，晉中030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，晉中030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，晉中030801；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，晉中030801）

0 引 言

黑曲霉（Aspergillus niger）是國際公認(rèn)的生物技術(shù)中最重要的微生物之一。從1919 年黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸被工業(yè)化開發(fā)，首次獲得實(shí)際應(yīng)用開始，至今黑曲霉一直是工業(yè)應(yīng)用中重要的研究對象[1]。目前，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物在發(fā)酵飼料、食品添加配料、工業(yè)酶制劑以及醫(yī)藥方面都有重大作用[2-4]。黑曲霉是多種酶的來源，成為眾所周知的外源蛋白和酶的細(xì)胞生產(chǎn)工廠，其生產(chǎn)的糖化酶已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；I(yè)應(yīng)用[5]。而且，檸檬酸和許多黑曲霉的酶被美國食品和藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)為是GRAS（Generally regarded as safe）產(chǎn)品，此外，黑曲霉還可用于生物轉(zhuǎn)化和廢物處理[1]。因此研究黑曲霉菌種特性、培養(yǎng)環(huán)境、發(fā)酵體系，采用物理、化學(xué)和生物技術(shù)等手段改造黑曲霉菌種，提高菌株對目標(biāo)代謝物的生產(chǎn)能力成為目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究黑曲霉菌絲生長形態(tài)和特異性蛋白酶活性與高水平葡萄糖淀粉酶活性關(guān)系[6]，優(yōu)化生產(chǎn)工藝提高黑曲霉中殼聚糖產(chǎn)量和功能活性[7]，采用60Co射線和紫外輻照結(jié)合處理黑曲霉孢子獲得環(huán)氧化物水解酶（epoxide hydrolase，EH）高產(chǎn)菌株[8]。這些技術(shù)本身具有一定限制，如產(chǎn)生不需要的化學(xué)殘留物和需要很長時間培養(yǎng)等。而脈沖電場作為非熱處理技術(shù)，以其綠色環(huán)保，節(jié)約能源和可提高某些微生物細(xì)胞活性和發(fā)酵能力，有望發(fā)展為解決這些問題的可替代技術(shù)。

脈沖電場（pulsed electric field，PEF）處理是一種新型的細(xì)胞電穿孔技術(shù)[9]。在外加PEF 作用下，細(xì)胞膜上形成小孔的過程即為電穿孔。在一定條件下形成的電穿孔是不可逆的，使細(xì)胞死亡，可以有效殺滅食品中的多種食源性，腐敗性和致病性微生物，廣泛用于果汁等流動和果醬等半流動及鮮果和肉類保鮮貯藏及品質(zhì)改善[9-12]；在醫(yī)學(xué)中作為聯(lián)合治療技術(shù)和直接治療方法進(jìn)行腫瘤細(xì)胞殺滅[13-14]。在某些條件下，形成了可逆的膜電穿孔，細(xì)胞是活的，但細(xì)胞透性增大，這利于組織中活性化合物和基因提取[15]；利于果蔬干燥時水分散失，提高干燥速率[16]。近年來PEF 對活細(xì)胞的刺激越來越受到廣泛關(guān)注，用于促進(jìn)植物種子萌發(fā)[17-19]和改良菌種等，如用PEF 處理酵母，既可改變釀酒酵母的培養(yǎng)周期，促進(jìn)細(xì)胞分裂同步化[20]，也可增加酵母細(xì)胞生長和酒精生產(chǎn)率[21]，改善酵母發(fā)酵特性，提高酵母菌的代謝，成為刺激微生物反應(yīng)（即發(fā)酵）的積極工具[22]。目前，關(guān)于PEF對黑曲霉作用報道較少，本研究以黑曲霉糖化酶高產(chǎn)菌株為作用對象，探討脈沖工作參數(shù)對黑曲霉生長和產(chǎn)糖化酶性能影響，力求獲得兩者間的互作規(guī)律，為黑曲霉生產(chǎn)效能的提高提供一種新的技術(shù)和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株：黑曲霉AS3.4309，購買于中國科學(xué)院微生物研究所。

試驗(yàn)試劑：馬鈴薯葡萄糖（PDA,potato dextrose agar）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g切成小塊，加適量水煮沸30 min過濾，濾液中加20 g 蔗糖，用蒸餾水補(bǔ)至1 000 mL；培養(yǎng)基加入20 g 瓊脂即為固體培養(yǎng)基。察氏培養(yǎng)基：蒸餾水1 000 mL，硝酸鈉3 g，蔗糖30 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂20 g，加熱溶解。蛋白胨：1 g蛋白胨，蒸餾水溶解，定容至1 000 mL，滅菌備用。

試驗(yàn)儀器：SW-CJ-2G 型超凈臺，蘇州江東精密儀器有限公司；ECM830 型脈沖發(fā)生器，美國BTX 公司；JS-2000W-A 型交流電源電壓轉(zhuǎn)換器，上海景賽電子科技有限公司；SPX-300-F 生化培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；血球計數(shù)板（QIUJING，25 格×16 格），上海求精生化試劑儀器有限公司；E100 型顯微鏡，上海維翰光電科技有限公司；Megafuge 8R 臺式高速冷凍離心機(jī)，Thermo Fisher 美國公司；DH5000-AB 干燥箱，德州市昊誠實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；THZ-98A 恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV752N 紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；HH-42 水浴鍋，福州精科儀器儀表有限公司；DYCZ-24A 電泳儀，北京市六一儀器廠；Chemixrsf化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀，美國Bio-Rad伯樂公司等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑曲霉的活化和孢子懸液制備

黑曲霉接種于斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，4 ℃保存。向上述培養(yǎng)物加適量無菌蛋白胨，用接種針刮下培養(yǎng)物，無菌紗布濾去菌絲體，使孢子分布均勻，用血球計數(shù)板計量3 次孢子數(shù)，求其平均值，得到孢子濃度為4.2×106個/mL的菌懸液。

1.2.2 菌懸液的PEF處理及培養(yǎng)

吸取150 μL 孢子懸液于電擊杯（聚碳酸酯材質(zhì)，兩電極間距2 mm）中進(jìn)行脈沖處理：取100 μL 放入裝有25 mL PDA 液體培養(yǎng)基離心管中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)60 h，測定菌絲干質(zhì)量；另取10 μL 接于裝有30 mL PDA 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中培養(yǎng)108 h，測定糖化酶活性；取2 μL 進(jìn)行微室培養(yǎng)（察氏培養(yǎng)基）10～12 h，顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)；取1 μL 接于PDA 固定平板中央，觀察菌絲生長，以未進(jìn)行PEF 處理的黑曲霉為對照。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 指標(biāo)測定方法

1）菌絲干質(zhì)量測定[23]：用定量濾紙過濾培養(yǎng)物，70 ℃烘干至恒質(zhì)量。

2）糖化酶活性的測定：培養(yǎng)后的菌液，4 ℃5 700 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液[24]，酶活性測定采用3,5-二硝基水楊酸法[25]。

酶活性單位為pH值5、40 ℃和15 min反應(yīng)時間分解淀粉產(chǎn)生1 μmol 葡萄糖（0.18 mg）所需酶量[24]。

3）黑曲霉孢子萌發(fā)測定[26-27]：菌絲長度比孢子直徑一半長時，認(rèn)為孢子已萌發(fā)。

孢子萌發(fā)率=已萌發(fā)孢子數(shù)目（/已萌發(fā)孢子數(shù)+未萌發(fā)孢子數(shù)）×100%。

4）同工酶測定

孢子懸液接于裝有25 mL PDA 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中培養(yǎng)72 h，過濾并收集菌團(tuán)，蒸餾水沖洗，吸干。稱菌絲團(tuán)放入預(yù)冷的研缽，加適量石英砂和0.1 mol/L pH值8.0 Tris-HCl提取液（1 g菌絲/2 mL提取液）冰浴研磨，低溫浸提0.5 h或過夜。12 000 r/min 4 ℃離心15 min，上清液用于酯酶（EST）同工酶分析[28]。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，pH值8.9；濃縮膠5%，pH 值6.8，電泳緩沖液為Tris-Gly pH 值8.3 系統(tǒng)；初始電壓160 V，分離膠電壓為240 V。染液配制參考文獻(xiàn)[29]稍作修改：50 mg固藍(lán)B鹽(氯化四氮鄰二甲氧基苯胺)，溶于150 mL 0.1 mol/L pH 值6.2磷酸緩沖液，過濾；50 mg α-乙酸萘酯和50 mg β-乙酸萘酯溶于1 mL 丙酮，倒入固藍(lán)溶液中，邊倒邊攪拌。電泳結(jié)束后將膠轉(zhuǎn)移至染色液中，37 ℃黑暗染色至褐色條帶清晰，水漂洗，7%的醋酸固定，用凝膠成像儀拍照。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計

依據(jù)脈沖儀器性能、菌液承受能力和前期試驗(yàn)研究結(jié)果選擇脈沖參數(shù)和參數(shù)范圍。采用三因素五水平中心組合設(shè)計（central composite experimental design，CCD）確立脈沖強(qiáng)度（5～15 kV/cm）、脈沖持續(xù)時間（10～100 μs）和脈沖數(shù)（50～99）3 個脈沖參數(shù)組合，以黑曲霉菌絲干質(zhì)量和產(chǎn)糖化酶活性為主要響應(yīng)指標(biāo)，研究這些指標(biāo)在不同脈沖參數(shù)下的變化規(guī)律，優(yōu)化脈沖工藝。各變量的編碼值和實(shí)際值如表1。

1.2.5 統(tǒng)計分析

所有結(jié)果用平均值表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和建模均由Design Expert 10.0.7 統(tǒng)計分析軟件（Stat-Ease 公司，明尼阿波里斯市，美國）完成。試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸和顯著性分析（P＜0.05）。從回歸模型中生成響應(yīng)面圖，直觀反映響應(yīng)值與自變量之間的關(guān)系，確定最優(yōu)條件。

2 結(jié)果與分析

PEF 處理技術(shù)可以產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，如殺滅食源性和腐源性致病菌，從而被廣泛用于液態(tài)食品加工中；增加植物和肉類等固態(tài)食品傳質(zhì)，改善加工中的傳質(zhì)品質(zhì)；促進(jìn)植物種子的代謝活動，提升種子活力；提高物料干燥速率；增加細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)提取率；生物大分子改性和刺激酵母細(xì)胞生長等。而要達(dá)到以上某種特定效應(yīng)的前提是執(zhí)行相應(yīng)的PEF 加工參數(shù)[30]。研究獲得了PEF 工作參數(shù)對黑曲霉生長和產(chǎn)糖化酶活性關(guān)系。

表1 試驗(yàn)設(shè)計與實(shí)測結(jié)果Table1 Experimental design and measured results

2.1 PEF 參數(shù)對黑曲霉菌絲干質(zhì)量和產(chǎn)糖化酶活性影響規(guī)律

2.1.1 PEF作用對黑曲霉菌絲干質(zhì)量和產(chǎn)糖化酶活性影響

PEF 處理對黑曲霉菌絲干質(zhì)量和產(chǎn)糖化酶性能有明顯影響，不同參數(shù)效果不同。未經(jīng)PEF 處理的黑曲霉菌絲干質(zhì)量和糖化酶活性分別為（16.67±1.25）mg 和（15.70±0.31）U/mL；PEF 處理后，菌絲干質(zhì)量和糖化酶活性最大達(dá)（34.58±0.94）mg 和（19.70±1.61）U/mL，比對照分別增加了107%和25.47%（見表1）。在個別參數(shù)下菌絲干質(zhì)量和糖化酶活性比未處理低，從表1 不難看出，在低電場強(qiáng)度處理下菌絲干質(zhì)量未增反而下降；而脈沖數(shù)較高的處理下，產(chǎn)酶活性下降。Zhao 等采用20 kV/cm、100 和200 ms 的短時間PEF 處理釀酒酵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)α-葡萄糖苷酶、N -乙酰-β-糖苷酶和α-甘露糖苷酶活性增加；當(dāng)PEF 處理時間超過200 ms 時，觀察到了蛋白團(tuán)聚體的形成，同時發(fā)現(xiàn)這些酶活性降低甚至完全喪失[31]。在本研究中，脈沖處理個數(shù)高，脈沖作用時間積累效應(yīng)導(dǎo)致黑曲霉產(chǎn)糖化酶活性的下降，與上述研究結(jié)果一致。

因此，尋求脈沖參數(shù)及參數(shù)間相互作用對響應(yīng)指標(biāo)影響規(guī)律，確立脈沖參數(shù)與響應(yīng)指標(biāo)間的量化關(guān)系尤為重要。

2.1.2 PEF作用參數(shù)與兩響應(yīng)指標(biāo)回歸方程建立與分析

用統(tǒng)計分析軟件對表1 結(jié)果進(jìn)行回歸分析和顯著性檢驗(yàn)，建立了脈沖強(qiáng)度、脈沖時間和脈沖數(shù)3 個自變量和黑曲霉菌絲干質(zhì)量、產(chǎn)糖化酶活力2 個響應(yīng)指標(biāo)關(guān)系的二階多項式方程：

式中X1，X2，X3分別為脈沖強(qiáng)度、脈沖持續(xù)時間和脈沖數(shù)的編碼水平；Y1為黑曲霉菌絲干質(zhì)量，mg；Y2為糖化酶活力，U/mL。

采用方差分析評價兩模型的充分性和適合度，以相應(yīng)的P 值評價模型的顯著性（表2）。黑曲霉菌絲干質(zhì)量（Y1）F 值為6.89，糖化酶活性（Y2）F 值為12.02，F(xiàn) 值較大，說明了模型的正確性；P＜0.01，模型均顯著；兩模型失擬項均不顯著，且決定系數(shù)R2分別為0.861 2 和0.915 4，值較高，表明該模型可用。方程能反映和預(yù)測試驗(yàn)選定參數(shù)范圍內(nèi)3 個脈沖參數(shù)與2 個響應(yīng)指標(biāo)間的關(guān)系。

回歸系數(shù)檢驗(yàn)顯示：對黑曲霉菌絲干質(zhì)量影響最大的因素是脈沖強(qiáng)度（P＜0.01），其次是脈沖數(shù)和脈沖持續(xù)時間。根據(jù)回歸模型方差結(jié)果繪制3D 效果圖：從圖1a

可以看出，曲面比較陡，表示脈沖強(qiáng)度與脈沖數(shù)互作時，對黑曲霉菌絲干質(zhì)量影響顯著(P＜0.01)。而脈沖強(qiáng)度與脈沖寬度互作、脈沖寬度與脈沖數(shù)互作對黑曲霉菌絲干質(zhì)量的影響不顯著（表2）。

與菌絲干質(zhì)量略有不同，影響糖化酶最大的因素是脈沖數(shù)（P＜0.01），其次是脈沖強(qiáng)度（P＜0.05）和脈沖寬度。綜合響應(yīng)曲面圖和測定結(jié)果表，只有脈沖強(qiáng)度和脈沖數(shù)的互作效應(yīng)3D響應(yīng)曲面圖的凸起幅度較強(qiáng)，互作效應(yīng)顯著P＜0.05，與對黑曲霉干質(zhì)量作用結(jié)果一致（圖1b）。綜合脈沖參數(shù)對2 個響應(yīng)指標(biāo)影響可知，脈沖強(qiáng)度對兩指標(biāo)影響顯著，這與當(dāng)前研究認(rèn)為PEF 的作用主要取決于電場強(qiáng)度[32]結(jié)果一致。另外，脈沖數(shù)與脈沖強(qiáng)度的互作也顯著影響兩指標(biāo)變化，應(yīng)用時也需重點(diǎn)考慮。

表2 PEF參數(shù)對黑曲霉菌絲干質(zhì)量和產(chǎn)糖化酶活性影響的方差分析Table 2 Variance analysis from influence of PEF parameters on Aspergillus niger mycelium dry weight and activity of glucoamylase

圖1 PEF脈沖數(shù)和脈沖強(qiáng)度兩參數(shù)互作對黑曲霉菌絲干質(zhì)量和產(chǎn)糖化酶活性的影響Fig.1 Influence from the interaction of the pulse intensity and pulse number of PEF on Aspergillus niger mycelium dry eight and activity of glucoamylase

2.2 PEF對黑曲霉菌落形態(tài)特征的影響

PEF 處理對黑曲霉菌落生長形態(tài)產(chǎn)生了明顯影響（圖2）。在表1脈沖參數(shù)處理下，所有菌落雖然都呈圓形生長，但未處理的菌落(圖2 中0)可見清晰的菌落圈；而PEF 處理后，有些菌落圈隆起高，出現(xiàn)星狀褶皺，菌落圈較難分辨，孢子數(shù)量顯著增加，孢子顏色沒變但孢子周圍出現(xiàn)明顯不同的深黃色(圖2 中PEF-7 和PEF-11 分別為表1 中序號7 和11 處理)。說明，PEF 不但刺激了黑曲霉生長，也影響其代謝。

圖2 PEF對黑曲霉菌落形態(tài)特征的影響Fig.2 Influence of PEF on Aspergillus niger colony shape feature

2.3 PEF對黑曲霉孢子萌發(fā)的影響

顯微鏡下觀察和統(tǒng)計黑曲霉孢子萌發(fā)情況（圖3）。未經(jīng)PEF 處理的黑曲霉孢子萌發(fā)率為14.06%±0.59%，采用表1 中PEF 工作參數(shù)處理后，孢子萌發(fā)率為25.00%±0.33%～46.54%±0.55%，比對照增加了77.8%～231%。據(jù)此認(rèn)為PEF促進(jìn)菌絲生長原因之一是刺激了孢子萌發(fā)。

圖3 PEF對黑曲霉孢子萌發(fā)的影響（×400）Fig.3 Influence of PEF on Aspergillus niger spore germination（×400）

2.4 PEF對EST同工酶的影響

PEF處理在某些條件下可能對菌株產(chǎn)生誘變作用[33]，為了檢測PEF處理后的黑曲霉是否發(fā)生質(zhì)變，基于菌落形態(tài)特征觀察，對生長褶皺、顏色和疏密度等表現(xiàn)出差異的處理和對照同時收獲孢子，進(jìn)行酯酶同工酶酶譜分析。

由圖4a 和4b 可知，黑曲霉的EST 同工酶出現(xiàn)了10條譜帶，標(biāo)記為EST-01～EST-10，其遷移率為0.267～0.750。EST-01～EST-05 條帶強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其他條帶，說明這5條條帶對EST 活性貢獻(xiàn)較大。而EST-08～EST-10條帶最弱，對EST活性貢獻(xiàn)最小。同工酶是基因表達(dá)產(chǎn)物，是遺傳與變異的重要指標(biāo)；而酯酶同工酶由于易于檢測，且具有高度多態(tài)性，被作為遺傳研究中常見的標(biāo)記物，廣泛用于微生物、昆蟲和植物物種鑒定及分類與進(jìn)化研究中[34-36]。本文，PEF 處理組與對照組的EST-01～EST-08 的遷移率都相同。說明PEF處理并未對黑曲霉的EST同工酶形成明顯遺傳變異。另外，酯酶活性可作為微生物細(xì)胞代謝性能的指標(biāo)，圖中編號7～9 樣本EST-01 和EST-02條帶顏色比對照深，11～16 號樣本與對照無明顯差異，而其他樣本比對照淺。這一結(jié)果表明PEF 影響了黑曲霉的代謝性能。

圖4 PEF對黑曲霉酯酶同工酶影響Fig.4 Influence of PEF on esterase isozyme of Aspergillus niger

2.5 工藝參數(shù)的優(yōu)化驗(yàn)證

黑曲霉菌絲干質(zhì)量和黑曲霉糖化酶活性在相應(yīng)約束條件下都應(yīng)達(dá)到最大值，即Y1max和Y2max確立為目標(biāo)函數(shù)，經(jīng)Design Expert 10.0.7 統(tǒng)計分析軟件對兩個回歸模型分別優(yōu)化求解。在此基礎(chǔ)上，利用多目標(biāo)決策理論及非線性優(yōu)化方法，綜合目標(biāo)函數(shù)采用線性加權(quán)法進(jìn)行規(guī)劃求解，由于糖化酶活性是主要目標(biāo)，其加權(quán)系數(shù)K2取0.6，則黑曲霉菌絲干質(zhì)量的加權(quán)系數(shù)K1為0.4[16]。獲得綜合優(yōu)化條件為脈沖強(qiáng)度12.974 95 kV/cm、脈寬為53.517 μs、脈沖數(shù)66.052，相應(yīng)的黑曲霉菌絲干質(zhì)量為28.662 mg，糖化酶活性為17.746 U/mL。經(jīng)修正，選擇脈沖強(qiáng)度為12.975 kV/cm、脈寬為54 μs、脈沖數(shù)66，獲得黑曲霉的菌絲干質(zhì)量和糖化酶活性分別為28.05 mg和18.01 U/mL，與預(yù)測值基本一致，表明優(yōu)化結(jié)果合理可靠，比對照提高了68.27%和14.71%，可以作為進(jìn)一步試驗(yàn)研究的指導(dǎo)。

3 討論

3.1 PEF對黑曲霉作用機(jī)理分析

PEF 處理影響黑曲霉分生孢子活力，增加檸檬酸產(chǎn)量[37]。在本研究中，PEF 處理后產(chǎn)糖化酶能力增強(qiáng)，菌絲干質(zhì)量增加，這與PEF刺激孢子萌發(fā)有關(guān)，與對萌發(fā)中和萌發(fā)后代謝刺激也有關(guān)。PEF 處理酵母細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，PEF 處理促進(jìn)細(xì)胞中鋅離子、鎂離子和鈣離子積累[38-39]，促進(jìn)果糖等物質(zhì)吸收，刺激酵母細(xì)胞代謝[22]。以及造成細(xì)胞代謝過程中酶的變化，如PEF 處理新鮮藍(lán)莓提高了花青素濃度，改變了其在藍(lán)莓中的分布，可能通過影響反應(yīng)動力學(xué)中涉及的分子，如酶，改變花青素降解的機(jī)制[11]。作為一種絲狀真菌，黑曲霉孢子萌發(fā)常需要較長的延滯期，因此縮短孢子萌發(fā)時間，可以提高發(fā)酵效率，而PEF處理可以通過改變細(xì)胞膜組分排列，產(chǎn)生電穿孔，增加細(xì)胞膜滲透性或激活轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)[40]，增加對水分、離子和有益營養(yǎng)物質(zhì)的吸收運(yùn)轉(zhuǎn)，活化代謝過程中的酶，促進(jìn)細(xì)胞代謝，從而促進(jìn)生長，提高其產(chǎn)酶性能。

3.2 PEF參數(shù)優(yōu)化

PEF 可以刺激細(xì)胞代謝，也可以殺死細(xì)胞。這主要取決于脈沖工作參數(shù)。研究認(rèn)為PEF的作用主要取決于電場的強(qiáng)度，Sotelo 等研究了中、輕度PEF（電場強(qiáng)度0.3和2.5 kV/cm，脈沖頻率100 Hz，脈沖寬度20 μs）處理櫻桃提高了其可食品質(zhì)且不影響益生菌的生長[41]。電場強(qiáng)度5.0 kV/cm，脈沖寬度20 μs，電場頻率1 Hz下處理酵母細(xì)胞15 min 后培養(yǎng)20 h，鎂和鋅的積累比對照分別增加了1.5 倍和2 倍[38]，過高電場強(qiáng)度會使細(xì)胞損傷嚴(yán)重，甚至死亡。因此，高的電場強(qiáng)度(10～80 kV/cm)常被用于巴氏殺菌，使微生物膜破壞到無法修復(fù)的程度，最終死亡[42]。影響果汁質(zhì)量最重要的電學(xué)參數(shù)不只電場強(qiáng)度，還有處理時間[10]，用于有機(jī)物提取研究中，使細(xì)胞膜發(fā)生可逆穿孔，增加細(xì)胞滲透性的脈沖強(qiáng)度范圍在1～10 kV之間，脈沖數(shù)在5～50 之間[42-43]?？梢姡琍EF 作用中脈沖工藝參數(shù)確立的重要性。本文研究同樣得出脈沖強(qiáng)度對黑曲霉生長和產(chǎn)糖化酶活性能力影響最突出，并且與脈沖個數(shù)互作效應(yīng)明顯。因此，在對不同類型，不同發(fā)育時期等不同特點(diǎn)細(xì)胞進(jìn)行PEF 處理時，對參數(shù)進(jìn)行選擇和優(yōu)化是首要任務(wù)，研究為該技術(shù)在今后工廠化應(yīng)用中提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

1）PEF處理黑曲霉孢子，不同的電場強(qiáng)度、脈沖寬度以及脈沖數(shù)會導(dǎo)致黑曲霉菌絲干質(zhì)量和生產(chǎn)糖化酶的能力有所改變，電場強(qiáng)度和脈沖數(shù)及其相互作用是影響兩指標(biāo)的主要參數(shù)。電場處理后的黑曲霉，其細(xì)胞膜通透性和酶活性會增大，代謝速度變快，可以更好的促進(jìn)孢子萌發(fā)。脈沖強(qiáng)度為12.975 kV/cm、脈寬為54 μs、脈沖數(shù)66，獲得黑曲霉的菌絲干質(zhì)量和糖化酶活性分別為28.05 mg和18.01 U/mL。

2）酯酶同工酶分析未發(fā)現(xiàn)PEF對黑曲霉有誘變的作用，只是通過刺激黑曲霉生長，影響細(xì)胞代謝而影響其生長和產(chǎn)糖化酶能力，可見PEF技術(shù)是不破壞黑曲霉本質(zhì)，且處理過程簡單，生產(chǎn)效率高，是一種有前景的用于提高生物工程菌發(fā)酵效率的有力工具。