養(yǎng)殖花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的特性分析

盧珍華，郭彩華，葉 鵬，陳昭華，翁武銀，江興龍

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門(mén) 361021；2.廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn) 檢疫技術(shù)中心，福建廈門(mén) 361026；3.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門(mén) 361021)

花鰻鱺(Anguillamarmorata)屬鰻鱺目鰻鱺科鰻鱺屬，又稱蘆鰻、雪鰻。目前，花鰻鱺的研究主要集中在花鰻鱺的基礎(chǔ)生物學(xué)特征，養(yǎng)殖技術(shù)，花鰻鱺的營(yíng)養(yǎng)成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值分析，從基因水平對(duì)花鰻鱺的研究等方面[1-5]，而有關(guān)花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究以養(yǎng)殖花鰻鱺為原料，從魚(yú)皮中提取膠原蛋白，分析膠原蛋白的理化性質(zhì)及體外自組裝動(dòng)力學(xué)特性，為花鰻鱺膠原蛋白在功能性食品、化妝品和生物醫(yī)學(xué)材料等領(lǐng)域中的潛在應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

花鰻鱺由集美大學(xué)鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心合作的福建龍巖市某養(yǎng)殖場(chǎng)提供。取樣時(shí)間2017年4—6月，共采集花鰻鱺樣品6尾，平均個(gè)體重量(1 960±50)g，體長(zhǎng)(85.4±2.6)cm。

十二烷基磺酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、DC蛋白試劑盒為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為加拿大Fermentas公司產(chǎn)品；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為安捷倫科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇(HPLC級(jí))為美國(guó)INC公司產(chǎn)品；三氟乙酸(HPLC級(jí))為美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；磷酸鹽和胃蛋白酶(1 200 U/g)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍(lán)R-250為國(guó)產(chǎn)生物試劑；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-25高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Mini-PⅢ垂直電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)；G:Box凝膠成像儀(英國(guó)Syngene公司)；L-8900高效氨基酸分析儀(日本HITACHI公司)；UV-2600A紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；Nicolet iS10傅里葉紅外變化光譜儀(美國(guó)Thermo公司)；FE20K pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)；烏氏粘度計(jì)(上海玻璃儀器一廠)；E-1010離子濺射儀、S-4800電子掃描顯微鏡(日本東京日立制造所)；DHR流變儀(美國(guó)TA公司)。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白提取

參考Tang等[6]的方法在4 ℃下提取花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白?；狑~魚(yú)皮先利用0.1 mol/L NaOH浸泡36 h后，用冰水漂洗至中性，再利用10%(V/V)的正丁醇溶液浸泡24 h，冰水漂洗，再用25%(V/V)乙醇浸泡24 h，冰水漂洗后，以1∶30(W/V)的比例將魚(yú)皮浸泡于含1%(W/V)胃蛋白酶的0.5 mol/L 乙酸溶液中浸提3 d。浸提液通過(guò)離心(15 000g,20 min)，獲得的上清液利用透析袋(10 kDa)和0.02 mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析48 h，再用0.5 mol/L乙酸溶解，加入終濃度為2.3 mol/L NaCl使膠原鹽析沉淀，通過(guò)離心(15 000g,20 min)收集沉淀，再用0.5 mol/L乙酸溶解沉淀，分別利用0.1 mol/L乙酸和蒸餾水進(jìn)行透析，通過(guò)冷凍干燥獲得白色、蓬松、海綿狀的花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白，-30 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 膠原蛋白理化性質(zhì)研究

1.3.2.1 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參考Laemmli[7]報(bào)道的方法進(jìn)行SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis)電泳。凍干的花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白利用蛋白質(zhì)變性劑[20 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L 尿素、2%(W/V)SDS，pH 8.8]溶解，15 000g離心20 min收集上清液，用Lowry等[8]的方法測(cè)定蛋白含量。

所用的濃縮膠和分離膠的濃度分別為4%(W/V)和6%(W/V)，上膠樣品的蛋白濃度為1 mg/mL，采用恒流電泳，電流8 mA。電泳后的凝膠，先用0.025%(W/V)考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色，再用脫色液(由甲醇∶乙酸∶重蒸水=1∶3∶7混合而成)脫色至背景清晰，利用G:Box凝膠成像儀拍照。電泳所用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量10 000～200 000。

1.3.2.2 氨基酸組成

花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的氨基酸組成利用L-8900高效氨基酸分析儀測(cè)定。稱取適量?jī)龈婶~(yú)皮膠原蛋白于消化管中，加入含0.1%(W/V)苯酚的6 mol/L HCl溶液，抽真空充氮?dú)饷芊?，?10 ℃條件下水解22 h。酸水解后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除鹽酸，殘留物溶解在0.02 mol/L HCl中，過(guò)0.22 μm水系濾膜，用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定酸水解液中氨基酸的組分。氨基酸含量以外標(biāo)法確定。參照文獻(xiàn)[6]，氨基酸組成采用每1 000個(gè)氨基酸殘基中某種氨基酸殘基數(shù)表示，形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2.3 紫外吸收光譜

取適量?jī)龈苫狑~魚(yú)皮膠原蛋白溶于0.1 mol/L乙酸溶液中，調(diào)配成濃度為1 mg/mL的魚(yú)皮膠原蛋白溶液。以0.1 mol/L乙酸溶液作為空白對(duì)照液，利用UV-2600A紫外分光光度計(jì)在200～400 nm紫外區(qū)段對(duì)1 mg/mL的魚(yú)皮膠原蛋白溶液進(jìn)行掃描。

1.3.2.4 傅里葉變換紅外光譜

花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的傅里葉變換紅外光譜分析，利用Nicolet iS10傅里葉紅外變化光譜儀在室溫下實(shí)施。分別稱取1 mg凍干的花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白和100 mg溴化鉀(KBr)，混合后充分研磨，研磨好的粉末置于壓片機(jī)中壓成透明薄片。以溴化鉀薄片為空白對(duì)照。掃描波數(shù)取4000～400 cm-1，光譜分辨率設(shè)定為4 cm-1，掃描32次。

1.3.2.5 粘度和熱變性分析

借鑒Nagai等[9]的方法并做一定的修改后測(cè)定花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的粘度。凍干的魚(yú)皮膠原蛋白用0.1 mol/L乙酸溶液溶解成1%(W/V)的膠原蛋白溶液，在10～45 ℃下測(cè)定花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白通過(guò)毛細(xì)管所需的時(shí)間，每個(gè)溫度點(diǎn)的重復(fù)測(cè)定次數(shù)是5次。特性粘度ηsp按公式(1)計(jì)算，比濃粘度ηre按公式(2)的計(jì)算。

(1)

(2)

式中：t為花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白溶液通過(guò)毛細(xì)管所需的時(shí)間，t0為0.1 mol/L乙酸溶液通過(guò)毛細(xì)管所需的時(shí)間；c為1%(W/V)。比濃粘度ηre用L表示，即單位濃度下單個(gè)分子對(duì)溶液粘度的貢獻(xiàn)。

以溫度為橫坐標(biāo)，比濃粘度ηre為縱坐標(biāo)，做花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的熱變性曲線。當(dāng)比濃粘度ηre為最大比濃粘度一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度就是花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的熱變性溫度，用Td(thermal denaturation)表示。

1.3.3 膠原蛋白自組裝特性

根據(jù)Zhang等[10]報(bào)道的方法，將凍干的魚(yú)皮膠原蛋白溶于0.1 mol/L乙酸溶液中，配制成濃度為1 mg/mL的膠原蛋白溶液，然后放在pH 7.2緩沖液(0.15 mol/L NaCl、0.1 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L 檸檬酸)進(jìn)行透析24 h。透析好的膠原溶液放在水浴25 ℃下保溫使膠原自組裝形成纖維。

1.3.3.1 濁度

在膠原自組裝過(guò)程中，利用UV-2600A紫外分光光度計(jì)間隔2 min測(cè)花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白在313 nm處的動(dòng)態(tài)吸光值，繪制濁度曲線。

1.3.3.2 掃描電鏡觀察

將自組裝形成的膠原膠體置于pH 7.4含2.5%(V/V)戊二醛的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液中固定1 d，用pH 7.4的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液漂洗后，再利用不同濃度的乙醇(30%～100%，由低到高)梯度脫水，經(jīng)CO2臨界點(diǎn)干燥，E-1010離子濺射儀鍍金處理，再用S-4800電子掃描顯微鏡觀察拍照記錄。

1.3.3.3 動(dòng)態(tài)黏彈性

pH 7.2緩沖液透析完成的膠原蛋白溶液根據(jù)趙燕等[11]報(bào)道的方法測(cè)定該膠原蛋白溶液的彈性模量值(G’)和黏性模量值(G”)，繪制黏彈模量隨時(shí)間變化的曲線。測(cè)定條件：φ40 mm標(biāo)準(zhǔn)鋁材質(zhì)平板模具；控制間隙：1 mm；測(cè)定溫度：25 ℃；掃描模式：時(shí)間掃描；掃描時(shí)長(zhǎng)：90 min。形變率：1%；頻率：1 Hz。

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果

花鰻鱺魚(yú)皮經(jīng)堿除雜蛋白、正丁醇脫脂、胃蛋白酶及乙酸抽提處理、透析和干燥后得到花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白。該膠原蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE patterns of the collagen from A.marmorata skins M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；C：花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白

在SDS-PAGE圖譜中，花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白至少有5條條帶出現(xiàn)，分別為α1、α2、α3、β和γ。α1的分子量約為118 kDa；α2的分子量比α1的小，其條帶也比α1淺，表明α1是花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的主要成分；有α3肽鏈存在，分子量比α1的小比α2的大。β條帶的分子量在200 kDa以上，推測(cè)認(rèn)為是α1鏈的二聚體；α3和γ的濃度值均低。根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，認(rèn)為花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白屬于Ⅰ型膠原蛋白，標(biāo)記為[α1(I)]2α2(Ⅰ)。

2.2 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的氨基酸組成

花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白經(jīng)酸水解后得到的氨基酸組成如表1。由表1可見(jiàn)，花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白含有豐富的Gly，約占總氨基酸數(shù)的1/3，Pro含量為11.2%，Hyp含量為7.67%，三者的比值約為8∶3∶2，符合膠原蛋白的氨基酸組成特點(diǎn)。膠原蛋白中占比大的氨基酸依次是Gly、Ala、Hyr、Glu和Pro，含量最小的是胱氨酸，沒(méi)有檢測(cè)到羥賴氨酸。

表1 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白氨基酸組成Tab.1 Amino acid compositions of collagen from A.marmorata skins ‰

2.3 紫外吸收光譜特性

紫外光譜的作用主要是考察研究對(duì)象中是否存在共軛體系?；狑~魚(yú)皮膠原蛋白的紫外吸收光譜圖見(jiàn)圖2。從圖2可以看到，花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白在200～400 nm紫外區(qū)段有吸收峰，說(shuō)明該膠原蛋白分子中存在共軛體系，其最大吸收波長(zhǎng)為222.6 nm。

2.4 傅里葉變換紅外光譜特性

紅外光譜能測(cè)定有機(jī)化合物在紅外區(qū)域波長(zhǎng)的光照射下的吸收情況，有機(jī)物中不同的基團(tuán)在不同波長(zhǎng)處有特征的吸收峰，所以借助于紅外光譜的測(cè)定，通過(guò)分析紅外譜圖中波數(shù)4 000～1 300 cm-1區(qū)域中的吸收峰，可以推測(cè)該化合物中存在哪些官能團(tuán)?；狑~魚(yú)皮膠原蛋白的傅里葉紅外光譜圖見(jiàn)圖3。

圖2 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of collagen from A.marmorata skins

圖3 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的傅里葉紅外光譜Fig.3 Fourier transform infrared spectra of collagen from A.marmorata skins

根據(jù)圖3，該膠原蛋白的紅外光譜特征吸收峰為酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。酰胺A的吸收峰在3 307 cm-1處，酰胺B的吸收峰在2 930 cm-1處，酰胺I的吸收峰在1 652 cm-1處，酰胺Ⅱ的吸收峰在1 548 cm-1處，酰胺Ⅲ的吸收峰在1 238 cm-1處。酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ吸收峰的存在說(shuō)明所提取的花鰻鱺膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)均沒(méi)有被破壞。所提取的花鰻鱺膠原蛋白是經(jīng)胃蛋白酶處理酸溶得到的膠原蛋白，傅里葉紅外光譜結(jié)果表明膠原蛋白經(jīng)胃蛋白酶處理后三股螺旋結(jié)構(gòu)還存在。

2.5 粘度和熱變性特性

花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的比濃粘度ηre值隨溫度上升的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖4。溫度值在25 ℃之前比濃粘度ηre值變化小，可視作是穩(wěn)定態(tài)；25～35 ℃比濃粘度ηre值急劇下降；當(dāng)溫度值達(dá)35 ℃時(shí)比濃粘度ηre值就很小了，35～45 ℃變化不大。

圖4 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的熱變性曲線Fig.4 Thermal denaturation curve of collagen from A.marmorata skins

根據(jù)圖4花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的熱變性曲線，可以獲得Td為28 ℃，這表示花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)在超過(guò)28 ℃后螺旋的穩(wěn)定性會(huì)下降。

2.6 體外自組裝動(dòng)力學(xué)特性

花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的濁度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。通過(guò)分析該濁度-時(shí)間曲線，可以發(fā)現(xiàn)該膠原蛋白的纖維形成過(guò)程的特點(diǎn)是：在25 ℃下保溫的前6 min內(nèi)，濁度值變化小，酸溶性膠原蛋白ASC的A313 nm平均值為0.134，是成纖維過(guò)程的遲滯期；隨后A313 nm值增加，10～20 min濁度值迅速上升，是成纖維過(guò)程的成長(zhǎng)期；26 min后漸漸進(jìn)入穩(wěn)定態(tài)，34 min時(shí)進(jìn)入成纖維的平穩(wěn)期，ASC的A313 nm平均值為1.476。

圖5 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的濁度-時(shí)間曲線Fig.5 Turbidity-time curves of collagen from A.marmorata skins

花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的動(dòng)態(tài)黏彈性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6。分析該流變彈性和黏性模量曲線，可以看出，隨著組裝時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白的模量(彈性模量和黏性模量)值展現(xiàn)出與濁度曲線相似的演變行為，即在組裝初期，模量值較低，隨后進(jìn)入模量值的增長(zhǎng)階段并最終達(dá)到平衡。組裝初期膠原溶液的黏性模量G”(loss modulus)大于彈性模量G’(storage modulus)，這可以解釋成此時(shí)的膠原是以液體狀態(tài)存在，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，彈性模量G’的增加速率大于黏性模量G”，在大約7 min時(shí)，兩者出現(xiàn)交匯點(diǎn)即凝膠點(diǎn)，交匯點(diǎn)彈性模量G’為0.091 Pa。之后彈性模量值快速上升，膠原分子有序地聚集形成凝膠纖維，經(jīng)過(guò)約30 min的增長(zhǎng)期后，花鰻鱺膠原蛋白形成膠原凝膠纖維的速度進(jìn)入了穩(wěn)定期，第一個(gè)平衡點(diǎn)(37 min)的彈性模量G’為62.64 Pa。

圖6 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的流變彈性和黏性模量曲線Fig.6 The storage modulus(G’)and loss modulus(G”)for self-assembling of collagen from A.marmorata skins

2.7 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)

從圖7可以發(fā)現(xiàn)，花鰻鱺膠原蛋白自組裝后出現(xiàn)纖維結(jié)構(gòu)，5 000倍和50 000倍的視野里，凝膠呈網(wǎng)狀的交錯(cuò)條紋纖維結(jié)構(gòu)。在100 000倍的視野里，通過(guò)SEM(scanning electron microscope)自帶軟件計(jì)算出花鰻鱺膠原凝膠纖維的直徑主要集中在48.3～74.6 nm。

3 討論

3.1 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果的解析

Weng等[14]在研究金鯧魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白的亞基結(jié)構(gòu)特征時(shí)指出α1肽鏈的分子量比α2肽鏈的高，但等電點(diǎn)比α2肽鏈的低，而且魚(yú)種間的氨基酸序列差異比α2肽鏈的更明顯。Veeruraj等[12]認(rèn)為海鰻魚(yú)皮中有α3肽鏈存在，分子量比α1的小比α2的大；α3與α1以共同存在的形式出現(xiàn)，不易分離。朱圣庚等[15]認(rèn)為Ⅰ型膠原蛋白是在骨、皮膚、腱和角膜中占優(yōu)勢(shì)的膠原蛋白，由2條相同的α1(Ⅰ)肽鏈和1條α2(Ⅰ)肽鏈構(gòu)成。根據(jù)這些學(xué)者的觀點(diǎn)，結(jié)合SDS-PAGE結(jié)果，認(rèn)為推定花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白屬于I型膠原蛋白是正確的。

圖7 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白纖維SEM圖Fig.7 SEM pictures of collagen from A.marmorata skins

3.2 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白氨基酸組成與其他鰻魚(yú)皮膠原蛋白氨基酸組成的比較

與Veeruraj等[12]報(bào)道的提自海鰻魚(yú)皮的酸溶性膠原蛋白(ASC)的氨基酸組成和鴻巢章二等[13]介紹的七鰓鰻膠原蛋白的氨基酸組成相比，膠原蛋白中占比最大的氨基酸有相似性，如Gly、Ala、Hyr、Pro；但含量較少的氨基酸有一些差異，如七鰓鰻中沒(méi)有檢測(cè)到胱氨酸，而花鰻鱺膠原蛋白中檢測(cè)出有胱氨酸，海鰻ASC中檢測(cè)出有半胱氨酸(Cys)。溫慧芳等[16]在研究不同提取方法提取所得到鮰魚(yú)皮膠原蛋白氨基酸組成時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白的1 000個(gè)氨基酸殘基中分別小于0.1個(gè)和0.5個(gè)Cys。而張強(qiáng)等[17]在研究鰱魚(yú)皮膠原蛋白的提取方法時(shí)，不論是酸法或是酶法或是熱水浸提法提取的鰱魚(yú)皮膠原蛋白均沒(méi)有檢測(cè)到Cys。由此可見(jiàn)不同來(lái)源不同方法提取的膠原蛋白是否有Cys，是一個(gè)值得探究的問(wèn)題。

3.3 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的紫外吸收光譜圖分析

花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的最大紫外吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)是222.6 nm。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的最大紫外吸收峰會(huì)出現(xiàn)在280 nm處?；狑~魚(yú)皮膠原蛋白的吸收峰為什么沒(méi)有出現(xiàn)在280 nm？分析原因，在280 nm處才有強(qiáng)力紫外吸收的氨基酸是色氨酸，可膠原蛋白中幾乎不含色氨酸[17]。膠原蛋白中貢獻(xiàn)苯環(huán)共軛π體系的氨基酸是Phe和Tyr，它們的最大光吸收波長(zhǎng)分別是257和275 nm[15]，Phe和Tyr在花鰻鱺膠原蛋白中的含量分別為18個(gè)和10個(gè)/1 000個(gè)氨基酸殘基中。另外肽鍵的-C=O、-CONH2或與膠原螺旋構(gòu)象有關(guān)的次級(jí)鍵也可以組成共軛體系，在210～250 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)吸收峰[16]。使花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白最大吸收波長(zhǎng)處在222.6 nm的另一個(gè)重要原因是溶劑(本次實(shí)驗(yàn)所用的溶劑是乙酸)，溶劑會(huì)影響吸收峰的位置，乙酸是極性溶劑，會(huì)影響π電子躍遷所需的能量[18]，我們通過(guò)Tyr標(biāo)準(zhǔn)品(生化試劑級(jí))溶于乙酸后上機(jī)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了乙酸確實(shí)使Tyr的最大光吸收波長(zhǎng)向短波方向移動(dòng)了一些。

3.4 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜圖分析

花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的紅外光譜圖中含有酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ吸收峰，與Heu等[19]所報(bào)道的比目魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白和Veeruraj等[12]報(bào)道的海鰻魚(yú)皮的ASC的紅外光譜結(jié)果類似。酰胺A是肽鏈中N-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，其峰形比較尖，波數(shù)范圍通常是3 440～3 400 cm-1，當(dāng)N-H參與氫鍵形成時(shí)，吸收峰會(huì)向低波數(shù)移動(dòng)一些[20]。酰胺B為-CH2-的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰[21]。酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰被認(rèn)為與多肽鏈的結(jié)構(gòu)直接相關(guān)[19]。酰胺Ⅰ是酰胺鍵中的-C=O伸縮振動(dòng)峰，這是多肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)存在的敏感標(biāo)志[22]，酰胺Ⅱ是酰胺鍵中的N-H和C-N的彎曲振動(dòng)所產(chǎn)生的，酰胺Ⅲ是Gly殘基和Pro殘基中的-CH2所產(chǎn)生的振動(dòng)峰。當(dāng)酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ吸收峰同時(shí)存在時(shí)說(shuō)明膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)均沒(méi)有被破壞。

3.5 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的熱變性特性分析

本研究表明膠原蛋白的Td是28 ℃，雖然這是一個(gè)體外研究結(jié)果，但對(duì)養(yǎng)殖花鰻鱺的水溫控制有一定的指導(dǎo)意義。朱陳平[23]認(rèn)為養(yǎng)殖花鰻鱺時(shí)投食量與養(yǎng)殖池的水溫有關(guān)，水溫24～29 ℃花鰻鱺的食量較大，超過(guò)30 ℃后食量變小。鴻巢章二等[13]認(rèn)為膠原的熱穩(wěn)定性與全部亞氨基酸(Pro+Hyp)，尤其是含量之間存在著正的相關(guān)性，因?yàn)閬啺被岬倪量┉h(huán)對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)所起的固定化以及Hyp的羥基所形成的氫鍵對(duì)膠原螺旋的穩(wěn)定性起著大的作用。Veeruraj等[12]報(bào)道的海鰻魚(yú)皮ASC膠原蛋白的Td為38.5 ℃，亞氨基酸(Pro+Hyp)量為(96+94)/1 000，Gly∶Pro∶Hyp為3∶1∶1；張強(qiáng)等[17]報(bào)道的鰱魚(yú)皮ASC的Td為31 ℃，亞氨基酸(Pro+Hyp)量為(128+65)/1 000，Gly∶Pro∶Hyp為5∶2∶1；花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的亞氨基酸(Pro+Hyp)量為(112+76)/1 000，Gly∶Pro∶Hyp為8∶3∶2?；狑~魚(yú)皮膠原蛋白的熱變性溫度Td比海鰻魚(yú)皮膠原蛋白和鰱魚(yú)皮膠原蛋白的都低，而它們?nèi)叩膩啺被峥偭慷荚?90/1 000左右，所以膠原的熱穩(wěn)定性，除了與全部亞氨基酸含量有相關(guān)性外，應(yīng)該與膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)關(guān)系密切的Gly∶Pro∶Hyp比值也有關(guān)，因?yàn)槎嚯逆満荛L(zhǎng)區(qū)段是由Gly-x-y氨基酸序列重復(fù)而成的[15]。

3.6 體外自組裝動(dòng)力學(xué)特性分析

分析花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的濁度曲線和流變黏彈性模量曲線的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的體外自組裝動(dòng)力學(xué)特性表現(xiàn)為典型的3階段模式，即遲滯期、成長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。這與Comper等[24]報(bào)道的膠原纖維體外成核模式，以及趙燕等[11]描述的草魚(yú)和烏鱧魚(yú)皮膠原的自組裝特征有相似之處。盡管花鰻鱺的生活史有在深海中產(chǎn)卵孵化這個(gè)特點(diǎn)，但它的生長(zhǎng)成熟是在淡水中完成的，所以它的膠原自組裝特征與淡水魚(yú)魚(yú)皮膠原的相似是能理解的。

3.7 花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)分析

在5 000倍和50 000倍的視野里，花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白自組裝后出現(xiàn)的是網(wǎng)狀的交錯(cuò)條紋纖維結(jié)構(gòu)。這與Zhang等[25]報(bào)道的鱘魚(yú)皮膠原蛋白的膠原纖維SEM圖相似。張強(qiáng)等[17]在報(bào)道鰱魚(yú)皮ASC和PSC(pepsin soluble collagen)膠原蛋白的膠原纖維微觀結(jié)構(gòu)時(shí)，認(rèn)為酸法保持了膠原纖維原有的結(jié)構(gòu)，而胃蛋白酶法對(duì)膠原纖維的結(jié)構(gòu)有一定的影響。我們?cè)谘芯恐幸灿袊L試用酸法和酶法分別提取，但提取得率都不及胃蛋白酶結(jié)合酸法的，從圖7可以發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶結(jié)合酸法提取得到的花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白所形成的凝膠很好地保持了膠原纖維原有的結(jié)構(gòu)。通常，酶溶性膠原不具備成纖維能力，因?yàn)槎穗谋晃傅鞍酌盖械艉?，不容易形成纖維凝膠，但這里形成的凝膠纖維直徑卻較大，值得討論。分析可能的原因有：一是花鰻鱺的魚(yú)皮比一般魚(yú)皮要厚實(shí)得多；二是提取時(shí)所用的酶量小，主要還是靠乙酸破壞膠原氫鍵促使膠原蛋白溶解到溶液中。

4 結(jié)論

SDS-PAGE結(jié)果表明花鰻鱺魚(yú)皮膠原蛋白屬于Ⅰ型膠原蛋白，氨基酸組成中Gly約占1/3，Gly∶Pro∶Hyp三者的比值約為8∶3∶2；膠原蛋白分子中存在共軛體系，最大的紫外吸收峰出現(xiàn)在波長(zhǎng)222.6 nm處，紅外光譜吸收峰中有酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等膠原蛋白的特征吸收峰，熱變性溫度為28 ℃。紅外光譜圖和SEM掃描結(jié)果均顯示經(jīng)胃蛋白酶處理酸溶得到的膠原蛋白保持了膠原原有的結(jié)構(gòu)?；狑~魚(yú)皮膠原蛋白體外自組裝動(dòng)力學(xué)曲線圖表現(xiàn)為典型的三階段模式圖，即為包含遲滯期、成長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的曲線圖。