稻田養(yǎng)殖的大鱗副泥鰍出血病病原菌的分離鑒定與藥敏試驗

雷 坤，謝業(yè)揚，馬遠(yuǎn)雄，王邦杰，范道周，陸專靈，徐娣美，何有柯，韋友傳

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530000； 2.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，南寧 530000)

魚類出血病又稱為細(xì)菌性敗血癥、爆發(fā)性出血病，主要病癥為魚體各器官組織充血、出血，可造成魚類全身性出血甚至死亡[1]。研究表明嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)和維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、寄生蟲等多種病原都可導(dǎo)致魚類發(fā)生出血病病害[2-8]。

大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)屬鯉形目鰍科花鰍亞科副泥鰍屬，廣泛分布于東亞地區(qū)，為小型淡水底棲魚類。因其味道鮮美、肉質(zhì)細(xì)嫩、營養(yǎng)豐富被譽為“水中人參”[9]，已成為稻田養(yǎng)殖的主要魚類。2018年7月廣西那坡縣念頭村稻田養(yǎng)殖的大鱗副泥鰍發(fā)生出血病病害，病魚表現(xiàn)為離群、行動遲緩、精神不振、不攝食，軀干兩側(cè)、鰭基部皮膚出血、腫脹；解剖結(jié)果顯示腹腔內(nèi)積水，胃部內(nèi)無食物，后腎、肝臟不同程度出血。病程持續(xù)3周，死亡率達(dá)70%，給養(yǎng)殖戶造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前關(guān)于稻田養(yǎng)殖的大鱗副泥鰍出血病病害還未見報道。本研究應(yīng)用病原微生物分離技術(shù)、回歸感染實驗、生理生化鑒定、16S rDNA克隆測序和生物信息學(xué)等方法分離鑒定大鱗副泥鰍出血病病原、分析病原的致病性、測定病原藥物敏感性，以期為防控稻田養(yǎng)殖的大鱗副泥鰍出血病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病大鱗副泥鰍體質(zhì)量(14.2±5.2)g，來自廣西百色市那坡縣某稻田養(yǎng)殖場。健康大鱗副泥鰍400條，體質(zhì)量(22.6±8.3)g由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院那馬基地贈送，實驗室水族箱暫養(yǎng)兩周，水溫(26±2)℃，每天喂食1次商品顆粒飼料，確認(rèn)健康狀態(tài)良好后用于回歸感染實驗。普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司；水解酪蛋白瓊脂(MH)和兔血營養(yǎng)瓊脂平板購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。藥敏紙片和細(xì)菌生化微量鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自艾德萊生物科技有限公司。引物合成和16S rDNA測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 病原菌分離

無菌條件下，從患病大鱗副泥鰍病灶部位(體表、肝臟、后腎)取樣，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)16 h，挑選單個優(yōu)勢菌落再次劃線培養(yǎng)，兩次純化后挑取單個菌落轉(zhuǎn)接到斜面普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基保種備用。

1.3 回歸感染實驗

取斜面瓊脂培養(yǎng)基中的保種菌株接種于普通LB液體培養(yǎng)基，30 ℃恒溫震蕩過夜，采用平板菌落計數(shù)法計算菌液濃度。用PBS制備濃度為5×102、5×103、5×104、5×105、5×106、5×107、5×108、5×109、5×1010、5×1011CFU/mL菌懸液，PBS作為對照組。采用腹腔注射法，注射劑量為0.1 mL/條，每組20條。注射后飼養(yǎng)于水族箱，實驗期間正常投喂，觀察兩周，每天記錄實驗魚發(fā)病死亡情況。根據(jù)實驗結(jié)果使用SPSS軟件計算半致死量LD50。

1.4 生理生化鑒定

取致病菌株分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與兔血瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌株形態(tài)特征及溶血性。革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察其形態(tài)特征。用細(xì)菌生化微量鑒定管對致病菌進(jìn)行生理生化鑒定。

1.5 16S rDNA分子鑒定

參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取病原菌基因組DNA。16S rDNA PCR擴(kuò)增所需通用引物分別為：上游引物F1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物R1：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系：ddH2O 8.5 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.15%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化，PCR回收產(chǎn)物連接至pTOPO-T載體，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞TOP10，挑選陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 序列比對以及進(jìn)化樹構(gòu)建

使用SeqMan軟件進(jìn)行測序結(jié)果拼接。使用在線軟件BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行同源基因的搜索、DNAstar軟件進(jìn)行同源性分析、MEGA5.0軟件以及鄰接法構(gòu)建N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹(設(shè)定bootstraps為1 000)。

1.7 藥敏試驗

藥敏試驗采用K-B紙片擴(kuò)散法[10]。即以涂布法接種擴(kuò)大培養(yǎng)后的致病菌菌液(2×108CFU/mL)到MH固體培養(yǎng)基，然后將藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)18～24 h后測定抑菌圈直徑(mm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸感染實驗

從病灶部位體表、肝臟和后腎組織分別分離得到一株優(yōu)勢菌，命名為DLFNQ-1、DLFNQ-2、DLFNQ-3。人工感染實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)DLFNQ-2、DLFNQ-3各梯度菌液對大鱗副泥鰍不具致病性；DLFNQ-1對大鱗副泥鰍具有致病性。DLFNQ-1致死率為0%的最大菌懸液濃度為5×104CFU/mL，致死率為100%的最小菌懸液濃度為5×1010CFU/mL；其中5×105、5×106、5×107、5×108、5×109CFU/mL 菌懸液組2周內(nèi)死亡數(shù)分別為4、7、11、14、17只。使用SPSS軟件中的分析-回歸-Probit功能計算DLFNQ-1的LD50為2.3×107CFU/mL。

回歸感染注射DLFNQ-1菌懸液后部分試驗魚體表粘液消失，繼而腫脹出血，解剖結(jié)果顯示腹腔內(nèi)少量積水，肝臟與后腎出血，與自然發(fā)病的大鱗副泥鰍癥狀一致；對感染魚進(jìn)行細(xì)菌再分離得到菌落形態(tài)單一的菌落，生化鑒定結(jié)果與DLFNQ-1一致。PBS對照組大鱗副泥鰍未出現(xiàn)死亡情況，也無任何病癥出現(xiàn)，活力與正常個體無差別。

2.2 生理生化鑒定結(jié)果

DLFNQ-1在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長狀況良好，菌落表面光滑、圓整、微微凸起、無色或淡黃色，菌落半透明且具有芳香氣味，直徑1.5～2 mm，革蘭氏染色結(jié)果顯示其為陰性短桿狀，兩端鈍圓(圖1)。在兔血營養(yǎng)瓊脂平板上形成β溶血環(huán)。DLFNQ-1的葡萄糖、阿拉伯糖、氧化酶、七葉靈反應(yīng)均為陽性；檸檬酸、尿素酶、MR等反應(yīng)均為陰性(表1)初步鑒定DLFNQ-1菌株為嗜水氣單胞菌。對感染魚進(jìn)行致病菌再分離得到一優(yōu)勢菌株，其菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色結(jié)果以及生理生化特性與DLFNQ-1一致。

2.3 16SrDNA基因序列分析

以分離得到的DLFNQ-1菌株基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳顯示單一條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收連接轉(zhuǎn)化，挑選菌液陽性克隆送至生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示DLFNQ-1菌株的16S rDNA序列長度為1 509 bp(圖2)，序列已提交GenBank(登錄號：MK142306)。在線工具進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果顯示其與嗜水氣單胞菌(登錄號：JN391411.1)的相似度高達(dá)99.7%。

項目DLFNQ-1嗜水氣單胞菌葡萄糖++果糖++麥芽糖++纖維二糖--阿拉伯糖++蔗糖++甘露糖++半乳糖++伏普++吲哚++氧化酶++硝酸鉀++精氨酸雙水解++檸檬酸--賴氨酸脫羧酶++七葉靈++尿素酶--已二酸--甲基紅--

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性

2.4 進(jìn)化樹構(gòu)建

選擇GenBank中氣單胞菌科(Aeromonas)、弧菌科(Vibrionaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)共計12個標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA基因序列，使用MEGA5軟件以鄰近法構(gòu)建(Bootstrap值為1 000)DLFNQ-1菌株16SrDNA基因的N-J進(jìn)化樹。結(jié)果顯示DLFNQ-1菌株16S rDNA序列與嗜水氣單胞菌聚為一支，具有較高的Bootstrap值(圖3)。結(jié)合細(xì)菌形態(tài)特征和生理生化鑒定結(jié)果，確定DLFNQ-1為嗜水氣單胞菌。

圖2 DLFNQ-1的16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR amplification results of 16S rDNA gene of the DLFNQ-1

2.5 藥敏試驗結(jié)果

病原菌DLFNQ-1對17種抗生素的藥敏試驗結(jié)果見表2。該菌株對慶大霉素、妥布霉高度敏感，對阿洛西林、哌拉西林、卡那霉素、新霉素、鏈霉素等中度敏感，對青霉素、左氟沙星、阿莫西林等呈現(xiàn)一定程度的耐藥性。

圖3 菌株DLFNQ-1的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences from DLFNQ-1，and other related bacteria 發(fā)育樹上的Bootstrap值為1 000，菌株DLFNQ-1用(◆)表示。

表2 病原菌DLFNQ-1的藥敏實驗結(jié)果Tab.2 The drug sensitivity test of the DLFNQ-1

注：抑菌圈直徑包括藥敏片直徑，S：高度敏感，I：中度敏感，R：不敏感

3 討論

嗜水氣單胞菌隸屬氣單胞菌科氣單胞菌屬，在淡水、污水及土壤中廣泛分布?？筛腥径喾N動物，如大鯢(Andrias)[11]、黃鱔(Monopterusalbus)[12]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[13]、胡子鯰(Clariasfuscus)[14]、斑點叉尾鮰(Ietaluruspunetaus)[15]、牛蛙(Lithobatescatesbeiana)[16]，在蚌科[17]、蟹類[18]中也有嗜水氣單胞菌引起病害的報道；其感染人類導(dǎo)致腹瀉發(fā)生[19]。本研究從稻田養(yǎng)殖的患出血病大鱗副泥鰍中分離獲得嗜水氣單胞菌，回歸感染實驗證實其對健康大鱗副泥鰍具有致病性。這與前人報道的嗜水氣單胞菌對水產(chǎn)動物具有致病性相一致。但是引起泥鰍出血病的細(xì)菌存在多樣性：維氏氣單胞菌可導(dǎo)致泥鰍下頜腹部發(fā)紅，肝臟脾臟出血[5]；溫和氣單胞菌可導(dǎo)致泥鰍體表呈點狀出血，腹部腫脹[6]；豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)可導(dǎo)致泥鰍體表表皮剝落進(jìn)而在這些部位出現(xiàn)血斑，并且腸道有出血癥狀[20]。本次分離得到的嗜水氣單胞菌引起大鱗副泥鰍體表、鰭基部皮膚腫脹出血，后腎、肝臟不同程度出血，與上述氣單胞菌引起泥鰍出血病的病癥表現(xiàn)并不完全一致，可能是嗜水氣單胞菌與其它氣單胞菌不同的致病機制導(dǎo)致的，具體原因有待進(jìn)一步研究。

本研究分離得到的嗜水氣單胞菌半致死濃度為2.3×107CFU/mL，也有研究顯示嗜水氣單胞菌對健康加州鱸(Micropterussalmoides)的半數(shù)致死劑量為5.7×105CFU/mL[2]；嗜水氣單胞菌濃度達(dá)到5×104CFU/mL 時黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)死亡率在40%～50%[21]；嗜水氣單胞菌對黃河鯉(Cyprinuscarpio)的半致死濃度為1.38×107CFU/mL[22]。表明不同的水生動物對嗜水氣單胞菌具有不同的毒力耐受性。嗜水氣單胞菌為條件性致病菌，其致病性會因環(huán)境改變而有所不同，因此嗜水氣單胞菌對大鱗副泥鰍半致死濃度還可能與稻田養(yǎng)殖的環(huán)境有關(guān)。

目前抗生素類藥物仍然是治療水生動物病害的主要手段。對DLFNQ-1菌株的藥敏實驗結(jié)果與李煥榮等[23]、楊寧等[24]和余波等[11]報道的嗜水氣單胞菌藥敏試驗結(jié)果不完全一致。其原因可能是感染不同物種的嗜水氣單胞菌因感染對象和環(huán)境的不同而產(chǎn)生變異；也可能是不同物種的嗜水氣單胞菌對抗生素類藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性[25-26]。結(jié)合本次實驗，稻田養(yǎng)殖大鱗副泥鰍出血病的防治建議使用對嗜水氣單胞菌高度敏感的慶大霉素或妥布霉素。此外，在稻田養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意減少不合理操作對魚體表的創(chuàng)傷、適當(dāng)投喂?fàn)I養(yǎng)全面的飼料以及合理的換水，增強大鱗副泥鰍免疫力，從而減少病害的發(fā)生。