藍(lán)莓外植體不同取材時(shí)間滅菌方法研究

周閏 周玲紅 申超峰 鄧朝艷 黃麗芳

摘要：選用兔眼藍(lán)莓“燦爛”當(dāng)年生半禾質(zhì)化帶腋芽莖段做外植體。從3月下旬至6月下旬共7次取材，根據(jù)外植體木質(zhì)化程度的不同，選取不同的消毒試劑和消毒時(shí)間，為篩選出不同取材時(shí)間最適合的滅菌方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：“燦爛”最佳的取樣時(shí)期是4月份，最佳滅茵方法是將莖段分為嫩部及半木質(zhì)化部?jī)刹糠?，嫩部?.1%升汞滅菌6～7min最佳，其污染率為4.4%～6.7%，褐化率為6.7%～11.1%·萌芽率達(dá)到84.5%～86.7%;半木質(zhì)化部用0.1%升汞滅茼10～11rain最佳，其污染率為4.4%～13.3%，褐化率為2.2%～6.7%，萌芽率達(dá)到84.5%～88.9%。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓;組織培養(yǎng);取材時(shí)間;滅茵方法

中圖分類號(hào)：Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2019）19-0169-03

1引言

藍(lán)莓（Blueberry），又名越橘或漿果，杜鵑花科，越桔屬，多年生灌木小漿果果樹(shù)。藍(lán)莓果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“世界第三代水果之王”。藍(lán)莓低糖、低脂肪、抗氧化能力強(qiáng)，還具有增強(qiáng)人體免疫力、抗癌、延緩衰老，防止腦神經(jīng)老化、強(qiáng)心、軟化血管等功能，因此被國(guó)際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一。由于果實(shí)具有獨(dú)特的風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，藍(lán)莓作為一種高檔水果深受市場(chǎng)歡迎，栽培藍(lán)莓的經(jīng)濟(jì)效益顯著。

中國(guó)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展相對(duì)較晚，大部分品種均引自國(guó)外，優(yōu)良品種相對(duì)較少，為促進(jìn)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，需在短期之內(nèi)獲得大量的優(yōu)質(zhì)種苗，而藍(lán)莓的常規(guī)繁殖方法速度較慢、繁殖規(guī)模受到阻礙且苗木在生長(zhǎng)勢(shì)、果實(shí)品質(zhì)等諸多方面存在不足，故進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)，則需利用組培快繁技術(shù)。

在組織培養(yǎng)中，外植體的滅菌效果直接關(guān)系到后續(xù)芽誘導(dǎo)的效果及組培苗的成活率，確定合適的滅菌方法在生產(chǎn)實(shí)踐中尤為重要。實(shí)驗(yàn)旨在比較研究不同取材時(shí)間采取不同滅菌方法對(duì)藍(lán)莓外植體滅菌效果的影響，最大限度降低外植體的污染率，為藍(lán)莓規(guī)?；M培快繁生產(chǎn)實(shí)踐提供理論參考。

2材料與方法

2.1供試材料

組培所用的藍(lán)莓外植體為兔眼藍(lán)莓品種“燦爛”，于2019年3～6月份共7次采自于郴州市農(nóng)科所保和果蔬基地五年生的藍(lán)莓植株，取樣時(shí)間分別為3月26日、4月9日、4月25日、5月7日、5月23日、6月5日、6月23日。

2.2方法

2.2.1材料處理

在連續(xù)天氣晴朗3d后的上午11：00剪取枝條，選取生長(zhǎng)旺盛、無(wú)病蟲(chóng)害的當(dāng)年生的健壯嫩梢，將葉片去掉，留少量葉柄，在水龍頭下用流水沖洗干凈，然后將枝條分為半木質(zhì)化部及嫩部?jī)刹糠?，其中半木質(zhì)化部的枝條剪成長(zhǎng)約1～2cm的帶腋芽莖段，嫩部則剪成長(zhǎng)3～4cm帶腋芽莖段。剪取的藍(lán)莓莖段，直接加無(wú)菌水放置于恒溫震蕩器上震蕩0.5～1h，期間更換無(wú)菌水2次，濾干水后置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行外植體滅菌。

2.2.2外植體表面消毒

半木質(zhì)化部的莖段先用75%酒精浸泡30S，倒出酒精，用無(wú)菌水清洗一遍，再用含0.1%吐溫80的0.1%升汞溶液浸泡10～15min;嫩部莖段直接用含0.1%吐溫80的0.1%升汞溶液浸泡5～9min。消毒時(shí)不斷搖動(dòng)，消毒后的莖段用無(wú)菌水清洗5次，濾干水分，再用無(wú)菌濾紙吸干水分備用。切去兩端受損組織，嫩部莖段還需再剪成1～2cm長(zhǎng)的帶腋芽的莖段，按無(wú)菌操作要求接種于初代培養(yǎng)基上，每瓶接種1個(gè)莖段。然后放置于培養(yǎng)室，觀察不同滅菌處理的效果。

2.2.3培養(yǎng)條件

試驗(yàn)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加玉米素（ZT）和NAA作為外源激素：ZT濃度為1.0mg/L，NAA濃度為0.01mg/L，培養(yǎng)基中蔗糖含量為3%，瓊脂含量為0.65%，pH值調(diào)至5.8，將配制好的培養(yǎng)基置于121℃，1.1kg/cm²壓力下高溫滅菌20min。接種好的材料在23～28℃，12h/d光照，2000lx光照強(qiáng)度下進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2.4數(shù)據(jù)處理

接種后定期記錄材料情況，接種20d后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率、萌芽率。

污染率=（外植體中染菌的數(shù)量/接種的外植體總數(shù)）×100%，

褐化率=（外植體中褐化的數(shù)量/接種的外植體總數(shù)）×100%，

萌芽率=（萌芽不污染的外植體數(shù)量/接種的外植體總數(shù)）×100%。

3結(jié)果與分析

3.1不同取材時(shí)間最佳的滅菌方法

從表1可知，3月份取材的外植體嫩部用0.1%升汞滅菌4～6min，其污染率低于4.4%，但是褐化率達(dá)57.8%以上，導(dǎo)致其萌芽率在17.8%以下;3月份取材的半木質(zhì)化部滅菌4～8min處理，其污染率低于8.9%，但是褐化率達(dá)35.6%以上，其萌芽率在44.4%以下。從表2可知，4月份取材的外植體嫩部用0.1%升汞滅菌6～7min最佳，其污染率為4.4%～6.7%，褐化率為6.7%～11.1%，萌芽率達(dá)到84.5%～86.7%;4月份取材的半木質(zhì)化部滅菌10～11min最佳，其污染率為4.4%～13.3%，褐化率為2.2%～6.7%，萌芽率達(dá)到84.5%～88.9%。從表3可知，5月份取材的外植體嫩部用0.1%升汞滅菌8～9min最佳，其污染率為13.3%，褐化率為4.4%～8.9%，萌芽率達(dá)到73.3%～82.2%;5月份取材的半木質(zhì)化部滅菌12～14rain最佳，其污染率為11.1%～15.6%，褐化率為2.2%～6.7%，萌芽率達(dá)到75.6%～82.2%。從表4可知，6月份取材的外植體嫩部用0.1%升汞滅菌10～12min最佳，其污染率為17.8%～24.4%，褐化率為8.9%～13.3%，萌芽率達(dá)到42.2%～57.8%;6月份取材的半木質(zhì)化部滅菌15～16min最佳，其污染率為17.8%～35.6%，褐化率為8.9%～13.3%，萌芽率達(dá)到37.8%～57.8%。

3.2不同取材時(shí)間對(duì)萌芽率的影響

不同取材時(shí)間對(duì)燦爛莖段外植體的萌芽率影響很大，由表1～4可知，在3月下旬取的莖段，其萌芽率最高才達(dá)到44.4%，說(shuō)明3月份取材不合適;在4～5月份取的莖段，萌芽率為75.6%～88.9%，芽誘導(dǎo)率高，是合適的取材時(shí)間;6月上旬取的莖段，萌芽率為55.8%，6月下旬取的莖段，萌芽率降到42.2%以下，說(shuō)明6月下旬不適合取材。

4結(jié)論與討論

4.1結(jié)論

兔眼藍(lán)莓“燦爛”莖段外植體的取材時(shí)間不同，其最適合的滅菌方法也有變化：3月下旬至6月下旬，隨著季節(jié)的推遲，需要逐漸增加0.1%升汞滅菌的時(shí)間，才能將污染控制在較低的水平內(nèi)。

不同取材時(shí)間對(duì)“燦爛”莖段外植體的腋芽誘導(dǎo)率影響很大，3月下旬取材，腋芽誘導(dǎo)率44.4%以下，4月至6月上旬腋芽誘導(dǎo)率在57.8%以上，6月下旬腋芽誘導(dǎo)率在42.2%以下，因此，“燦爛”最佳的取樣時(shí)期是春稍生長(zhǎng)期枝條剛開(kāi)始木質(zhì)化的4月份，污染率低，誘導(dǎo)效果最好，5月至6月上旬取樣，污染率有所提高，但是萌芽率較高，也能成功建立莖段無(wú)菌培養(yǎng)體系，而6月下旬取樣，莖段培養(yǎng)污染率高，腋芽誘導(dǎo)率低，不適合取材。這與涂俊凡等的研究一致。

4.2討論

菌類污染是植物組織培養(yǎng)中較為常見(jiàn)的問(wèn)題，使用的消毒劑既要能夠把外植體表面的雜菌殺死，又必須容易被無(wú)菌水從外植體上沖洗干凈而不至于對(duì)外植體本身產(chǎn)生較大的毒害作用進(jìn)而影響其正常生長(zhǎng)。75%酒精滲透力很強(qiáng)，在短時(shí)間內(nèi)便可進(jìn)入植物細(xì)胞行使其毒力作用，所以應(yīng)用酒精消毒一般是在15～30s之內(nèi)，即便這樣，也可能會(huì)造成外植體一定的死亡率。所以在本試驗(yàn)中，對(duì)外植體嫩部并沒(méi)有用酒精進(jìn)行消毒，在培養(yǎng)過(guò)程中的褐化率相對(duì)較低。0.1%升汞是組織培養(yǎng)中常用的強(qiáng)消毒劑，具有很強(qiáng)的穿透力和殺傷力，容易殺死和損傷細(xì)胞，造成外植體的死亡。因此在使用時(shí)，應(yīng)當(dāng)控制好消毒的具體時(shí)間，既要能殺死表面的雜菌，又不能對(duì)外植體造成太大傷害。所以，篩選準(zhǔn)確的消毒時(shí)間對(duì)后續(xù)工作有至關(guān)重要的作用。

外植體取材時(shí)間對(duì)能否成功建立藍(lán)莓離體培養(yǎng)體系具有重要影響。在藍(lán)莓離體培養(yǎng)芽誘導(dǎo)初期，不同取材時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)芽萌發(fā)的效果不同，這種差異可能來(lái)自于植物體內(nèi)酚類化合物含量和多酚氧化酶活性的季節(jié)性變化。芽萌發(fā)初期，葉片及新梢中酚類物質(zhì)較少，隨著新梢的生長(zhǎng)，酚類物質(zhì)積累，多酚氧化酶活性增強(qiáng)，取樣外植體易褐化，影響初代培養(yǎng)效果。因此，合適的外植體取材時(shí)期是藍(lán)莓組培快繁成功與否的關(guān)鍵因素之一。