著絲粒蛋白T在乳腺癌中表達及其啟動子區(qū)變異的研究

畢佳欣，王曉雪，趙若晗，韓 旭，宋 潔*

(牡丹江醫(yī)學院生物學教研室，黑龍江 牡丹江157011)

著絲粒蛋白(centromere specific proteins，CENPs)是裝配在染色體DNA上的一個多蛋白大型復合體，是著絲粒組裝和功能發(fā)揮的基本組成單位。在有絲分裂過程中形成動粒，動粒-微管組成連接，為細胞有絲分裂中染色體的移動提供動力。CENPs結(jié)構(gòu)異常、表達異?；蚺cDNA作用異常，將影響著絲粒點的形成、激活、對稱性等，從而影響染色體的穩(wěn)定存在和正確分離。近年來，研究表明著絲粒蛋白調(diào)節(jié)異?；蚬δ苷系K會導致非整倍性并促進癌變。目前，在人體細胞中發(fā)現(xiàn)了多種CENPs，最先發(fā)現(xiàn)的是CENP-A、CENP-B，近期發(fā)現(xiàn)的有CENP-I、CENP-U、CENP-T等[1]，構(gòu)成了動粒核心蛋白網(wǎng)絡(constitutively centromere-associated network，CCAN)。目前，文獻證實CCAN中CENPs如CENP-A、CENP-E、CENPF、CENP-H、CENP-W、CENP-U在多種腫瘤中出現(xiàn)過表達，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。而CENP-T作為著絲粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)，是直接參與著絲粒染色質(zhì)的構(gòu)建的重要成員，對細胞的CCAN網(wǎng)絡構(gòu)成發(fā)揮重要作用[2-3]，但CENP-T在腫瘤中的表達情況及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制還未見報道。因此，本課題以組織和細胞水平實驗研究CENP-T在乳腺癌中的表達、生物學功能及機制，為闡明動粒網(wǎng)絡蛋白在腫瘤中的作用機制研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本及主要試劑

收集2017年10月—2018年4月間牡丹江市腫瘤醫(yī)院外科手術(shù)切除標本，乳腺癌患者的乳腺癌組織及遠離癌組織3～5 cm的癌旁正常乳腺組織26對，液氮保存。所有患者術(shù)前均未行任何治療，采集標本均得到患者的同意，標本經(jīng)術(shù)后病理證實為浸潤型乳腺導管癌和乳腺導管內(nèi)癌，排除其他腫瘤。本研究所使用的人體材料通過牡丹江醫(yī)學院醫(yī)學倫理委員會批準(批準文號2017-G11)。

正常人乳腺細胞系MCF10A和乳腺癌細胞系MCF7和MDA-MB-231均購于上海生命科學研究院細胞資源中心；兔抗人CENP-T多克隆抗體購于美國Gene Tex公司；CENP-T基因序列的特異性siRNA由廣州銳博公司設計并合成，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司，兔超敏二步法免疫組化檢測試劑PV-6001及DAB購于北京中杉金橋公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購于碧云天公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于BD公司。

1.2 免疫組織化學法檢測CENP-T蛋白表達

兔二步法(兔聚合物法檢測系統(tǒng)PV)進行IHC。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，以檸檬酸鈉進行抗原修復，依次滴加過氧化物酶室溫孵育10 min、正常山羊血清室溫孵育15 min，CENT-P一抗(稀釋度均為1∶300，4℃過夜)、生物素標記的二抗，室溫孵育20 min，辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育15 min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，脫水透明，封片。用PBS代替一抗作陰性對照。以卵巢癌石蠟切片為陽性對照。所有切片采用雙盲法，細胞核和胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，陽性程度根據(jù)其陽性細胞的比率和染色程度進行綜合評定。

1.3 CENP-T啟動子甲基化檢測

乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織10例進行啟動子甲基化檢測，采用Methprimer及EEMB OSS/cpgplot在線工具分析CENP-T啟動子區(qū)CpG島，兩個網(wǎng)站的預測結(jié)果一致，共存在一個CpG島，位置在1 819 bp至2 142 bp，長度324 bp，亞硫酸氫鹽修飾后測序(bisulfite sequencing PCR，BSP)法檢測CENP-T啟動子區(qū)CpG島甲基化水平。使用2對測序引物，分別為：1F：TTTGGTTATTGATAGAGAAGG；1R：AATA AAACCTTAAAACCCC；2F：GATAGGGATAAAGTTT TT；2R：AATAAAACCTTAAAACCCC，約需1～2套巢式引物，提取組織樣本DNA，亞硫酸鹽修飾DNA，PCR擴增，回收產(chǎn)物，1個樣本BSP單次產(chǎn)物挑取10個克隆，進行TA克隆測序。

1.4 CENP-T啟動子突變檢測

乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織10例進行CENP-T啟動子突變的檢測，使用染料終止子(Bigdye terminator，BDT)反應的Sanger測序法，BDT反應：10 μL反應體系，依次加入1 μL引物、2～5 μL模板、0～3 μL dH2O和4 μL預配好的Bigdye mix。每種樣品與試劑加入的順序，按照從上到下，或者從左到右的順序依次加入，加完引物、模板、dH2O以及Bigdye mix后，需要將實驗用的反應板進行離心，1 000 r/min離心，PCR反應程序：94℃、5 min；94℃、20 s，55℃、20 s，72℃、90 s 35個循環(huán)；72℃、7 min。然后電泳回收擴增的2 000 bp條帶DNA產(chǎn)物，最后用3對引物1F/1R、2F/2R和3F/3R進行測序。反應引物：1F，CGACATCGCACCACA GCACT；1R，CTTTTTCTCTAGTCAGGACCGT。2F，ATATGCAGGGTCAGTGGCTTT；2R，GGGCACGTAG ATTTCAGACTT。3F，GTTATTTCAAGACCTGTAGA；3R，TATGGTCGGGAACAGGGTGA。

1.5 MCF7細胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染

MCF7細胞用含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，加入100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素，置于CO2體積分數(shù)為5%、濕度95%、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染實驗的細胞：MCF7細胞按每孔2.5×105個接種于6孔板，當細胞匯合度達60%～80%時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參照riboFECTTM說明書進行。siRNA轉(zhuǎn)染分為3組：未轉(zhuǎn)染對照組(NC)、轉(zhuǎn)染陰性對照組(NC siRNA)和 轉(zhuǎn) 染siRNA實 驗 組(CENP-T siRNA)。轉(zhuǎn) 染siRNA實驗組設計3對序列，評估CENP-T siRNA的序列1為5′-GGAGGTATTTGCTGCTCAT-3′，序列2為5′-GGAGGTCAATGCCTTTGCT-3′，序列3為5′-GAA GTTGAGTGGCCAAACA-3′。轉(zhuǎn)染6 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染指示劑進行的轉(zhuǎn)染，判定當前轉(zhuǎn)染條件下細胞的轉(zhuǎn)染效率，確定siRNA轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染后使用含20%胎牛血清無雙抗培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，然后進行CENP-T蛋白表達水平檢測，篩選出敲減CENP-T蛋白表達水平50%以上的特異性siRNA序列，進行細胞增殖能力，細胞周期時相分布以及細胞凋亡率的檢測。

1.6 Western blot法檢測CENP-T蛋白的表達

采用Western blot法檢測乳腺癌組織、癌旁正常乳腺組織及MCF7、MDA-MB-231細胞和轉(zhuǎn)染后細胞中CENP-T和GAPDH蛋白的表達。組織液氮研磨加入裂解液裂解勻漿，超聲破碎，4℃離心20 min取上清液，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，CENT-P一抗4℃過夜孵育(CENP-T工作液稀釋比例均為1∶300；GAPDH為1∶5 000)。二抗(工作液稀釋比例均為1∶5 000)，室溫孵育1 h，Super ECL超敏發(fā)光液，避光作用1 min，采用Amersham Imager600系統(tǒng)進行顯色。

1.7 MTT法檢測細胞活力

MCF7細胞轉(zhuǎn)染24 h后，于96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細胞懸液，每組設3個復孔。siRNA轉(zhuǎn)染MCF7細胞系分別于24、36、48和72 h后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，室溫下培養(yǎng)4 h后，吸棄孔內(nèi)原有培養(yǎng)液，每孔加100 μL DMSO，紫外分光光度計檢測490 nm波長處各孔吸光度值D(490)，以時間為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，分析細胞活力。

1.8 細胞集落形成實驗檢測細胞增殖能力

收獲轉(zhuǎn)染后48 h的CENP-T siRNA組和NC siRNA組細胞接種于6孔板中，每孔接種200個細胞，培養(yǎng)10～14 d，當出現(xiàn)肉眼可見的集落時，終止培養(yǎng)，PBS沖洗3次，甲醇固定15 min，Giemsa染色15 min，清水沖洗掉多余的染液，鏡下計數(shù)，計算集落形成率。集落形成率=集落數(shù)/接種細胞數(shù)×100%，每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.9 流式細胞術(shù)檢測細胞周期及細胞凋亡率

接種2.5×104個MCF7細胞于6孔板中，每個樣本設置3個復孔，采用20%無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染CENP-T siRNA后的MCF7細胞系和NC siRNA組的MCF7細胞系用20%無雙抗培養(yǎng)基置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。將每組細胞制備成單細胞懸液用于檢測細胞周期；加入1 mL預冷的70%乙醇，4℃固定過夜；1 000 g離心5 min，沉淀細胞，加入1 mL預冷PBS，重懸細胞；每管樣本中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，流式細胞儀(FACS Calibur，BD)在激發(fā)光波長488 nm處檢測熒光，同時檢測光散射情況。用于檢測細胞凋亡情況的CENP-T siRNA組和NC siRNA組MCF7細胞用胰酶消化1 min，獲得單細胞懸液，用預冷的PBS洗滌細胞兩次，然后將細胞重懸于1×結(jié)合緩沖液并稀釋濃度至1×106個/mL；取100 μL溶液(1×105個細胞)轉(zhuǎn)移至5 mL培養(yǎng)管中，分別加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI輕輕渦旋細胞，在室溫(25℃)下避光孵育15 min；向每管中加入400 μL的1×結(jié)合緩沖液，在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測分析。

1.10 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。計數(shù)資料用χ2檢驗。計量資料以xˉ±s表示，用t檢驗或方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CENP-T在乳腺癌組織中的蛋白表達水平下調(diào)

采用在線數(shù)據(jù)庫GEPIA檢測CENP-T在乳腺癌組織(n=1 085)和癌旁正常乳腺組織(n=291)中的表達，結(jié)果如圖1A和B所示：與癌旁正常乳腺組織相比，CENP-T在乳腺癌組織的表達顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖1G)。免疫組化的檢測結(jié)果顯示CENP-T在乳腺癌和癌旁正常乳腺組織內(nèi)主要著色于胞核，高倍鏡可觀察到胞核內(nèi)有棕黃色顆粒，胞漿內(nèi)也有部分表達(圖1C～F)。CENP-T在26對乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織中陽性表達率分別為84.62%和92.31%，陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.754，P=0.385)。然而，CENP-T在乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織中的表達程度差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.346；P=0.003)(見圖1，表1)。由此可見，CENP-T在乳腺癌組織細胞和癌旁正常乳腺組織細胞中均表達，只是表達的程度有差異，乳腺癌組織中CENP-T的蛋白表達水平下調(diào)。

圖1 CENP-T蛋白在乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中的表達

表1 CENP-T蛋白在乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織中的表達情況分析(n=26)

2.2 乳腺癌組織中CENP-T基因啟動子甲基化增加且啟動子突變

數(shù)據(jù)庫預測CENP-T甲基化位點。在乳腺癌中CENP-T蛋白表達下調(diào)的組織，匹配癌旁正常乳腺組織進行CENP-T基因啟動子序列PCR產(chǎn)物測序和DNA片段甲基化檢測，見圖2A。CENP-T基因啟動子甲基化檢測結(jié)果顯示：乳腺癌組織CENP-T基因啟動子甲基化程度(15.34±0.01)%，癌旁正常乳腺組織CENP-T基因啟動子甲基化程度(10.26±0.016)%，乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織比，CENP-T基因啟動子甲基化程度增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.567，P=0.002)，見圖2B。啟動子突變情況分析結(jié)果，乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織進行CENP-T啟動子序列PCR產(chǎn)物測序見圖3，將測序結(jié)果進行blast比對，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中2例出現(xiàn)突變，1例組織檢測出啟動子的2個位點堿基突變分別為C1545T、C1628G，另外1例乳腺癌組織啟動子區(qū)C1417T堿基突變。

圖2 Western blot和BSP檢測乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中CENP-T蛋白表達及其基因啟動子CpG島甲基化水平圖

圖3 乳腺癌組織中CENP-T基因啟動子區(qū)突變分析

2.3 敲減CENP-T可能促進乳腺癌MCF7細胞增殖能力

首先，構(gòu)建CENP-T敲減細胞系：如圖4A顯示CENP-T在細胞系中的蛋白表達情況，CENP-T在正常人乳腺細胞系MCF10A中蛋白表達水平高于乳腺癌細胞系MCF7和MDA-MB-231；CENP-T在MCF7細胞系的蛋白質(zhì)表達水平較高而MDA-MB-231無表達，因此以MCF7為靶細胞構(gòu)建CENP-T瞬時敲減細胞系。3種siRNA常規(guī)轉(zhuǎn)染MCF7后，Western blot檢測干擾效率如下圖4B和C。siRNA均能降低CENP-T的表達，其中CENP-T siRNA1的敲減率最高為98%，干擾后CENP-T幾乎不表達，CENP-T siRNA3的敲減率77%，CENP-T siRNA2的敲減率為45%。因此，后續(xù)實驗使用CENP-T siRNA3作為干擾序列觀察表達降低程度對細胞生物學特征的影響。

圖4 CENP-T在3種細胞系的表達及siRNAs序列沉默后的Western blot檢測結(jié)果

MTT實驗檢測細胞增殖能力。為檢測CENP-T對MCF7細胞的生長的作用，將細胞接種于96孔培養(yǎng)板上，設立CENP-T siRNA組和陰性對照siRNA組，連續(xù)培養(yǎng)3 d，計數(shù)結(jié)果按實驗方法中描述的繪制生長曲線如圖5A。CENP-T siRNA組表達下調(diào)促進了MCF7細胞的增殖，統(tǒng)計學分析CENP-T siRNA與NC在24、36、48、72 h的時間點上(t=1.692，P=0.160；t=2.636，P=0.054；t=5.475，P=0.005；t=4.328，P=0.012)。

細胞集落形成實驗檢測細胞增殖能力。陰性對照siRNA、CENP-T siRNA細胞的增殖情況如圖5B和5C所示，CENP-T siRNA組細胞集落形成率為82%，陰性對照siRNA集落形成率為62%，CENP-T siRNA組細胞集落形成率明顯高于另外兩組，與陰性對照siRNA組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，說明，CENP-T siRNA組增殖能力高于陰性對照siRNA組(P＜0.05)。

圖5 敲減CENP-T對MCF7細胞增殖能力的影響

2.4 敲減CENP-T后乳腺癌MCF7細胞G2/M期阻滯

流式細胞儀細胞周期檢測結(jié)果見圖6，結(jié)果顯示CENP-T siRNA組的MCF7細胞G1期細胞占(56.3+0.3)%，S期和G2/M期細胞分別占(30.8+0.8)%和(12.9+0.5)%。陰性對照siRNA組的MCF7細胞G1期細胞占(59.1±1.5)%，S期和G2/M期細胞分別占(31.6±0.8)%和(9.4±0.7)%(如圖6所示)。敲減CENP-T后的G1期細胞百分率減少了2.78%，S期細胞百分率下降了0.78%，G2/M期細胞百分率增加了3.45%(P＜0.01)。與陰性對照siRNA組相比，CENP-T siRNA組細胞的G2/M期明顯延長，S期的細胞數(shù)目幾乎無變化。

圖6 流式細胞術(shù)檢測敲減CENP-T后MCF7細胞周期時相分布圖

2.5 敲減CENP-T可能抑制乳腺癌MCF7細胞凋亡

利用流式細胞術(shù)檢測48 h各組細胞凋亡率，如圖7所示，CENP-T siRNA的總凋亡率為(0.12±0.11)%，與陰性對照siRNA組相比，t=24.68，P＜0.01，發(fā)生明顯抑制。

圖7 流式細胞術(shù)檢測敲減CENP-T后MCF7細胞凋亡率

CENP-T siRNA組的早期凋亡率為(0.10±0.01)%，與陰性對照siRNA組的(0.70±0.03)%相比，凋亡率降低，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(t=30.6，P＜0.01)，CENP-T表達下調(diào)抑制細胞凋亡形成。

3 討論

著絲粒是保證染色體穩(wěn)定存在，保證細胞正常分裂的基本結(jié)構(gòu)和功能元件之一。著絲粒蛋白家族有很多成員，其中哺乳類細胞中著絲粒蛋白的數(shù)目預計超過100，大多數(shù)命名為著絲粒蛋白，這些蛋白有的參與構(gòu)成著絲粒，有的參與著絲粒發(fā)揮功能過程中的調(diào)控[4]。

早在1980年，F(xiàn)ritzler等[5]首先在硬皮病患者的血漿中發(fā)現(xiàn)了與著絲粒上不同的蛋白結(jié)合抗體，該發(fā)現(xiàn)促進了著絲粒蛋白的研究。CENP-T作為著絲粒蛋白成員之一，CENP-T的研究目前集中在其正常生物學結(jié)構(gòu)和功能上。人類CENP-T基因位于染色體16q22.1，共由17個外顯子組成。Hellwig等[6]用熒光顯微鏡技術(shù)分析內(nèi)部動粒蛋白CENP-T在活人類細胞中動力學變化。著絲點是染色體分離所必需的，它是通過包含許多著絲點蛋白的動態(tài)過程組裝起來的。CENP-T是一種內(nèi)部的著絲點蛋白，在有絲分裂期間為外部著絲點Ndc80復合物的組裝提供平臺，確保了在有絲分裂過程中精確的著絲粒組裝[7-9]。著絲點組裝是由CENP-A啟動的，它與內(nèi)部著絲點組成的著絲點相關網(wǎng)絡(CCAN)的組成成分發(fā)生物理相互作用，CENP-T也是組裝必須的[10]。缺乏CENP-T、CENP-A引起分裂后期滯后和分離錯誤[11]。著絲粒蛋白A(CENP-A)通過組成CENP-T復合體的著絲粒相關網(wǎng)絡來組織功能性的著絲粒。CENP-T可以直接與Holliday連接識別蛋白(HJURP)結(jié)合，通過時間調(diào)控的HJURP-CENP-T相互作用將CENP-T組裝到著絲粒上[12]。Thakur報道[13]，亞鐵還原能力實驗揭示了CENP-T在S期與著絲粒DNA結(jié)合，CENP-T獨立連接著絲粒α衛(wèi)星重復序列-171 bp到外部動粒。Rago等[14]報道在著絲粒區(qū)域，CENP-T/CENP-W是CCAN上游調(diào)控分子，直接參與的著絲粒染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。而Hori等[15]實驗進一步證明，CENP-A和H3-CENP-T/W著絲粒蛋白復合體在調(diào)節(jié)著絲粒的構(gòu)成和動粒活動具有特異性，使細胞可以在染色質(zhì)構(gòu)型之間切換，從而相互支持著絲粒的復制，并將著絲粒轉(zhuǎn)化為有絲分裂的狀態(tài)[16]。敲減CENP-T增加了CDH1(FZR1)的水平，導致(APC)-CDH1復合體的活性增加，抑制CCNB1水平，最終影響減數(shù)分裂[17]。多能干細胞(PSCs維持著豐富的CENP-A、CENP-C和CENP-T，但這些重要的著絲粒成分在干細胞著絲粒上顯著減少[18]。

目前，已經(jīng)報道著絲粒蛋白許多重要成員在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，例如Athwal、Arimura等[19-20]報道CENP-A基因過表達狀態(tài)影響基因的調(diào)控，影響染色質(zhì)的脆性，而致惡性腫瘤的發(fā)生。研究人員在宮頸癌、胃癌[21-22]中也發(fā)現(xiàn)CENP-H的高表達，且與預后相關；CENP-W在膠質(zhì)瘤組織中普遍高表達，對細胞的增殖侵襲有促進作用[23]，CENP-F表達與宮頸癌鱗狀細胞癌正相關[24]，而CENP-T與腫瘤相關文獻報道僅有1篇[25]。因此我們以CENP-T為靶點，探討其在腫瘤中的作用及機制。

本實驗采用免疫組織化學法研究CENP-T在乳腺癌的表達。實驗結(jié)果顯示乳腺癌中CENP-T的蛋白水平較癌旁正常乳腺組織蛋白表達水平顯著下降(P＜0.01)。這個結(jié)果與利用在線工具http://gepia.cancerpku.cn/檢索結(jié)果一致，并且該數(shù)據(jù)庫顯示CENP-T在其他腫瘤中也有相同的表達水平下調(diào)的情況。為進一步分析CENP-T在乳腺癌低表達的原因，本研究利用RNA敲減技術(shù)構(gòu)建降低CENP-T表達的細胞系，探討CENP-T對腫瘤周期，細胞增殖以及細胞凋亡的影響，與對照組MCF7細胞比較，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲減CENP-T基因表達后，G1期細胞所占比例略有降低，S期細胞所占比例不變，G2/M期細胞所占比例明顯升高(P＜0.01)，同時，CENP-T基因表達減少率為77%后，當CENP-T敲減36 h時，MCF7細胞的增殖活性出現(xiàn)明顯增高(P＜0.005)，集落形成能力增強(P＜0.01)；表明CENP-T表達下調(diào)可能促進乳腺癌細胞增殖能力?？梢奀ENP-T表達下調(diào)通過干擾遺傳物質(zhì)的分配促進細胞的增殖。CENP-T siRNA轉(zhuǎn)染后，細胞系中發(fā)生凋亡的細胞比例顯著低于siRNA陰性對照組細胞(P＜0.01)；說明CENP-T表達下調(diào)可抑制乳腺癌細胞發(fā)生凋亡。

以上結(jié)果與已經(jīng)報道CENPs在腫瘤中過表達相悖[21-24]，可能因為CENP-T在細胞中具有其他著絲粒蛋白家族不同的特點。雖然腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在遺傳物質(zhì)的不穩(wěn)定性分配，但CENPs仍然是一個完整復合結(jié)構(gòu)，在出現(xiàn)異常表達時各種CENPs作用調(diào)控不同的信號途徑。因此，我們進一步對CENP-T啟動子區(qū)的序列測序以及甲基化水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)CENP-T啟動子區(qū)甲基化水平增加49.5%，并在過表達的乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)C1417T、C1545T、C1628G，3個位點兩種形式堿基突變，進一步以生物信息學篩選出與CENP-T密切相關的轉(zhuǎn)錄因子，以解釋CENP-T表達下調(diào)的分子機制，發(fā)現(xiàn)1545C是轉(zhuǎn)錄因子PR B，PR A結(jié)合位點，1628C、1417C是轉(zhuǎn)錄因子C/EBP BETA為結(jié)合位點。本研究只是發(fā)現(xiàn)了CENP-T啟動子區(qū)甲基化水平變化及突變，要證實這個啟動子區(qū)突變和CENP-T表達水平之間存在因果關系，還需要更多的實驗來支持。

綜上所述，CENP-T在乳腺癌表達下調(diào)，下調(diào)與啟動子區(qū)的序列甲基化修飾及突變密切相關。敲減CENP-T基因表達致增殖指數(shù)增加，促進細胞分裂進行，增強乳腺癌MCF7細胞增殖能力，抑制細胞凋亡。啟動子區(qū)的改變在乳腺癌中CENP-T表達下調(diào)的促癌細胞特征，究竟是何機制，還存在哪些信號分子作用改變腫瘤細胞的生物學行為，促進癌發(fā)生有待進一步研究。