• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    長鏈非編碼RNA RUNX1-IT1通過靶向miR-21對結(jié)直腸癌細胞遷移和侵襲的影響

    2022-10-09 08:47:08王勝杰武雪亮張迎春
    癌變·畸變·突變 2022年5期
    關(guān)鍵詞:可抑制熒光素酶細胞系

    梁 峰,張 瑋,王勝杰,武雪亮,岳 磊,張迎春,*

    (1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科,河北張家口 075000;2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院小兒外科,河北 張家口075000)

    結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是中國常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢[1]。盡管結(jié)直腸癌的診斷與治療已經(jīng)取得了顯著進步,但其療效及預(yù)后仍不容樂觀[2]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是指長度大于200 nt的非編碼RNA,其在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用,廣泛參與調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等多種生物學(xué)過程,這為腫瘤的早期診斷和靶向治療提供了新的研究方向[3-6]。LncRNA RUNX1-IT1是新發(fā)現(xiàn)的一種非編碼RNA,關(guān)于lncRNA RUNX1-IT1在惡性腫瘤中的報道[7]不多,且經(jīng)IntaRNA 2.0軟件分析預(yù)測miR-21為lncRNA RUNX1-IT1作用靶點,但lncRNA RUNX1-IT1/miR-21調(diào)控軸對結(jié)直腸癌細胞的作用未見報道?;诖耍狙芯刻接憀ncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織和人結(jié)直腸癌細胞系中的表達情況,并分析其對結(jié)直腸癌細胞惡性生物學(xué)行為的影響及其與miR-21的調(diào)控關(guān)系,以期為結(jié)直腸癌的臨床診斷和治療提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象

    選取2017年1月—2019年1月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院接受根治性手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標本62例及其相應(yīng)的癌旁正常組織標本(距離癌組織邊緣>5 cm)62例。結(jié)直腸癌患者發(fā)病年齡在37~86歲,男37例,女25例;其中結(jié)腸癌患者33例,直腸癌患者29例。所有納入患者的臨床資料均完整,本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(2021177),所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。納入標準:①術(shù)后病理確診為結(jié)直腸癌;②患者術(shù)前未接受過介入、放化療及免疫治療;③既往無其他腫瘤病史。排除標準:①伴有嚴重心、肝、腎功能異常者;②伴有其他惡性腫瘤;③術(shù)前行放化療或免疫治療等的患者。

    1.2 細胞與試劑

    人結(jié)直腸癌細胞系(SW480、SW620、HCT-116)和人正常結(jié)直腸上皮細胞系(FHC)均購自北納生物。RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司,雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)購自美國Promega公司,TRIzol試劑盒、LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司,SYBR qPCR Master Mix和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMRT Reagent Kit)購自寶生物工程(大連)有限公司。

    RUNX1-IT1過表達質(zhì)粒(pcDNA-RUNX1-IT1)及陰性對照質(zhì)粒(pcDNA-control),miR-21抑制(anti-miR-21)及陰性對照(anti-miR-con)、miR-21過表達(miR-21 mimic)及陰性對照(mimic-NC)序列均由吉滿生物科技有限公司設(shè)計合成。

    1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

    FHC細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,結(jié)直腸癌SW480、SW620和HCT116細胞用含有10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng),分別放置在37℃、CO2體積分數(shù)為5%恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。將SW480細胞以1×105個/孔接種至6孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng),待細胞生長至80%左右進行細胞轉(zhuǎn)染,SW480細胞轉(zhuǎn)染前1 h更換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染分為過表達(pcDNAcontrol、pcDNA-RUNX1-IT1)和抑制表達(pcDNARUNX1-IT1、pcDNA-RUNX1-IT1+anti-miR-con、pcDNA-RUNX1-IT1+miR-21)兩種方案分組;按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作,轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測過表達/干擾效果。

    1.4 實時熒光定量PCR檢測RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達

    使用TRIzol試劑提取組織總RNA,超微量紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以1 μL cDNA為模板,按照實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)試劑盒說明書進行PCR擴增。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,59℃退火30 s,72℃延伸90 s,40個循環(huán);最后72℃延伸5 min。以GAPDH和U6作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計算RUNX1-IT1和miR-21的相對表達。引物序列如下:RUNX1-IT1上 游 引 物,5′-CCTACTTCTGCACGATGTGA TG-3′,下游引物,5′-CCTTTGCTACGGTTGGTTACA TT-3′;miR-21上游引物,5′-TTGAATTCTAACACC TTCGTGGCTACAGAG-3′,下游引物,5′-TTAGATC TCATTTATCGAGGGAAGGATTG-3′。

    1.5 雙熒光素酶報告實驗

    采用IntaRNA 2.0(http://rna.informatik.uni-freiburg.de/IntaRNA/Input.jsp)軟件預(yù)測RUNX1-IT1與miR-21間的靶向結(jié)合序列,分別設(shè)計合成RUNX1-IT1的野生型(WT)和突變型(MUT)結(jié)合位點序列并整合至pGL3載體構(gòu)建報告基因質(zhì)粒(RUNX1-IT1-WT和RUNX1-IT1-MUT),并將其加載到pMIR-GLO?熒光素酶載體中。將SW480細胞以1×105個/孔接種在12孔板中培養(yǎng),并通過Lipofectamine 2000將含有RUNX1-IT1-WT或RUNX1-IT1-MUT和miR-21 mimic以 及miRNC的載體轉(zhuǎn)染到SW480細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后,再根據(jù)雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒說明書進行螢火蟲熒光素酶活性檢測。

    1.6 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力

    1.6.1 遷移實驗收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對數(shù)生長期的SW480細胞,在Transwell上層小室加入稀釋后的SW480細胞(1×l06個/mL),下室加入含10% FBS的細胞培養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)24 h,取出上室,去除上層小室未遷移的細胞,用70%甲醛固定30 min,結(jié)晶紫染色拍照,顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

    1.6.2 侵襲實驗將-20℃取出的Matrigel置4℃冰箱過夜液化,4℃無血清培養(yǎng)基按1∶5比例稀釋Matrigel后,取100 μL加入到Transwell小室中,37℃使其凝固,按照遷移實驗進行后續(xù)操作。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析,符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料以xˉ±s表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差及兩兩比較LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。lncRNA RUNX1-IT1和miR-21在結(jié)直腸癌組織中表達的相關(guān)性采用Pearson檢驗分析。

    2 結(jié)果

    2.1 RUNX1-IT1和miR-21在結(jié)直腸癌組織和結(jié)直腸癌細胞系中的表達情況

    qPCR檢測結(jié)果表明lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織中的相對表達水平(3.323±0.150)顯著低于癌旁組織(4.372±0.166);miR-21在結(jié)直腸癌組織中的相對表達水平(3.839±0.160)顯著高于癌旁組織(3.052±0.141),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01,圖1A和B)。LncRNA RUNX1-IT1和miR-21在結(jié)直腸癌組織中的表達呈負相關(guān)(r=-0.275,P=0.031,圖1C)。此外,lncRNA RUNX1-IT1在3種結(jié)直腸癌細胞系(SW480、SW620、HCT-116)中的表達水平均顯著低于正常結(jié)直腸FHC細胞(均為P<0.05,圖1D),而miR-21在上述3種結(jié)直腸癌細胞系中的表達水平明顯高于FHC細胞(均為P<0.05,圖1E),SW480細胞最明顯,故后續(xù)細胞系實驗均采用SW480細胞。上述結(jié)果也表明lncRNA RUNX1-IT1低表達和miR-21高表達可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

    圖1 RUNX1-IT1和miR-21在結(jié)直腸癌組織和細胞系中的表達

    2.2 上調(diào)lncRNA RUNX1-IT1表達抑制SW480細胞的侵襲和遷移能力

    與轉(zhuǎn)染pcDNA-control對照組相比,轉(zhuǎn)染pcDNARUNX1-IT1質(zhì)粒組SW480細胞中l(wèi)ncRNA RUNX1-IT1表達水平明顯升高(t=6.347,P=0.003),見圖2A。Transwell侵襲和遷移實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNARUNX1-IT1質(zhì)粒組的侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均明顯少于轉(zhuǎn)染對照組(侵襲實驗:t=12.49,P<0.01;遷移實驗:t=5.764,P=0.005),見圖2B。結(jié)果表明上調(diào)lncRNA RUNX1-IT1的表達可抑制SW480細胞侵襲和遷移能力。

    圖2 上調(diào)RUNX1-IT1表達對SW480細胞侵襲和遷移能力的影響

    2.3 lncRNA RUNX1-IT1和miR-21間 存 在 靶 向關(guān)系

    通過IntaRNA 2.0預(yù)測到lncRNA RUNX1-IT1與miR-21之間存在靶向結(jié)合位點(圖3A)。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染mimic陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染miR-21 mimic即過表達miR-21組lncRNA RUNX1-IT1 WT(野生型)的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05),而lncRNA RUNX1-IT1 MUT(突變型)熒光素酶活性無明顯變化(圖3B)。qPCR檢測結(jié)果表明,與轉(zhuǎn)染pcDNAcontrol組(1.003±0.095)相比,在轉(zhuǎn)染pcDNA-RUNX1-IT1質(zhì)粒后,miR-21表達水平在SW480細胞中的明顯下降(0.293±0.020),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.289,P=0.002)。上述結(jié)果表明miR-21能夠靶向結(jié)合lncRNA RUNX1-IT1。

    圖3 雙熒光素酶報告實驗驗證lncRNA RUNX1-IT1與miR-21間的靶向關(guān)系

    2.4 抑制miR-21表達可抑制SW480細胞的侵襲和遷移能力

    qPCR檢測結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染anti-miR-con對照組相比,轉(zhuǎn)染anti-miR-21組后SW480細胞中miR-21表達 水 平 顯 著 降 低(t=6.80,P=0.002),見 圖4A。Transwell侵襲和遷移實驗結(jié)果顯示,anti-miR-21組的侵襲和遷移細胞數(shù)均明顯低于對照組(侵襲實驗:t=16.360,P<0.01;遷移實驗:t=7.096,P=0.002),見圖4B,表明miR-21表達下調(diào)可抑制SW480細胞的侵襲和遷移能力。

    圖4 下調(diào)miR-21表達對SW480細胞侵襲和遷移能力的影響

    2.5 過表達miR-21逆轉(zhuǎn)RUNX1-IT1對SW480細胞侵襲和遷移能力的抑制作用

    qPCR檢測結(jié)果(圖5A)顯示,與轉(zhuǎn)染miR-con對照組比較,轉(zhuǎn)染miR-21過表達組SW480細胞中miR-21表達水平顯著升高(t=12.01,P<0.01)。為確認lncRNA RUNX1-IT1是否通過miR-21調(diào)控SW480細胞的侵襲和遷移,我們上調(diào)RUNX1-IT1的表達同時過表達miR-21。結(jié)果(圖5B)顯示,與轉(zhuǎn)染pcDNA-RUNX1-IT1+miR-con相比,共轉(zhuǎn)染pcDNA-RUNX1-IT1+miR-21組中細胞侵襲和遷移細胞數(shù)均顯著升高(均為P<0.05)(侵襲實驗:t=23.860,P<0.01;遷移實驗:t=11.020,P<0.01)。上述結(jié)果表明過表達miR-21可逆轉(zhuǎn)lncRNA RUNX1-IT1表達上調(diào)對SW480細胞侵襲和遷移能力的抑制作用。

    圖5 過表達miR-21逆轉(zhuǎn)RUNX1-IT1對SW480細胞侵襲和遷移能力的抑制作用

    3 討論

    結(jié)直腸癌早期癥狀隱匿,患者就診時大多處于中晚期,治療難度較大,盡管結(jié)直腸癌的診斷與治療已經(jīng)取得了顯著進步,但其療效及預(yù)后仍不容樂觀[8-10]。因此,探尋可靠的生物標志物對于結(jié)直腸癌患者的早期診斷、治療以及改善預(yù)后至關(guān)重要[11]。越來越多的證據(jù)表明,lncRNA異常表達與腫瘤發(fā)生、進展和預(yù)后不良有關(guān),可作為腫瘤早期診斷的新型生物標志物[12-13]。

    LncRNA RUNX1-IT1是轉(zhuǎn)錄因子RUNX1的內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本,也稱為21號染色體開放閱讀框96(C21orF96)。盡管RUNX1的功能已在不同疾病中得到證實,但lncRNA RUNX1-IT1在多種腫瘤中的功能及其潛在機制仍不清楚[14]。有關(guān)LncRNA RUNX1-IT1在腫瘤中的相關(guān)研究報道不多,并且研究結(jié)論存在不一致情況。lncRNARUNX1-IT1在子宮內(nèi)膜癌中表達下調(diào),并通過抑制miR-21表達來抑制癌細胞的增殖[15]。過表達lncRNA RUNX1-IT1可顯著抑制肺癌細胞增殖、克隆形成和侵襲能力,而lncRNA RUNX1-IT1的敲除則產(chǎn)生相反的效果[16]。Shi等[7]研究顯示lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織和細胞系中表達均下調(diào),過表達lncRNA RUNX1-IT1可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和遷移能力,而敲除lncRNA RUNX1-IT1則反之。LncRNA RUNX1-IT1在肝細胞癌組織中表達降低,并與臨床病理特征和不良預(yù)后相關(guān)。機制研究表明RUNX1-IT1直接與miR-632結(jié)合,并作為競爭性內(nèi)源性RNA促進miR-632靶基因GSK-3β的表達,調(diào)控WNT/β-catenin,進而抑制肝癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移和干細胞樣特征[17]。Yan等[18]研究也發(fā)現(xiàn)肝癌組織中l(wèi)ncRNA RUNX1-IT1的表達水平顯著降低。過表達lncRNA RUNX1-IT1可顯著抑制肝癌細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。然而,與上述結(jié)論截然相反的是,Wu等[19]研究證實RUNX1-IT1在膠質(zhì)母細胞瘤組織中表達上調(diào),過表達RUNX1-IT1可明顯上調(diào)細胞周期蛋白D1的表達,并促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖。本研究結(jié)果表明lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織及細胞中低表達,過表達lncRNA RUNX1-IT1可抑制SW480細胞侵襲和遷移能力,與Shi等[7]的結(jié)論相一致。說明lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌的進展過程中發(fā)揮癌基因功能。

    較多研究證實miR-21在多種實體腫瘤中表達異常,是一個潛在的腫瘤治療靶點和早期標志物[20]。miR-21在宮頸癌組織和血清樣本中表達上調(diào),而組織金屬蛋白酶抑制因子3(Tissue metalloproteinase inhibitor 3,TIMP3)在宮頸癌組織中表達下調(diào);miR-21通過靶向TIMP3促進宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[21]。miR-21在胃癌中表達明顯上調(diào),與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),可能是胃癌的預(yù)后標志物[22]。miR-21在非小細胞肺癌(NSCLC)中高表達,干擾miR-21表達可抑制細胞周期蛋白D1和E1的表達,并協(xié)同抑制癌細胞的增殖能力,且miR-21通過PTEN/Akt/GSK-3β信號通路中的關(guān)鍵分子來調(diào)控NSCLC增殖[23]。本研究結(jié)果表明,miR-21在結(jié)直腸癌組織及細胞中表達均明顯升高,抑制miR-21表達可抑制SW480細胞的侵襲和遷移能力;通過生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報告實驗結(jié)果證實lncRNA RUNX1-IT1和miR-21存在靶向結(jié)合位點。由此我們推測,lncRNA RUNX1-IT1可能作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)吸附靶向調(diào)控miR-21表達,進而影響結(jié)直腸癌的侵襲和遷移。并且在進一步的回復(fù)實驗中驗證了這一猜想,在lncRNA RUNX1-IT1過表達同時上調(diào)miR-21的表達,發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-21表達可逆轉(zhuǎn)過表達lncRNA RUNX1-IT1對SW480細胞侵襲和遷移的抑制作用。

    綜上所述,lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織和細胞系中表達下調(diào),lncRNA RUNX1-IT1低表達通過靶向上調(diào)miR-21表達調(diào)控SW480細胞侵襲和遷移,這意味著lncRNA RUNX1-IT1有可能成為結(jié)直腸癌的分子治療靶點,其在體內(nèi)的具體作用及分子機制還有待進一步研究。

    猜你喜歡
    可抑制熒光素酶細胞系
    熱量限制飲食或可抑制腫瘤生長
    中老年保健(2022年3期)2022-11-21 09:40:36
    PC化合物可抑制汽車內(nèi)飾中的BSR噪聲
    NNMT基因啟動子雙熒光素酶報告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗證
    不同雙熒光素酶方法對檢測胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    重組雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達
    可抑制毛刺的鉆頭結(jié)構(gòu)
    STAT3對人肝內(nèi)膽管癌細胞系增殖與凋亡的影響
    抑制miR-31表達對胰腺癌Panc-1細胞系遷移和侵襲的影響及可能機制
    人多巴胺D2基因啟動子區(qū)—350A/G多態(tài)位點熒光素酶表達載體的構(gòu)建與鑒定及活性檢測
    E3泛素連接酶對卵巢癌細胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響
    啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 少妇丰满av| 91久久精品国产一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 中文字幕制服av| 日本一本二区三区精品| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 此物有八面人人有两片| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 黄色视频,在线免费观看| 国国产精品蜜臀av免费| 国产精品三级大全| 久久精品影院6| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 免费av毛片视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 一本一本综合久久| 美女 人体艺术 gogo| av视频在线观看入口| 青春草亚洲视频在线观看| 综合色丁香网| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲av成人av| 久久久久久大精品| 深爱激情五月婷婷| 久久久久久国产a免费观看| 高清日韩中文字幕在线| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 日韩av不卡免费在线播放| 日韩精品有码人妻一区| av在线天堂中文字幕| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产淫片久久久久久久久| 免费在线观看成人毛片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 赤兔流量卡办理| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产高清视频在线观看网站| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品电影一区二区三区| 久久精品人妻少妇| 免费大片18禁| 国产精品伦人一区二区| 搞女人的毛片| 成人国产麻豆网| 国产成人a∨麻豆精品| 高清毛片免费看| 黄色配什么色好看| 国产成人91sexporn| 亚洲高清免费不卡视频| 成人综合一区亚洲| 国产极品天堂在线| 国产精品精品国产色婷婷| 人妻系列 视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| eeuss影院久久| 欧美zozozo另类| 老司机福利观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 我的女老师完整版在线观看| 国产真实乱freesex| 欧美潮喷喷水| 亚洲国产精品sss在线观看| 天美传媒精品一区二区| 亚洲第一电影网av| 成人毛片60女人毛片免费| 床上黄色一级片| 国产片特级美女逼逼视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 三级国产精品欧美在线观看| 精品久久久久久久久av| 美女高潮的动态| 日韩国内少妇激情av| eeuss影院久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 插阴视频在线观看视频| 精品不卡国产一区二区三区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久鲁丝午夜福利片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 观看美女的网站| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品国产高清国产av| 婷婷六月久久综合丁香| 性色avwww在线观看| 国产高清三级在线| 成人毛片60女人毛片免费| 丰满乱子伦码专区| 精品日产1卡2卡| 免费无遮挡裸体视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 能在线免费看毛片的网站| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产高潮美女av| 久久久久久国产a免费观看| 国产日本99.免费观看| 内射极品少妇av片p| avwww免费| 插阴视频在线观看视频| kizo精华| 精品一区二区免费观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产午夜精品一二区理论片| 国产成人freesex在线| 国产精华一区二区三区| 久99久视频精品免费| 久久久久久久久久久丰满| 看片在线看免费视频| 在线a可以看的网站| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美一区二区亚洲| 亚洲成人久久爱视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 好男人视频免费观看在线| 午夜亚洲福利在线播放| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久久性生活片| 久久精品国产亚洲av天美| 黄色欧美视频在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产高清视频在线观看网站| 午夜亚洲福利在线播放| 美女cb高潮喷水在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美成人免费av一区二区三区| 天堂网av新在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 2022亚洲国产成人精品| 美女黄网站色视频| а√天堂www在线а√下载| 日本欧美国产在线视频| 99久久精品国产国产毛片| 能在线免费观看的黄片| 欧美色欧美亚洲另类二区| 级片在线观看| 看黄色毛片网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 成年版毛片免费区| 精品一区二区三区人妻视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 午夜视频国产福利| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产成人91sexporn| 国产成人福利小说| 久久综合国产亚洲精品| 韩国av在线不卡| 男人狂女人下面高潮的视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日本成人三级电影网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品久久久久久久久av| 欧美成人a在线观看| 亚洲人成网站在线播| 国产探花极品一区二区| 欧美人与善性xxx| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 黄色日韩在线| 在线观看av片永久免费下载| 日日撸夜夜添| 床上黄色一级片| 毛片一级片免费看久久久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 中文在线观看免费www的网站| 欧美三级亚洲精品| 欧美日韩乱码在线| 亚洲第一电影网av| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 嫩草影院新地址| 午夜免费激情av| 国产成人aa在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| av在线亚洲专区| 我的老师免费观看完整版| 国产成人91sexporn| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 中文字幕免费在线视频6| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久人人爽人人片av| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品.久久久| 亚洲国产精品sss在线观看| 少妇的逼好多水| 国产精品久久久久久av不卡| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久久欧美国产精品| 永久网站在线| 少妇的逼好多水| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩中字成人| 国产日本99.免费观看| 国产老妇女一区| 综合色av麻豆| 99热这里只有是精品50| av免费观看日本| 好男人在线观看高清免费视频| 国产伦在线观看视频一区| 丰满的人妻完整版| 精品日产1卡2卡| 22中文网久久字幕| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 中文资源天堂在线| 麻豆国产97在线/欧美| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久午夜福利片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲av男天堂| 欧美成人精品欧美一级黄| 麻豆久久精品国产亚洲av| 最近中文字幕高清免费大全6| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产一区二区在线观看日韩| 一级黄片播放器| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 淫秽高清视频在线观看| 久久久精品大字幕| 久久精品国产清高在天天线| 老司机福利观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 夜夜爽天天搞| 搞女人的毛片| 变态另类丝袜制服| 97超视频在线观看视频| 一级黄片播放器| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久久久久中文| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 少妇熟女欧美另类| 一区二区三区高清视频在线| 一级毛片我不卡| 伦精品一区二区三区| 精品午夜福利在线看| 老司机福利观看| 男人舔奶头视频| 高清毛片免费观看视频网站| 成年版毛片免费区| 一区二区三区四区激情视频 | 久久久成人免费电影| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲第一区二区三区不卡| av视频在线观看入口| 午夜视频国产福利| 九色成人免费人妻av| 中文字幕免费在线视频6| 蜜臀久久99精品久久宅男| 男插女下体视频免费在线播放| 不卡视频在线观看欧美| 一级毛片电影观看 | 18+在线观看网站| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 18禁黄网站禁片免费观看直播| 成人av在线播放网站| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 日韩在线高清观看一区二区三区| 变态另类丝袜制服| 天堂网av新在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 又爽又黄无遮挡网站| 日韩人妻高清精品专区| 性色avwww在线观看| 看免费成人av毛片| 在线观看美女被高潮喷水网站| 免费观看精品视频网站| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 在线播放国产精品三级| 久久这里只有精品中国| 亚洲精品456在线播放app| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 午夜福利视频1000在线观看| 在线天堂最新版资源| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲欧美成人精品一区二区| 成人特级av手机在线观看| 国产成人a区在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 男人狂女人下面高潮的视频| 黄片无遮挡物在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 久久国产乱子免费精品| 成年免费大片在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 成人av在线播放网站| 亚洲电影在线观看av| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| av福利片在线观看| 嫩草影院入口| 亚洲色图av天堂| 欧美性感艳星| 日韩成人伦理影院| av在线天堂中文字幕| 午夜视频国产福利| 麻豆国产97在线/欧美| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 看非洲黑人一级黄片| 少妇人妻精品综合一区二区 | 在线观看午夜福利视频| av福利片在线观看| 午夜老司机福利剧场| 色综合色国产| 欧美在线一区亚洲| 伦理电影大哥的女人| 一夜夜www| 91狼人影院| 97在线视频观看| 久久久精品大字幕| 长腿黑丝高跟| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 美女黄网站色视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产高清视频在线观看网站| 免费观看精品视频网站| 床上黄色一级片| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产成人福利小说| 午夜视频国产福利| 国产精品爽爽va在线观看网站| 日韩一区二区视频免费看| 深夜精品福利| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲自偷自拍三级| 久久人妻av系列| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 精品久久久久久成人av| 99久久精品热视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 爱豆传媒免费全集在线观看| 男女那种视频在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产色婷婷99| 国产一区二区激情短视频| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中文字幕av在线有码专区| 国国产精品蜜臀av免费| 97超碰精品成人国产| 久久久久久久午夜电影| 久久亚洲国产成人精品v| or卡值多少钱| 国产伦一二天堂av在线观看| 日本免费a在线| 中文资源天堂在线| 一夜夜www| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 黄色日韩在线| 最近手机中文字幕大全| 我的老师免费观看完整版| 欧美色视频一区免费| 国产精品一区二区性色av| 老司机影院成人| 麻豆久久精品国产亚洲av| 久久久久网色| ponron亚洲| 简卡轻食公司| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费看a级黄色片| 国产精品一二三区在线看| 最好的美女福利视频网| 国产一级毛片在线| 亚洲美女视频黄频| 真实男女啪啪啪动态图| 九色成人免费人妻av| av专区在线播放| 有码 亚洲区| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品日韩av在线免费观看| a级一级毛片免费在线观看| 亚洲内射少妇av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 黄色视频,在线免费观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美在线一区亚洲| 在线天堂最新版资源| 亚洲最大成人手机在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 波多野结衣高清无吗| 免费在线观看成人毛片| 亚洲精品成人久久久久久| 人妻久久中文字幕网| 热99在线观看视频| 久久人妻av系列| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 中文字幕久久专区| 舔av片在线| 欧美+日韩+精品| 一夜夜www| 亚洲,欧美,日韩| 国产一区二区在线av高清观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 中国美女看黄片| 在线国产一区二区在线| 国产不卡一卡二| 99热只有精品国产| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲精品自拍成人| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 只有这里有精品99| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 丰满的人妻完整版| 天堂网av新在线| 有码 亚洲区| 97超碰精品成人国产| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 91久久精品国产一区二区成人| 国产黄片美女视频| 国产成人影院久久av| 身体一侧抽搐| 少妇人妻精品综合一区二区 | 嫩草影院新地址| 亚洲国产精品合色在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产老妇女一区| 国产精华一区二区三区| 国产三级中文精品| 成熟少妇高潮喷水视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 国产亚洲精品久久久com| 成人综合一区亚洲| 最新中文字幕久久久久| 国产中年淑女户外野战色| av福利片在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品野战在线观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 一本久久精品| 一个人看视频在线观看www免费| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久久久久久久中文| 91麻豆精品激情在线观看国产| 秋霞在线观看毛片| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美最黄视频在线播放免费| 日日啪夜夜撸| 一本久久精品| 91久久精品电影网| 女人被狂操c到高潮| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 天堂网av新在线| 亚洲最大成人av| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 久久久a久久爽久久v久久| 国产av不卡久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲18禁久久av| 欧美变态另类bdsm刘玥| 99国产精品一区二区蜜桃av| 日本黄色视频三级网站网址| 一级黄片播放器| 看非洲黑人一级黄片| 久久人妻av系列| 综合色av麻豆| 一个人看的www免费观看视频| 日韩亚洲欧美综合| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日本三级黄在线观看| 亚洲av成人av| 日韩国内少妇激情av| 国产成人影院久久av| 大型黄色视频在线免费观看| 中出人妻视频一区二区| 97超视频在线观看视频| 中文资源天堂在线| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产亚洲91精品色在线| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 男女那种视频在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品1区2区在线观看.| 好男人在线观看高清免费视频| 国产黄片视频在线免费观看| 在线观看免费视频日本深夜| 99热全是精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 欧美一区二区精品小视频在线| 一级av片app| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 免费av观看视频| 夜夜爽天天搞| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品日产1卡2卡| 波多野结衣高清作品| 亚洲无线观看免费| 一本久久中文字幕| 国产三级在线视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 97在线视频观看| 伦理电影大哥的女人| 亚洲国产色片| 精品久久久久久久久亚洲| 精品久久久噜噜| 日本免费a在线| 精品不卡国产一区二区三区| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲综合色惰| 中国美白少妇内射xxxbb| 国模一区二区三区四区视频| 午夜福利在线在线| 一本精品99久久精品77| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲成人av在线免费| 秋霞在线观看毛片| 国产精品一及| 国产成人一区二区在线| 给我免费播放毛片高清在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 天堂影院成人在线观看| 欧美性感艳星| 天堂中文最新版在线下载 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品久久久久久久久免| 国产男人的电影天堂91| 亚洲在久久综合| 久久九九热精品免费| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 综合色丁香网| 国产一级毛片七仙女欲春2| 免费看日本二区| 国产亚洲91精品色在线| 国产精品国产高清国产av| 国产人妻一区二区三区在| 国内揄拍国产精品人妻在线| 99久久精品一区二区三区| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美一区二区精品小视频在线| 成年av动漫网址| 久久久久久大精品| 九九在线视频观看精品| 女人被狂操c到高潮| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久久久国产网址| 一进一出抽搐动态| 婷婷六月久久综合丁香| 国产亚洲精品av在线| 国产精华一区二区三区| 免费观看a级毛片全部| 99精品在免费线老司机午夜| av卡一久久| 日日啪夜夜撸| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产精品精品国产色婷婷| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产单亲对白刺激| 精品久久久久久久久av| 在线观看66精品国产| 青春草国产在线视频 | 99热这里只有精品一区| 精品久久国产蜜桃| 婷婷精品国产亚洲av| 国产视频内射| 国产男人的电影天堂91| 三级经典国产精品| 国产精品一二三区在线看| 亚洲国产欧美在线一区| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久久久九九精品影院| 国产乱人视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 欧美精品一区二区大全| 乱人视频在线观看| www.av在线官网国产| 亚洲av免费高清在线观看| 九九在线视频观看精品| 最近手机中文字幕大全| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产v大片淫在线免费观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 麻豆一二三区av精品| 成人午夜高清在线视频| 国产老妇女一区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲欧洲国产日韩| 可以在线观看毛片的网站| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 99热这里只有是精品在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲在久久综合| 男插女下体视频免费在线播放| 22中文网久久字幕| 精品日产1卡2卡| 深夜精品福利| 国产伦理片在线播放av一区 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 床上黄色一级片| 国产探花极品一区二区| 天天躁日日操中文字幕| 两个人的视频大全免费| 又爽又黄无遮挡网站| 国产精品,欧美在线| 波多野结衣巨乳人妻|