梁 峰,張 瑋,王勝杰,武雪亮,岳 磊,張迎春,*
(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科,河北張家口 075000;2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院小兒外科,河北 張家口075000)
結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是中國常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢[1]。盡管結(jié)直腸癌的診斷與治療已經(jīng)取得了顯著進步,但其療效及預(yù)后仍不容樂觀[2]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是指長度大于200 nt的非編碼RNA,其在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用,廣泛參與調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等多種生物學(xué)過程,這為腫瘤的早期診斷和靶向治療提供了新的研究方向[3-6]。LncRNA RUNX1-IT1是新發(fā)現(xiàn)的一種非編碼RNA,關(guān)于lncRNA RUNX1-IT1在惡性腫瘤中的報道[7]不多,且經(jīng)IntaRNA 2.0軟件分析預(yù)測miR-21為lncRNA RUNX1-IT1作用靶點,但lncRNA RUNX1-IT1/miR-21調(diào)控軸對結(jié)直腸癌細胞的作用未見報道?;诖耍狙芯刻接憀ncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織和人結(jié)直腸癌細胞系中的表達情況,并分析其對結(jié)直腸癌細胞惡性生物學(xué)行為的影響及其與miR-21的調(diào)控關(guān)系,以期為結(jié)直腸癌的臨床診斷和治療提供參考。
選取2017年1月—2019年1月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院接受根治性手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標本62例及其相應(yīng)的癌旁正常組織標本(距離癌組織邊緣>5 cm)62例。結(jié)直腸癌患者發(fā)病年齡在37~86歲,男37例,女25例;其中結(jié)腸癌患者33例,直腸癌患者29例。所有納入患者的臨床資料均完整,本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(2021177),所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。納入標準:①術(shù)后病理確診為結(jié)直腸癌;②患者術(shù)前未接受過介入、放化療及免疫治療;③既往無其他腫瘤病史。排除標準:①伴有嚴重心、肝、腎功能異常者;②伴有其他惡性腫瘤;③術(shù)前行放化療或免疫治療等的患者。
人結(jié)直腸癌細胞系(SW480、SW620、HCT-116)和人正常結(jié)直腸上皮細胞系(FHC)均購自北納生物。RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司,雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)購自美國Promega公司,TRIzol試劑盒、LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司,SYBR qPCR Master Mix和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMRT Reagent Kit)購自寶生物工程(大連)有限公司。
RUNX1-IT1過表達質(zhì)粒(pcDNA-RUNX1-IT1)及陰性對照質(zhì)粒(pcDNA-control),miR-21抑制(anti-miR-21)及陰性對照(anti-miR-con)、miR-21過表達(miR-21 mimic)及陰性對照(mimic-NC)序列均由吉滿生物科技有限公司設(shè)計合成。
FHC細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,結(jié)直腸癌SW480、SW620和HCT116細胞用含有10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng),分別放置在37℃、CO2體積分數(shù)為5%恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。將SW480細胞以1×105個/孔接種至6孔培養(yǎng)板進行培養(yǎng),待細胞生長至80%左右進行細胞轉(zhuǎn)染,SW480細胞轉(zhuǎn)染前1 h更換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染分為過表達(pcDNAcontrol、pcDNA-RUNX1-IT1)和抑制表達(pcDNARUNX1-IT1、pcDNA-RUNX1-IT1+anti-miR-con、pcDNA-RUNX1-IT1+miR-21)兩種方案分組;按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作,轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測過表達/干擾效果。
使用TRIzol試劑提取組織總RNA,超微量紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以1 μL cDNA為模板,按照實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)試劑盒說明書進行PCR擴增。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,59℃退火30 s,72℃延伸90 s,40個循環(huán);最后72℃延伸5 min。以GAPDH和U6作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計算RUNX1-IT1和miR-21的相對表達。引物序列如下:RUNX1-IT1上 游 引 物,5′-CCTACTTCTGCACGATGTGA TG-3′,下游引物,5′-CCTTTGCTACGGTTGGTTACA TT-3′;miR-21上游引物,5′-TTGAATTCTAACACC TTCGTGGCTACAGAG-3′,下游引物,5′-TTAGATC TCATTTATCGAGGGAAGGATTG-3′。
采用IntaRNA 2.0(http://rna.informatik.uni-freiburg.de/IntaRNA/Input.jsp)軟件預(yù)測RUNX1-IT1與miR-21間的靶向結(jié)合序列,分別設(shè)計合成RUNX1-IT1的野生型(WT)和突變型(MUT)結(jié)合位點序列并整合至pGL3載體構(gòu)建報告基因質(zhì)粒(RUNX1-IT1-WT和RUNX1-IT1-MUT),并將其加載到pMIR-GLO?熒光素酶載體中。將SW480細胞以1×105個/孔接種在12孔板中培養(yǎng),并通過Lipofectamine 2000將含有RUNX1-IT1-WT或RUNX1-IT1-MUT和miR-21 mimic以 及miRNC的載體轉(zhuǎn)染到SW480細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后,再根據(jù)雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒說明書進行螢火蟲熒光素酶活性檢測。
1.6.1 遷移實驗收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對數(shù)生長期的SW480細胞,在Transwell上層小室加入稀釋后的SW480細胞(1×l06個/mL),下室加入含10% FBS的細胞培養(yǎng)液,37℃培養(yǎng)24 h,取出上室,去除上層小室未遷移的細胞,用70%甲醛固定30 min,結(jié)晶紫染色拍照,顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)。
1.6.2 侵襲實驗將-20℃取出的Matrigel置4℃冰箱過夜液化,4℃無血清培養(yǎng)基按1∶5比例稀釋Matrigel后,取100 μL加入到Transwell小室中,37℃使其凝固,按照遷移實驗進行后續(xù)操作。
采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析,符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料以xˉ±s表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差及兩兩比較LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。lncRNA RUNX1-IT1和miR-21在結(jié)直腸癌組織中表達的相關(guān)性采用Pearson檢驗分析。
qPCR檢測結(jié)果表明lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織中的相對表達水平(3.323±0.150)顯著低于癌旁組織(4.372±0.166);miR-21在結(jié)直腸癌組織中的相對表達水平(3.839±0.160)顯著高于癌旁組織(3.052±0.141),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01,圖1A和B)。LncRNA RUNX1-IT1和miR-21在結(jié)直腸癌組織中的表達呈負相關(guān)(r=-0.275,P=0.031,圖1C)。此外,lncRNA RUNX1-IT1在3種結(jié)直腸癌細胞系(SW480、SW620、HCT-116)中的表達水平均顯著低于正常結(jié)直腸FHC細胞(均為P<0.05,圖1D),而miR-21在上述3種結(jié)直腸癌細胞系中的表達水平明顯高于FHC細胞(均為P<0.05,圖1E),SW480細胞最明顯,故后續(xù)細胞系實驗均采用SW480細胞。上述結(jié)果也表明lncRNA RUNX1-IT1低表達和miR-21高表達可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。
圖1 RUNX1-IT1和miR-21在結(jié)直腸癌組織和細胞系中的表達
與轉(zhuǎn)染pcDNA-control對照組相比,轉(zhuǎn)染pcDNARUNX1-IT1質(zhì)粒組SW480細胞中l(wèi)ncRNA RUNX1-IT1表達水平明顯升高(t=6.347,P=0.003),見圖2A。Transwell侵襲和遷移實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNARUNX1-IT1質(zhì)粒組的侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均明顯少于轉(zhuǎn)染對照組(侵襲實驗:t=12.49,P<0.01;遷移實驗:t=5.764,P=0.005),見圖2B。結(jié)果表明上調(diào)lncRNA RUNX1-IT1的表達可抑制SW480細胞侵襲和遷移能力。
圖2 上調(diào)RUNX1-IT1表達對SW480細胞侵襲和遷移能力的影響
通過IntaRNA 2.0預(yù)測到lncRNA RUNX1-IT1與miR-21之間存在靶向結(jié)合位點(圖3A)。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染mimic陰性對照組相比,轉(zhuǎn)染miR-21 mimic即過表達miR-21組lncRNA RUNX1-IT1 WT(野生型)的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05),而lncRNA RUNX1-IT1 MUT(突變型)熒光素酶活性無明顯變化(圖3B)。qPCR檢測結(jié)果表明,與轉(zhuǎn)染pcDNAcontrol組(1.003±0.095)相比,在轉(zhuǎn)染pcDNA-RUNX1-IT1質(zhì)粒后,miR-21表達水平在SW480細胞中的明顯下降(0.293±0.020),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.289,P=0.002)。上述結(jié)果表明miR-21能夠靶向結(jié)合lncRNA RUNX1-IT1。
圖3 雙熒光素酶報告實驗驗證lncRNA RUNX1-IT1與miR-21間的靶向關(guān)系
qPCR檢測結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染anti-miR-con對照組相比,轉(zhuǎn)染anti-miR-21組后SW480細胞中miR-21表達 水 平 顯 著 降 低(t=6.80,P=0.002),見 圖4A。Transwell侵襲和遷移實驗結(jié)果顯示,anti-miR-21組的侵襲和遷移細胞數(shù)均明顯低于對照組(侵襲實驗:t=16.360,P<0.01;遷移實驗:t=7.096,P=0.002),見圖4B,表明miR-21表達下調(diào)可抑制SW480細胞的侵襲和遷移能力。
圖4 下調(diào)miR-21表達對SW480細胞侵襲和遷移能力的影響
qPCR檢測結(jié)果(圖5A)顯示,與轉(zhuǎn)染miR-con對照組比較,轉(zhuǎn)染miR-21過表達組SW480細胞中miR-21表達水平顯著升高(t=12.01,P<0.01)。為確認lncRNA RUNX1-IT1是否通過miR-21調(diào)控SW480細胞的侵襲和遷移,我們上調(diào)RUNX1-IT1的表達同時過表達miR-21。結(jié)果(圖5B)顯示,與轉(zhuǎn)染pcDNA-RUNX1-IT1+miR-con相比,共轉(zhuǎn)染pcDNA-RUNX1-IT1+miR-21組中細胞侵襲和遷移細胞數(shù)均顯著升高(均為P<0.05)(侵襲實驗:t=23.860,P<0.01;遷移實驗:t=11.020,P<0.01)。上述結(jié)果表明過表達miR-21可逆轉(zhuǎn)lncRNA RUNX1-IT1表達上調(diào)對SW480細胞侵襲和遷移能力的抑制作用。
圖5 過表達miR-21逆轉(zhuǎn)RUNX1-IT1對SW480細胞侵襲和遷移能力的抑制作用
結(jié)直腸癌早期癥狀隱匿,患者就診時大多處于中晚期,治療難度較大,盡管結(jié)直腸癌的診斷與治療已經(jīng)取得了顯著進步,但其療效及預(yù)后仍不容樂觀[8-10]。因此,探尋可靠的生物標志物對于結(jié)直腸癌患者的早期診斷、治療以及改善預(yù)后至關(guān)重要[11]。越來越多的證據(jù)表明,lncRNA異常表達與腫瘤發(fā)生、進展和預(yù)后不良有關(guān),可作為腫瘤早期診斷的新型生物標志物[12-13]。
LncRNA RUNX1-IT1是轉(zhuǎn)錄因子RUNX1的內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本,也稱為21號染色體開放閱讀框96(C21orF96)。盡管RUNX1的功能已在不同疾病中得到證實,但lncRNA RUNX1-IT1在多種腫瘤中的功能及其潛在機制仍不清楚[14]。有關(guān)LncRNA RUNX1-IT1在腫瘤中的相關(guān)研究報道不多,并且研究結(jié)論存在不一致情況。lncRNARUNX1-IT1在子宮內(nèi)膜癌中表達下調(diào),并通過抑制miR-21表達來抑制癌細胞的增殖[15]。過表達lncRNA RUNX1-IT1可顯著抑制肺癌細胞增殖、克隆形成和侵襲能力,而lncRNA RUNX1-IT1的敲除則產(chǎn)生相反的效果[16]。Shi等[7]研究顯示lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織和細胞系中表達均下調(diào),過表達lncRNA RUNX1-IT1可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和遷移能力,而敲除lncRNA RUNX1-IT1則反之。LncRNA RUNX1-IT1在肝細胞癌組織中表達降低,并與臨床病理特征和不良預(yù)后相關(guān)。機制研究表明RUNX1-IT1直接與miR-632結(jié)合,并作為競爭性內(nèi)源性RNA促進miR-632靶基因GSK-3β的表達,調(diào)控WNT/β-catenin,進而抑制肝癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移和干細胞樣特征[17]。Yan等[18]研究也發(fā)現(xiàn)肝癌組織中l(wèi)ncRNA RUNX1-IT1的表達水平顯著降低。過表達lncRNA RUNX1-IT1可顯著抑制肝癌細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。然而,與上述結(jié)論截然相反的是,Wu等[19]研究證實RUNX1-IT1在膠質(zhì)母細胞瘤組織中表達上調(diào),過表達RUNX1-IT1可明顯上調(diào)細胞周期蛋白D1的表達,并促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖。本研究結(jié)果表明lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織及細胞中低表達,過表達lncRNA RUNX1-IT1可抑制SW480細胞侵襲和遷移能力,與Shi等[7]的結(jié)論相一致。說明lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌的進展過程中發(fā)揮癌基因功能。
較多研究證實miR-21在多種實體腫瘤中表達異常,是一個潛在的腫瘤治療靶點和早期標志物[20]。miR-21在宮頸癌組織和血清樣本中表達上調(diào),而組織金屬蛋白酶抑制因子3(Tissue metalloproteinase inhibitor 3,TIMP3)在宮頸癌組織中表達下調(diào);miR-21通過靶向TIMP3促進宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[21]。miR-21在胃癌中表達明顯上調(diào),與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),可能是胃癌的預(yù)后標志物[22]。miR-21在非小細胞肺癌(NSCLC)中高表達,干擾miR-21表達可抑制細胞周期蛋白D1和E1的表達,并協(xié)同抑制癌細胞的增殖能力,且miR-21通過PTEN/Akt/GSK-3β信號通路中的關(guān)鍵分子來調(diào)控NSCLC增殖[23]。本研究結(jié)果表明,miR-21在結(jié)直腸癌組織及細胞中表達均明顯升高,抑制miR-21表達可抑制SW480細胞的侵襲和遷移能力;通過生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報告實驗結(jié)果證實lncRNA RUNX1-IT1和miR-21存在靶向結(jié)合位點。由此我們推測,lncRNA RUNX1-IT1可能作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)吸附靶向調(diào)控miR-21表達,進而影響結(jié)直腸癌的侵襲和遷移。并且在進一步的回復(fù)實驗中驗證了這一猜想,在lncRNA RUNX1-IT1過表達同時上調(diào)miR-21的表達,發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-21表達可逆轉(zhuǎn)過表達lncRNA RUNX1-IT1對SW480細胞侵襲和遷移的抑制作用。
綜上所述,lncRNA RUNX1-IT1在結(jié)直腸癌組織和細胞系中表達下調(diào),lncRNA RUNX1-IT1低表達通過靶向上調(diào)miR-21表達調(diào)控SW480細胞侵襲和遷移,這意味著lncRNA RUNX1-IT1有可能成為結(jié)直腸癌的分子治療靶點,其在體內(nèi)的具體作用及分子機制還有待進一步研究。