一株發(fā)酵木糖產(chǎn)氫細(xì)菌的分離和產(chǎn)氫特性

安 丹， 徐瑞娜， 謝林花， 陸 遙

(陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

隨著人類社會的快速發(fā)展，化石燃料的日益枯竭及化石燃料使用帶來的污染問題，人們迫切希望開發(fā)一種新的清潔能源取代化石燃料[1].在新的清潔能源中，氫氣具有燃燒熱值高，燃燒產(chǎn)物只有水等優(yōu)點被越來越多的學(xué)者所關(guān)注[2].目前，制氫方法主要有水煤氣法、電解水制氫法、熱化學(xué)循環(huán)制氫、光分解水制氫法和生物質(zhì)制氫等[3,4].水煤氣法對設(shè)備要求高，電解水制氫需要消耗大量電能，熱化學(xué)循環(huán)制氫步驟過多，光分解水制氫中催化劑制備成本高昂等問題目前限制了這些制氫技術(shù)的發(fā)展.與之相比，生物質(zhì)制氫中的微生物制氫技術(shù)具有條件溫和、對反應(yīng)器要求低及耗電量低等優(yōu)點，現(xiàn)在成為越來越多學(xué)者關(guān)注的制氫方法[5,6].

我國農(nóng)業(yè)每年產(chǎn)生大量秸稈，以2015年我國秸稈產(chǎn)量為例，2015年中國主要農(nóng)作物秸稈總產(chǎn)量8.09億噸，蘊(yùn)含的低位熱值折算成4.02億噸標(biāo)準(zhǔn)煤.依據(jù)2009年我國農(nóng)業(yè)部開展的中國農(nóng)作物秸稈專項調(diào)查，廢棄及燃燒的秸稈占總量比例約為50%[7].調(diào)查結(jié)果顯示廢棄及燃燒秸稈占比很大，廢棄及燃燒秸稈不僅污染環(huán)境同時浪費資源，如何將廢棄秸稈中蘊(yùn)含的巨大生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化為可供我國社會發(fā)展急需的能源，將廢棄秸稈變廢為寶實現(xiàn)環(huán)境和能源的雙贏，具有十分重大的意義.目前，各國學(xué)者將農(nóng)作物秸稈作為微生物制氫的底物生產(chǎn)氫氣，將微生物制氫與農(nóng)作物秸稈的能源化結(jié)合起來，既解決了國家對清潔可再生能源的需求又實現(xiàn)變廢為寶，這是一個非常有潛力值得我們深入探索的領(lǐng)域[8].

農(nóng)作物秸稈為底物的微生物制氫技術(shù)包含暗發(fā)酵制氫和光合發(fā)酵制氫.光合發(fā)酵制氫中光合細(xì)菌可利用小分子有機(jī)酸及部分糖類物質(zhì)產(chǎn)氫，其優(yōu)點為底物轉(zhuǎn)化率高，但產(chǎn)氫速率低成為制約其工業(yè)化的瓶頸問題.目前，學(xué)者們在高效光合細(xì)菌分離、光合細(xì)菌產(chǎn)氫條件優(yōu)化、光合細(xì)菌基因改造等方面進(jìn)行了大量研究，以期提高光合細(xì)菌的產(chǎn)氫速率.張安龍等[9]從造紙廠活性污泥中分離選出一株高效產(chǎn)氫光合細(xì)菌QW02，并對碳源、氮源濃度及磷酸鹽緩沖液添加量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在最優(yōu)產(chǎn)氫條件下，該菌以葡萄糖為碳源的最大產(chǎn)氫量為3 944.2 mL H2/L，最大產(chǎn)氫速率為153.5 mL H2/(L·h).Yang H 等[10]從土壤中分離獲得一株高效產(chǎn)氫光合細(xì)菌RhodobactersphaeroidesHY01，并對初始pH、氮源和碳源進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在最優(yōu)產(chǎn)氫條件下，該菌的最大產(chǎn)氫量為7 012.5±150 mL H2/L，最大產(chǎn)氫速率為148.7±4.6 mL H2/(L·h).Wang X等[11]對影響光合細(xì)菌二氧化碳固定的cbbP和呼吸鏈的cyt-cbb3進(jìn)行敲除，獲得突變株Wb301(敲除ccoNOQP)和W3p03(敲除cbbP和ccoNOQP)，并發(fā)現(xiàn)它們比野生型的最大產(chǎn)氫速率分別提高了15.8%和41.7%.Wang X等[12]對影響光合細(xì)菌葉綠素合成的spbA和氧化還原平衡的hupSL進(jìn)行敲除，獲得突變株WH04(敲除hupSL)和WSH10(敲除hupSL和spbA)，并發(fā)現(xiàn)它們比野生型的最大產(chǎn)氫速率分別提高了29.9%和55.0%.Yang H等[13]對影響光合細(xì)菌固氮酶表達(dá)水平的mopAB進(jìn)行敲除，獲得突變株YMP1(敲除mopAB)，并發(fā)現(xiàn)在光照強(qiáng)度為2 500、5 000及8 500 lux條件下，它比野生型的最大產(chǎn)氫速率分別提高了14.5%、15.1%和24.1%.

但目前的研究結(jié)果顯示，光合細(xì)菌的產(chǎn)氫速率仍與暗細(xì)菌產(chǎn)氫速率存在一定差距，仍需要繼續(xù)深入研究提高.

與之相比，暗發(fā)酵細(xì)菌制氫具有產(chǎn)氫速率高等優(yōu)點，暗發(fā)酵制氫具有更大的發(fā)展?jié)摿6].暗發(fā)酵制氫中暗細(xì)菌可利用糖類等物質(zhì)產(chǎn)氫，其優(yōu)點為產(chǎn)氫速率高，暗發(fā)酵制氫目前在很多地方已實現(xiàn)中試及生產(chǎn)示范[14].制氫菌種產(chǎn)氫性能低下成為制約其進(jìn)一步推廣應(yīng)用的瓶頸問題.目前，學(xué)者們在高效暗細(xì)菌分離、暗細(xì)菌基因改造、暗細(xì)菌產(chǎn)氫條件優(yōu)化等方面進(jìn)行了大量研究，以期提高制氫菌種的產(chǎn)氫性能.張丹丹等[15]對中溫(35 ℃)和高溫(55 ℃)下混合菌群利用不同濃度木糖(10～50 g/L)進(jìn)行優(yōu)化研究，結(jié)果表明，35 ℃下木糖濃度為30 g/L時獲得最大產(chǎn)氫量，為1.24 mol H2/mol-木糖.Xu J F等[16]從牛糞堆肥中分離一株暗細(xì)菌Clostridiumsp.HR-1并對產(chǎn)氫條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最大產(chǎn)氫量為1.63 mol H2/mol-木糖.劉洪艷等[17]以厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌PantoeaagglomeransBH18為出發(fā)菌株，利用轉(zhuǎn)座子Tn7構(gòu)建突變體文庫，獲得突變株TB34，產(chǎn)氫量為1.34±0.09 mol H2/mol-木糖.此外，許多學(xué)者對暗細(xì)菌制氫的過程條件，如底物種類、底物濃度、接種量、硝酸鹽濃度、氮源種類、C/N、磷酸鹽濃度、發(fā)酵液初始pH及溫度等均對暗發(fā)酵制氫的產(chǎn)氫性能的影響進(jìn)行了研究[18-21]，結(jié)果表明這些過程參數(shù)均對制氫過程產(chǎn)生影響，但影響有限.

通過目前的研究發(fā)現(xiàn)，暗發(fā)酵細(xì)菌的種類對暗發(fā)酵制氫的產(chǎn)氫量影響較大，獲得高效的暗發(fā)酵細(xì)菌菌種，可以大幅提高暗發(fā)酵的產(chǎn)氫性能.基于此，本研究的研究重點在于獲得高效的暗發(fā)酵細(xì)菌菌種并對該菌種的產(chǎn)氫條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得較高的產(chǎn)氫量，本研究為暗發(fā)酵制氫奠定一定的暗發(fā)酵細(xì)菌菌種資源和工藝條件基礎(chǔ).

本文主要是針對目前國內(nèi)外對高效降解木糖制氫的高效暗細(xì)菌菌種不足的問題，開展高效降解木糖的暗細(xì)菌的分離及產(chǎn)氫條件優(yōu)化工作，為大規(guī)模制氫提供優(yōu)良菌種及工藝條件.

1 實驗部分

1.1 實驗樣品

牛糞、馬糞采集于西安市未央?yún)^(qū)西柵村等幾家村民家中，牛糞為實驗室儲存.

1.2 主要藥品及儀器

(1)主要藥品

葡萄糖、木糖、L-谷氨酸、酵母膏、氯化鈉、L-天冬氨酸、硫酸銨等，所用藥品均為分析純.

(2)主要儀器

紫外分光光度計(SP-UV1100)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH3600BII)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(BOXUNM-30R)、雷磁pH計(PHSJ-3F)、高溫烘箱(WGL-125B)、光照培養(yǎng)箱(GXZ-380B)等.

1.3 實驗方法

(1)暗細(xì)菌分離源樣品采集及保存實驗

西安市未央?yún)^(qū)西柵村等幾家村民家中采集的家禽糞便(羊糞200克，馬糞200克)，取樣后放于4 ℃冰箱保存.

(2)樣品處理及液體富集實驗

將采集好的家禽糞便在報紙上鋪開，于95 ℃，2小時的條件下烘干至無水分狀態(tài).之后稱取每種烘干糞便各5克于250毫升錐形瓶中，加入100毫升水，充分浸泡糞便樣品2小時，并每隔30分鐘充分搖勻.

取10 mL過濾菌液加入100 mL產(chǎn)氫液[22]中進(jìn)行液體富集，35 ℃培養(yǎng)48 h.

(3)暗細(xì)菌分離純化、鑒定實驗

采用固體暗細(xì)菌分離平板對暗細(xì)菌進(jìn)行分離純化實驗，純化操作至少三次，以保證獲得細(xì)菌為純菌.三次純化后獲得單菌落進(jìn)行液體富集培養(yǎng)，取少量液體在顯微鏡下觀察，判斷細(xì)菌純度.

暗細(xì)菌菌種鑒定試驗：采用基因組提取試劑盒，提取待測菌株基因組，后采用27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492R (5′-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗，擴(kuò)增后的片段送往擎科生物公司進(jìn)行測序.測序后的結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對，獲得新分離暗細(xì)菌的種屬信息[23].

(4)暗細(xì)菌產(chǎn)氫實驗

暗細(xì)菌培養(yǎng)物制備：在固體暗細(xì)菌分離平板劃線復(fù)蘇保存于-80 ℃超低溫冰箱的暗細(xì)菌凍存液，后置于35 ℃厭氧培養(yǎng)48 h.

產(chǎn)氫液配制：按實驗設(shè)計配制產(chǎn)氫液[22]，滅菌后過濾加入磷酸鹽緩沖液(1 M)20 mL/L、Solution C 20 mL/L、維生素1 mL/L，混勻后備用.

產(chǎn)氫實驗：暗細(xì)菌液體培養(yǎng)物以5%的接種量接入含有100 mL產(chǎn)氫液的反應(yīng)器，后置于溫度為35 ℃、震蕩頻率為120 次/分的恒溫水浴鍋中，固定時間記錄產(chǎn)氫量數(shù)據(jù)并測定氫氣濃度，實驗周期為41 h.

1.4 分析測試方法

(1)木糖濃度測試

木糖濃度測定采用間苯三酚法，采用D-木糖測試盒(南京建成生物工程研究所)測定.在試管中加入3 mL間苯三酚試劑，后加入0.03 mL樣品、雙蒸水(空白)、D-木糖標(biāo)準(zhǔn)品(1.33 mmol/L木糖)后在100 ℃沸騰水浴鍋中煮沸4 min，后放入冷水中迅速冷卻.混勻后，在分光光度計(554 nm)測定吸光度值，所得數(shù)據(jù)代入公式(1),即可求出木糖濃度值.

150

(1)

(2)氫氣濃度測定

氣相色譜儀主要由氣液系統(tǒng)、色譜分離系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)，數(shù)據(jù)處理及其他輔助部件等組成.樣品氣體經(jīng)進(jìn)樣口被色譜分離后，各組分分別進(jìn)入檢測器，檢測器產(chǎn)生相應(yīng)的輸出信號，得到曲線圖.

用進(jìn)樣針抽取3 mL氫氣，一邊抽氣一邊推針管活塞，然后迅速進(jìn)樣，待測定結(jié)束抄取出峰時間和峰面積.

測試條件：后檢測器溫度：250 ℃；柱箱溫度：90 ℃；載氣：Ar.

氫氣濃度=樣品氫氣峰面積/純氫氣峰面積

(3)產(chǎn)氫量測定

氫氣體積依據(jù)公式(2)計算[22]：

V=Vori+∑Viri

(2)

式(2)中：V是累計產(chǎn)氫量；Vo是反應(yīng)器上部空間；Vi是反應(yīng)器實時排出的液體體積；ri是實時氫氣濃度.

動力學(xué)模型：

批式產(chǎn)氫實驗的累積產(chǎn)氫量的動力學(xué)模型依據(jù)下面公式(3)計算[22]：

(3)

式(3)中：H是累計產(chǎn)氫量，λ是延遲時間(h)，P是最大產(chǎn)氫量(mL)，Rm是最大產(chǎn)氫速率(mL/(L·h))，e是2.718 281 828.

2 結(jié)果與討論

2.1 11號暗細(xì)菌菌種鑒定

將獲得的含菌濾液采用暗細(xì)菌液體培養(yǎng)基富集，后采用暗細(xì)菌分離培養(yǎng)基平板進(jìn)行劃線純化，純化至少三次，鏡檢，共分離獲得11株純菌.11株暗細(xì)菌以葡萄糖和木糖為復(fù)合碳源進(jìn)行產(chǎn)氫測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11號暗細(xì)菌產(chǎn)氫性能最佳.提取11號菌的基因組進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至擎科生物公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站采用BLAST工具進(jìn)行比對，比對結(jié)果顯示11號菌與Escherichiacoli相似度為99%，該暗細(xì)菌被命為EscherichiacoliXRN510.

2.2 不同碳源對Escherichia coli XRN510產(chǎn)氫性能的影響

不同碳源對EscherichiacoliXRN510產(chǎn)氫性能的影響曲線如圖1所示.對農(nóng)作物秸稈水解液中包含的主要還原糖如葡萄糖、木糖、D-果糖、α-乳糖為底物進(jìn)行產(chǎn)氫測試.由圖1(a)發(fā)現(xiàn)D-木糖產(chǎn)氫量最大，為1 456.53±100.86 mL/L，最大產(chǎn)氫速率為286.97±64.92 mL/(L·h)，延遲時間為22.44±1.31 h.葡萄糖產(chǎn)氫量也較高，為1 156.77±64.10 mL/L，最大產(chǎn)氫速率為177.49±44.30 mL/(L·h)，延遲時間為22.88±0.56 h.D-果糖為碳源的產(chǎn)氫量最小為1 044.85±47.29 mL/L，最大產(chǎn)氫速率為213.29±84.98 mL/(L·h)，延遲時間為23.11±0.46 h.因農(nóng)作物秸稈水解液主要成分為葡萄糖和木糖，經(jīng)過碳源測試后，選取木糖為后續(xù)底物進(jìn)行產(chǎn)氫性能研究.通過實驗發(fā)現(xiàn)EscherichiacoliXRN510對農(nóng)作物秸稈水解液中的主要還原糖葡萄糖和木糖降解制氫效果良好，產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率均較高，且延遲時間較短，這說明EscherichiacoliXRN510可以高效利用葡萄糖和木糖制氫，對于以葡萄糖和木糖為主的農(nóng)作物秸稈水解液制氫具有很大應(yīng)用潛力.

由圖1(b)的生物量曲線，發(fā)現(xiàn)D-果糖為碳源時，菌體生長量為測試的4種碳源中最大的，為8.5 g/L，這可能是由于D-果糖比較好降解利用，由D-果糖的底物降解率為69.69%，也可以看出D-果糖可以很好被暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510利用，D-果糖的產(chǎn)氫量為1 044.85±47.29 mL/L，產(chǎn)氫量最低，結(jié)合菌體量和產(chǎn)氫量可以看出D-果糖這種碳源更有利于轉(zhuǎn)化為菌體.由圖1(a)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氫量前三的碳源依次為D-木糖、α-乳糖和葡萄糖，結(jié)合圖1(b)的發(fā)酵液最終pH曲線，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氫量高的碳源，其發(fā)酵液最終pH并不低，產(chǎn)氫量低的其發(fā)酵液最終pH也不高，這可能是由于暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510在制氫的過程中不同的碳源的產(chǎn)氫代謝途徑不同所致，不同產(chǎn)氫代謝途徑產(chǎn)生的小分子酸不同，引起發(fā)酵液pH變化程度不同.由圖1(b)的底物降解率曲線，發(fā)現(xiàn)底物降解率從高到低的碳源依次為D-木糖、葡萄糖、α-乳糖和D-果糖，結(jié)合生物量可推測D-果糖的底物降解率高是由于其菌體生長量最大所引起，結(jié)合產(chǎn)氫量，D-木糖的底物降解率高是由于其產(chǎn)氫量最大所引起，其他兩種糖類的底物降解率較高可能是其產(chǎn)氫量較高所致.

經(jīng)上述綜合分析，由于木糖是花生殼水解液的主要成分，且暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510以木糖為碳源制氫性能良好，選取木糖為后續(xù)碳源進(jìn)行優(yōu)化實驗.

(a)Escherichia coli XRN510以不同碳源為底物的產(chǎn)氫曲線

(b)Escherichia coli XRN510以不同碳源為底物制氫結(jié)束發(fā)酵液中生物量、發(fā)酵液最終pH及底物降解率變化規(guī)律圖1 不同碳源對Escherichia coli XRN510產(chǎn)氫性能的影響

2.3 不同濃度木糖對Escherichia coli XRN510產(chǎn)氫性能的影響

以D-木糖為碳源，L-谷氨酸和酵母膏為氮源，制氫液初始pH為7.2，EscherichiacoliXRN510在不同濃度木糖的制氫液中進(jìn)行產(chǎn)氫測試，產(chǎn)氫性能曲線如圖2所示.由圖2(a)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)制氫液的木糖濃度從5.0 g/L增加到10.0 g/L時，產(chǎn)氫量從1 130.73±5.68 mL/L增加到1 456.53±100.86 mL/L，當(dāng)木糖濃度為10.0 g/L時，獲得最大的產(chǎn)氫量1 456.53±100.86 mL/L.當(dāng)木糖濃度繼續(xù)增加時，產(chǎn)氫量呈現(xiàn)降低趨勢.圖2(a)數(shù)據(jù)表明，制氫液中木糖濃度會對EscherichiacoliXRN510的制氫性能產(chǎn)生很大影響，木糖濃度為10.0 g/L時，EscherichiacoliXRN510的產(chǎn)氫量最大，產(chǎn)氫性能最佳.過低或過高木糖濃度均對EscherichiacoliXRN510的產(chǎn)氫性能產(chǎn)生抑制作用，這可能是由于木糖濃度會影響EscherichiacoliXRN510的滲透壓，對于EscherichiacoliXRN510的菌體正常形態(tài)起到重要影響，過低或過高木糖濃度會可能會影響EscherichiacoliXRN510的菌體正常形態(tài)及滲透壓，對EscherichiacoliXRN510的生長產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而影響暗細(xì)菌的制氫性能[24].

由圖2(b)的生物量曲線，可以看出木糖濃度為5.0 g/L時，暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的菌體生長量最小，這可能與過低木糖會使暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510合成菌體的碳源不足有關(guān)，進(jìn)而影響菌體生長.當(dāng)木糖濃度為15.0 g/L時，菌體生長量最大，這可能是由于過低木糖濃度會導(dǎo)致EscherichiacoliXRN510合成菌體的碳源不足影響菌體生長.過高木糖濃度可能會影響EscherichiacoliXRN510的菌體正常形態(tài)及滲透壓，對EscherichiacoliXRN510的生長產(chǎn)生抑制作用.由圖2(b)的發(fā)酵液最終pH曲線，隨著木糖濃度從5.0 g/L增加至30.0 g/L時，發(fā)酵液最終pH逐漸降低，這可能與木糖濃度越高，會誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生更多的酸性物質(zhì)有關(guān).由圖2(b)的底物降解率曲線，可以看出產(chǎn)氫液的底物降解率與葡木糖濃度有關(guān)，木糖濃度越大，底物降解率越低，這可能與暗細(xì)菌在一個實驗周期中暗細(xì)菌生長及制氫所需的碳源質(zhì)量變化不大有關(guān)，由實驗數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)葡萄糖濃度在5.0～30.0 g/L時，木糖消耗量在4.0～15.0 g/L，這也說明木糖濃度增大并不會導(dǎo)致暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510消耗木糖的量成倍數(shù)增長[22].

經(jīng)上述綜合分析，木糖濃度為10.0 g/L是最適合EscherichiacoliXRN510制氫的，后續(xù)以產(chǎn)氫液木糖濃度為10.0 g/L進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)氫研究.

(a)Escherichia coli XRN510以不同濃度木糖為底物的產(chǎn)氫曲線

(b)Escherichia coli XRN510以不同濃度木糖為底物制氫結(jié)束發(fā)酵液中生物量、發(fā)酵液最終pH及底物降解率變化規(guī)律圖2 不同濃度木糖對Escherichia coli XRN510產(chǎn)氫性能的影響

2.4 不同氮源對Escherichia coli XRN510產(chǎn)氫性能的影響

以木糖為碳源，分別對酵母膏、L-谷氨酸和硫酸銨及兩兩組合為氮源進(jìn)行產(chǎn)氫性能測試，EscherichiacoliXRN510在不同氮源條件下的產(chǎn)氫性能曲線如圖3所示.由圖3(a)發(fā)現(xiàn)，氮源為L-谷氨酸和酵母膏這一組合時，暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的產(chǎn)氫量最大為1 328.25±43.67 mL/L，最大產(chǎn)氫速率為228.14±50.60 mL/(L·h)，延遲時間為22.61 ±0.39 h.L-谷氨酸為氮源的產(chǎn)氫量為278.19±50.10 mL/L，最大產(chǎn)氫速率為7.78±1.50 mL/(L·h)，延遲時間為2.39 h.酵母膏為氮源的產(chǎn)氫量為1 034.92±13.73 mL/L，最大產(chǎn)氫速率為191.00±15.91 mL/(L·h)，延遲時間為23.16±0.12 h.通過實驗發(fā)現(xiàn)EscherichiacoliXRN510以L-谷氨酸和酵母膏這一組合為氮源時的產(chǎn)氫量最高，產(chǎn)氫速率最大，因此，L-谷氨酸和酵母膏這一組合是最適合EscherichiacoliXRN510制氫的氮源.此外，還可以發(fā)現(xiàn)L-谷氨酸和酵母膏這一組合為氮源時暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的產(chǎn)氫量要高于單獨的L-谷氨酸、酵母膏的氮源，發(fā)現(xiàn)L-谷氨酸和酵母膏在形成組合氮源時，對暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的制氫中表現(xiàn)為協(xié)同作用，這種協(xié)同效應(yīng)，在L-谷氨酸與硫酸銨、酵母膏與硫酸銨這兩個氮源組合中也被發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象可能是由于單一氮源營養(yǎng)物質(zhì)較為匱乏，不如復(fù)合氮源含有的氮源營養(yǎng)物質(zhì)種類豐富，復(fù)合氮源可以滿足暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510生長及各種制氫代謝途徑的需要，使暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的菌體生長產(chǎn)氫代謝途徑均保持良好狀態(tài)，進(jìn)而獲得優(yōu)良的產(chǎn)氫量.此外，L-谷氨酸和酵母膏均屬于有機(jī)氮源，成本較高，硫酸銨這種廉價的無機(jī)氮源產(chǎn)氫效果也不錯.說明EscherichiacoliXRN510即可利用有機(jī)氮源也可利用無機(jī)氮源產(chǎn)氫.后續(xù)在應(yīng)用EscherichiacoliXRN510進(jìn)行制氫時宜選用有機(jī)氮源和無機(jī)氮源的組合或復(fù)合氮源為制氫氮源.

由圖3(b)的生物量曲線，發(fā)現(xiàn)硫酸銨為氮源時暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的菌體生長量最小，這可能是因為硫酸銨是無機(jī)氮源，暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510在利用無機(jī)氮源時要消耗更多的能量，進(jìn)而影響菌體生長，導(dǎo)致生物量不高.暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510以L-谷氨酸或酵母膏為氮源時菌體生長量為測試的6種氮源中較高的，這可能是由于L-谷氨酸或酵母膏為有機(jī)氮源，其與暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的菌體結(jié)構(gòu)成分更為近似，使得暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510在使用L-谷氨酸或酵母膏生長及制氫時更為容易，進(jìn)而可以獲得較高的生物量及產(chǎn)氫量[25].由圖3(b)的發(fā)酵液最終pH曲線，可以發(fā)現(xiàn)單獨的L-谷氨酸為氮源時，發(fā)酵液最終pH最高，這可能是由于L-谷氨酸為氮源時其產(chǎn)氫量最低有關(guān)，產(chǎn)氫量最低其制氫過程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)越少進(jìn)而發(fā)酵液pH變化最小.此外，還發(fā)現(xiàn)L-谷氨酸和酵母膏這一組合氮源的發(fā)酵液最終pH介于單獨的L-谷氨酸、單獨的酵母膏為氮源的發(fā)酵液最終pH之間，這一現(xiàn)象在L-谷氨酸和硫酸銨這一組合氮源中也被發(fā)現(xiàn)，推測這可能是由于這組合的復(fù)合氮源引發(fā)暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510產(chǎn)氫過程中不同的產(chǎn)氫代謝途徑有關(guān).由圖3(b)的底物降解率曲線，結(jié)合圖3(a)發(fā)現(xiàn)菌種生長量相差不多的情況下，產(chǎn)氫量越高，底物降解率越高，這可能是由于產(chǎn)氫需要消耗大量的碳源，產(chǎn)氫量越大消耗的碳源越多.經(jīng)上述綜合分析，L-谷氨酸和酵母膏這一組合氮源是最適合EscherichiacoliXRN510制氫的氮源，后續(xù)以L-谷氨酸和酵母膏這一組合為氮源進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)氫研究.

(a)Escherichia coli XRN510在不同氮源條件下的產(chǎn)氫曲線

(b)Escherichia coli XRN510在不同氮源條件下制氫結(jié)束發(fā)酵液中生物量、發(fā)酵液最終pH及底物降解率變化規(guī)律圖3 不同氮源對Escherichia coli XRN510產(chǎn)氫性能的影響

2.5 不同氮源比例對Escherichia coli XRN510產(chǎn)氫性能的影響

以木糖為碳源，以L-谷氨酸和酵母膏這一組合為氮源進(jìn)行產(chǎn)氫性能測試，不同氮源比例對EscherichiacoliXRN510產(chǎn)氫性能影響曲線如圖4所示.由圖4(a)發(fā)現(xiàn)，氮源為L-谷氨酸∶酵母膏從0∶4增加到3∶5時，暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的產(chǎn)氫量從1 034.92±13.70 mL/L增大到1 468.93±61.52 mL/L.在氮源為L-谷氨酸∶酵母膏為3∶5，即L-谷氨酸1.5 g/L和酵母膏2.5 g/L時，暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的產(chǎn)氫量最大為1 468.93±61.52 mL/L.隨著氮源為L-谷氨酸∶酵母膏從3∶5增加到4∶0時，暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的產(chǎn)氫量逐漸降低，當(dāng)L-谷氨酸∶酵母膏為4∶0，即L-谷氨酸4.0 g/L為氮源，產(chǎn)氫量達(dá)到最低值為278.19±50.10 mL/L，與L-谷氨酸∶酵母膏為3∶5時的產(chǎn)氫量相比減少了80.22%.通過實驗發(fā)現(xiàn)EscherichiacoliXRN510以L-谷氨酸∶酵母膏為3∶5，即L-谷氨酸1.5 g/L和酵母膏2.5 g/L為氮源時的產(chǎn)氫量最高，因此，L-谷氨酸∶酵母膏為3∶5，即L-谷氨酸1.5 g/L和酵母膏2.5 g/L這一氮源比例是最適合EscherichiacoliXRN510制氫的氮源比例，后續(xù)以L-谷氨酸∶酵母膏為3∶5，即L-谷氨酸1.5 g/L和酵母膏2.5 g/L這一氮源比例為組合氮源進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)氫研究.

由圖4(b)的生物量曲線，發(fā)現(xiàn)L-谷氨酸∶酵母膏為3∶5，即L-谷氨酸1.5 g/L和酵母膏2.5 g/L為氮源時，暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的菌體生長量最大，這可能是因為氮源組合中L-谷氨酸∶酵母膏為3∶5時，暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510菌體生長所需氮源種類和營養(yǎng)物質(zhì)的數(shù)量剛好與產(chǎn)氫液提供的氮源種類及數(shù)量最為接近，從而在此時獲得最大的生物量.由圖4(b)的發(fā)酵液最終pH曲線，可以發(fā)現(xiàn)單獨的L-谷氨酸為氮源時，發(fā)酵液最終pH最高，這可能是由于L-谷氨酸為氮源時其產(chǎn)氫量最低有關(guān)，產(chǎn)氫量最低其制氫過程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)越少進(jìn)而發(fā)酵液pH變化最小.單獨的酵母膏為氮源時，發(fā)酵液最終pH最低，這可能與暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510使用酵母膏制氫時的產(chǎn)氫代謝途徑產(chǎn)生更多的酸性物質(zhì)有關(guān)系.此外，還發(fā)現(xiàn)L-谷氨酸∶酵母膏從0∶4增加到4∶0時，組合氮源的發(fā)酵液最終pH介于單獨的L-谷氨酸、單獨的酵母膏為氮源的發(fā)酵液最終pH之間，且呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢.推測這可能是由于酵母膏這種氮源引發(fā)暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510產(chǎn)氫過程中產(chǎn)生更多的酸性物質(zhì)的產(chǎn)氫代謝途徑有關(guān).由圖4(b)的底物降解率曲線，結(jié)合圖4(a)發(fā)現(xiàn)菌種生長量相差不多的情況下，產(chǎn)氫量越高，底物降解率越高，這可能是由于產(chǎn)氫需要消耗大量的碳源，產(chǎn)氫量越大消耗的碳源越多[22].

經(jīng)上述綜合分析，L-谷氨酸∶酵母膏為3∶5，即L-谷氨酸1.5 g/L和酵母膏2.5 g/L這一組合氮源是最適合EscherichiacoliXRN510制氫的氮源比例，后續(xù)以L-谷氨酸∶酵母膏為3∶5，即L-谷氨酸1.5 g/L和酵母膏2.5 g/L這一氮源比例的組合為氮源進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)氫研究.

(a)Escherichia coli XRN510在不同氮源比例條件下的產(chǎn)氫曲線

(b)Escherichia coli XRN510在不同氮源比例條件下制氫結(jié)束發(fā)酵液中生物量、發(fā)酵液最終pH及底物降解率變化規(guī)律圖4 不同氮源比例對Escherichia coli XRN510產(chǎn)氫性能的影響

2.6 不同初始pH對Escherichia coli XRN510產(chǎn)氫性能的影響

以木糖為碳源，以L-谷氨酸1.5 g/L和酵母膏2.5 g/L這一組合為氮源進(jìn)行產(chǎn)氫性能測試，不同初始pH產(chǎn)氫液對EscherichiacoliXRN510產(chǎn)氫性能影響曲線如圖5所示.由圖5(a)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)制氫液的初始pH從6.0增加到7.2時，產(chǎn)氫量也逐漸增加，當(dāng)產(chǎn)氫液初始pH為7.2的產(chǎn)氫量為1 468.93±61.52 mL/L，當(dāng)初始pH為7.2時，獲得最大的產(chǎn)氫量.當(dāng)初始pH從7.2繼續(xù)增加至8.5時，產(chǎn)氫量呈現(xiàn)降低趨勢，當(dāng)初始pH為8.5時，產(chǎn)氫量為1 211.40±50.20 mL/L，與初始pH為7.2時的產(chǎn)氫量相比降低17.53%.圖5(a)數(shù)據(jù)表明，制氫液初始pH會對EscherichiacoliXRN510的制氫性能產(chǎn)生很大影響，初始pH為7.2時EscherichiacoliXRN510的產(chǎn)氫量最大，產(chǎn)氫性能最佳.過低或過高pH均對EscherichiacoliXRN510的產(chǎn)氫性能產(chǎn)生抑制作用，這可能是由于EscherichiacoliXRN510內(nèi)部的與制氫有關(guān)的主要酶系最適宜pH為7.2，過低過高pH會對這些酶系的酶活性產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而影響光合細(xì)菌的制氫性能[26-28].

由圖5(b)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氫液初始pH為8.5時暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的菌體生長量最小，這可能與產(chǎn)氫液初始pH過高會影響暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510菌體內(nèi)酶有關(guān)，過高pH通過抑制酶活性進(jìn)而影響菌體生長和產(chǎn)氫.產(chǎn)氫液初始pH為7.2時，菌體生長量為測試的6種初始pH中最大的，為3.5 g/L，這可能是由于產(chǎn)氫液初始pH為7.2更利于菌體內(nèi)與生長相關(guān)的酶的活性處于最高有關(guān).由圖5(b)的發(fā)酵液最終pH曲線，發(fā)現(xiàn)隨著產(chǎn)氫液初始pH從6.0升高到8.5時，發(fā)酵液最終pH在4.52～4.62之間，產(chǎn)氫液初始pH的跨度為2.5，但是發(fā)酵液最終pH的跨度為0.1，這說明產(chǎn)氫液初始pH對發(fā)酵液最終pH的影響較小，這也說明暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510在發(fā)酵液pH降為4.52～4.62時停止產(chǎn)氫和生長.由圖5(b)的底物降解率曲線，可以看出產(chǎn)氫液初始pH為6.0及8.5時的底物降解率大趨勢是隨pH升高而逐漸升高，這可能是由于暗細(xì)菌產(chǎn)氫液初始pH越高，暗細(xì)菌需要維持菌體生命活動的能量越大，進(jìn)而需要消耗的碳源也更多，進(jìn)而對底物降解率也越高[24].

經(jīng)上述綜合分析，產(chǎn)氫液初始pH為7.2是最適合暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510制氫的.

(a)Escherichia coli XRN510在產(chǎn)氫液不同初始pH條件下的產(chǎn)氫曲線

(b)Escherichia coli XRN510在產(chǎn)氫液不同初始pH條件下制氫結(jié)束發(fā)酵液中生物量、發(fā)酵液最終pH及底物降解率變化規(guī)律圖5 產(chǎn)氫液不同初始pH對Escherichia coliXRN510產(chǎn)氫性能的影響

2.7 Escherichia coli XRN510的產(chǎn)氫性能與國內(nèi)外主要研究結(jié)果比較

EscherichiacoliXRN510的產(chǎn)氫性能與國內(nèi)外主要研究結(jié)果如表1所示.本文所分離獲得暗細(xì)菌EscherichiacoliXRN510的產(chǎn)氫量為1.31 mol H2/mol-木糖，處于較高水平，說明該菌種產(chǎn)氫性能優(yōu)良，可為以木糖和葡萄糖為主的農(nóng)作物秸稈水解液制氫提供優(yōu)良的菌種資源，對于農(nóng)作物秸稈為底物的大規(guī)模制氫具有一定的推動作用.

表1 Escherichia coli XRN510的產(chǎn)氫性能與國內(nèi)外主要研究結(jié)果比較

3 結(jié)論

通過對產(chǎn)氫條件逐一優(yōu)化，得出最佳產(chǎn)氫條件為碳源為木糖，木糖濃度為10.0 g/L，最優(yōu)氮源為L-谷氨酸1.5 g/L和酵母膏2.5 g/L的混合氮源，產(chǎn)氫液初始pH為7.2，此時該菌株產(chǎn)氫量最大.另外，該菌可以利用多種氮源和碳源產(chǎn)氫，對于以葡萄糖和木糖為主的農(nóng)作物秸稈水解液制氫具有很大應(yīng)用潛力.