GSTP-1基因遺傳變異對術(shù)后接受替莫唑胺聯(lián)合放療的腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響

趙克，倪峰，劉康棟

0 引言

腦膠質(zhì)瘤（Glioblastoma）起源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞，目前腦膠質(zhì)瘤在我國每年新發(fā)病例5萬人左右[1]。近年來，術(shù)后放療聯(lián)合替莫唑胺的耐藥機制以及探討對同步放化療敏感的生物標(biāo)志物是當(dāng)前腦膠質(zhì)瘤領(lǐng)域的研究熱點。

1.8～2.0Gy/次共計54～60 Gy仍然是目前治療高級別膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)劑量方案。另外，替莫唑胺具有廣譜的抗腫瘤活性，通過口服吸收，以接近100%的生物利用度進入全身血液循環(huán)，通過甲基化加成物的錯配修復(fù)發(fā)揮細胞毒作用[2]。因此，替莫唑胺同步放療成為術(shù)后高級別腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P-1（Glutathione S-Transferase P-1,GSTP-1）基因位于11q13.2，包含7個外顯子。在中國人群中，對該基因多態(tài)性的研究尚不多。研究發(fā)現(xiàn)，在接受同步放化療治療的高加索人群的膠質(zhì)瘤患者中，位于GSTP-1基因編碼區(qū)的Ile105Val位點和總生存期相關(guān)[3]，也有研究表明該位點與接受以鉑類為基礎(chǔ)的化療藥物引起的骨髓抑制顯著相關(guān)[4]。因此，本研究旨在探討GSTP-1基因遺傳變異對術(shù)后接受替莫唑胺聯(lián)合放療的腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響，并探討該位點和GSTP-1 mRNA表達的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究設(shè)計及治療方案

回顧性分析2010年1月—2018年6月河南省腫瘤醫(yī)院腦外科術(shù)后接受替莫唑胺聯(lián)合放療的腦膠質(zhì)瘤患者175例，入組標(biāo)準(zhǔn)：組織學(xué)確診為高級別膠質(zhì)瘤且接受手術(shù)切除治療；年齡≥18歲；ECOG評分0～2分；肝腎功能、血常規(guī)正常（中性粒細胞計數(shù)≥1.5×109/L，血小板計數(shù)≥100×109/L）。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤或嚴(yán)重疾病的患者；沒有接受術(shù)后替莫唑胺聯(lián)合放療的患者。主要研究終點為無進展生存期（PFS），次要終點為總生存期（OS）以及藥物基因組學(xué)分析。

放療的實施方案為：接受手術(shù)切除后6周以內(nèi)開始放療計劃，結(jié)合患者情況給予總劑量54 Gy或60 Gy，30次分割，1.8或2.0 Gy/次，每天1次，每周前5天，共計6周。替莫唑胺用法用量為：同步放療期間，和化療同一天開始，75 mg/m2每天，共計42天，治療過程中根據(jù)患者耐受情況可暫停用藥，但總服藥期不超過49天。同步放化療結(jié)束后4周，患者接受6周期的替莫唑胺單藥輔助化療，第1個周期150 mg/m2，隨后每周期200 mg/m2，第1～5天，28天一個周期。治療過程中根據(jù)患者的耐受情況調(diào)整替莫唑胺的治療周期。本研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，每個入組的患者或者家屬均簽署了知情同意書。根據(jù)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)進行療效評估。

1.2 標(biāo)本收集及基因分型

入組的患者在接受放化療前用EDTA抗凝管收集外周血樣本4 ml，用苯酚氯仿法提取基因組DNA，進行后續(xù)PCR擴增。GSTP-1基因Ile105Val（rs1695）位點的基因分型通過限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）方法進行。擴增包含該位點的PCR產(chǎn)物的上游引物為：5’-CCCCAGTGACTGTGTGTTGA-3’，下游引物為：5’-CAAGAAGCCCCTTTCTTTGT-3’。PCR產(chǎn)物大小為226 bp，通過限制性內(nèi)切酶Tail對產(chǎn)物進行孵育消化，通過條帶的大小判斷基因型。

1.3 PBMC樣本收集及GSTP-1 mRNA表達分析

從入組的175例患者中另外收集接受放化療前的新鮮外周血樣本，用來提取外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC），最終納入表達分析的PBMC標(biāo)本為78例，液氮保存。TRIzol試劑進行RNA提取，上游引物為：5’-GTAGTTTGCCCAAGGTCAAG-3’，下游引物為：5’-AGCCACCTGAGGGGTAAG-3’，擴增產(chǎn)物大小為498 bp。實時定量PCR反應(yīng)體系如下：SYBN Premix Ex Tag 溶液10 μl，GSTP-1上游引物（20 μmol/L）0.2 μl，下游引物（20 μmol/L）0.2 μl，ddH2O 7.6 μl，cDNA 2 μl，反應(yīng)體系總計20 μl，之后用羅氏Real-time PCR儀器進行GSTP-1 mRNA表達實驗，用相對定量法 2-ΔΔCt進行計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有變量均采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。在基線臨床資料當(dāng)中，離散型的變量和Ile105Val位點不同基因型的分布采用χ2檢驗。連續(xù)型的變量和該位點不同基因型的分析采用非參檢驗的Mann-Whitney U檢驗。用Stata14.0繪制Kaplan-Meier曲線比較不同基因型患者PFS和OS的差異，曲線間的差異用對數(shù)秩檢驗進行統(tǒng)計學(xué)差異的比較。PFS為患者接受手術(shù)切除治療的時間到出現(xiàn)腫瘤進展或者死亡的時間。OS為患者接受手術(shù)切除治療到死亡的時間。多變量分析時，對OS的多變量分析構(gòu)建Cox風(fēng)險比例模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基線臨床資料及GSTP-1 Ile105Val位點基因分型情況

納入研究的175例腦膠質(zhì)瘤患者的基線臨床資料見表1。Ile105Val位點的基因分型結(jié)果為：G/G型119例（68.00%），G/A型51例（29.14%），A/A型5例（2.86%），最小等位基因頻率為0.17，該位點基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.868）。由于A/A型患者較少，后期分析中將G/A型和A/A型患者合并。Ile105Val位點不同基因型患者在基線臨床資料中分布均衡。

表1 GSTP-1基因Ile105Val位點不同基因型的175例腦膠質(zhì)瘤患者的基線臨床資料Table1 Baseline characteristics of 175 glioblastoma patients according to GSTP-1 Ile105Val genotype status

2.2 GSTP-1基因Ile105Val位點對預(yù)后的影響

隨訪截至2018年10月，中位隨訪時間為29.5月（0.9～40月）。無進展生存期的分析，見圖1，攜帶A等位基因的G/A+A/A基因型和G/G基因型患者的中位無進展生存期（mPFS）分別為4.4和6.9月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.005）。

G/A+A/A型和G/G基因型患者的中位總生存期（mOS）分別為11.0和15.3月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖2。另外，為了校正其他混雜因素對OS的影響，本研究構(gòu)建了Cox風(fēng)險比例模型，將可能影響OS的風(fēng)險因素，如年齡、性別、ECOG評分（1～2分為一組）、WHO分級、放療劑量以及Ile105Val位點納入該模型。經(jīng)過多變量校正后結(jié)果，見表2，Ile105Val位點對OS仍然具有獨立的影響意義（OR=1.85,P=0.008）。另外其他的基線資料在Cox模型當(dāng)中對OS具有獨立影響意義的有年齡（OR=1.45,P=0.015）、ECOG評分（OR=2.11,P=0.011）、WHO分級（OR=0.45,P＜0.001）。

圖1 GSTP-1基因Ile105Val位點不同基因型的175例腦膠質(zhì)瘤患者的無進展生存曲線Figure1 PFS curves of 175 glioblastoma patients according to GSTP-1 Ile105Val genotype status

圖2 GSTP-1基因Ile105Val位點不同基因型的175例腦膠質(zhì)瘤患者的總生存期曲線Figure2 Overall survival curves of 175 glioblastoma patients according to GSTP-1 Ile105Val genotype status

表2 影響OS的基線臨床資料以及Ile105Val多態(tài)性位點的多變量Cox風(fēng)險比例模型Table2 Multivariate Cox regression analysis of baseline characteristics and Ile105Val polymorphism

2.3 GSTP-1基因Ile105Val位點對GSTP-1 mRNA表達的影響

在78例PBMC標(biāo)本中，G/G型53例，G/A型23例，A/A型2例，三種基因型分布頻率同樣符合哈迪溫伯格平衡（P=0.790）。A/A型患者相對較少，隨后的分析中將A/A型和G/A型合并，共計25例。G/A+A/A基因型相對于野生型的G/G型患者，PBMC中GSTP-1 mRNA的相對表達明顯較高（4.01±0.472vs.2.76±0.624），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖3。

圖3 78例PBMC樣本中GSTP-1基因Ile105Val位點不同基因型GSTP-1 mRNA相對表達情況Figure3 Relative GSTP-1 mRNA expression of 78 case of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) specimens according to GSTP-1 Ile105Val genotype status

3 討論

本研究通過對GSTP-1基因Ile105Val位點基因分型并和患者的預(yù)后進行關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)Ile105Val位點G/A+A/A基因型患者PFS和OS較差，另外在78例具有PBMC標(biāo)本患者的mRNA表達水平分析中發(fā)現(xiàn)，該位點不同的基因型患者GSTP-1 mRNA表達水平呈現(xiàn)較大的差異。結(jié)果表明Ile105Val位點可能通過影響GSTP-1 mRNA的表達進而影響術(shù)后接受替莫唑胺同步放療的腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后。

腦膠質(zhì)瘤是異質(zhì)性較強的惡性腫瘤，近年來給患者帶來生存獲益的治療進展較為緩慢。目前，研究結(jié)果表明最大安全切緣的手術(shù)切除可以進一步明確診斷，改善神經(jīng)功能癥狀并為術(shù)后輔助放化療提供有利條件[5]。另外，大量的證據(jù)表明術(shù)后同步放化療無論對于低級別還是高級別腦膠質(zhì)瘤患者均具有明顯的生存獲益[6]。然而術(shù)后腦膠質(zhì)瘤患者接受同步放化療在臨床治療結(jié)果和預(yù)后上也有較大的個體差異，明確影響術(shù)后放化療的預(yù)后因素有助于提高臨床治療腦膠質(zhì)瘤的整體療效。藥物基因組學(xué)方面目前已經(jīng)有較多預(yù)測腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的生物標(biāo)志物的研究成果：2018年報道的血管內(nèi)皮生長因子遺傳變異位點rs1005230和膠質(zhì)瘤的發(fā)病風(fēng)險和預(yù)后顯著相關(guān)[7]。2017年報道的MGMT基因啟動子區(qū)域的多態(tài)性位點rs1625649對甲基化的腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后具有顯著影響[8]。隨后報道的MC4R基因多態(tài)性rs489693位點在接受同步放化療的腦膠質(zhì)瘤患者中的療效有預(yù)測價值[9]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中國腦膠質(zhì)瘤患者接受同步放化療后，GSTP-1基因Ile105Val位點對患者預(yù)后具有明顯的影響。首先，本研究中Ile105Val位點的最小等位基因頻率為0.17，這和NCBI數(shù)據(jù)庫中中國人群中的突變頻率基本一致，但是從高加索人群的結(jié)果來看[10]，該位點的基因型分布頻率具有較大的種族差異。預(yù)后結(jié)果上，意大利Pasqualetti團隊的研究[3]納入50例IDH1/2基因野生型的接受同步放化療的腦膠質(zhì)瘤患者，分析了XRCC1、XRCC3、RAD51和GSTP-1基因多態(tài)性和PFS以及OS的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了GSTP-1基因rs1695位點A/A型患者預(yù)后較差，這和本研究中G/A+A/A基因型患者較差的預(yù)后基本一致。另外，在亞洲人群中，日本學(xué)者Yoshihama團隊[11]的研究納入了320例接受卡鉑聯(lián)合紫杉醇治療的婦科腫瘤患者，分析了GSTP-1基因rs1695位點對患者的預(yù)后及安全性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs1695位點GG型患者與較高的血液學(xué)毒性相關(guān)，另外A等位基因攜帶者具有較差的預(yù)后，這和本研究的結(jié)果基本一致，但是該研究并沒有評估此位點和GSTP-1 mRNA表達的關(guān)系。另外有研究發(fā)現(xiàn)，rs1695位點和接受順鉑為基礎(chǔ)的化療出現(xiàn)的不良反應(yīng)有關(guān)，法國Lui團隊[12]的研究納入了161例接受順鉑或卡鉑治療的兒童腫瘤患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs1695位點A/A基因型患者和較多的耳毒性顯著相關(guān)，這說明了該位點會對化療藥物有一定的作用，本研究未評估該位點和不良反應(yīng)的關(guān)聯(lián)，需進一步探索。

GSTP-1基因是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族中的一員，通過催化許多疏水和親電化合物與還原型谷胱甘肽的結(jié)合進而發(fā)揮生物解讀或生物轉(zhuǎn)化的作用[13]。Ile105Val位點為非同義突變，位于該基因編碼區(qū)改變了氨基酸序列，可能會影響GSTP-1基因表達以及GSTP-1蛋白的功能。關(guān)于GSTP-1基因表達水平和患者預(yù)后目前尚沒有統(tǒng)一結(jié)論，目前有研究報道了GSTP-1在結(jié)直腸癌等腫瘤中為高表達狀態(tài)[14]。Theisen團隊的研究納入32例晚期食管癌患者，通過分析GSTP-1基因表達狀態(tài)和治療反應(yīng)率的相關(guān)性后發(fā)現(xiàn)，GSTP-1表達較低的患者具有較好的預(yù)后[15]。這和本研究mRNA表達分析的結(jié)果具有一致的趨勢。GSTP-1基因在膠質(zhì)瘤細胞外源性物質(zhì)解毒過程中具有重要作用，因此阻止了外源性物質(zhì)和胞內(nèi)蛋白核酸的相互作用。早前有研究表明谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族的蛋白在很多藥物耐藥的細胞系中具有較多的表達[16]。因此，GSTP-1蛋白阻止了替莫唑胺和腫瘤細胞核酸的結(jié)合從而使其部分損失了細胞毒作用，因此較高的GSTP-1表達通常會伴隨著較差的替莫唑胺療效及預(yù)后。

本研究也有局限性，首先納入研究的樣本量不大。另外，研究為回顧性的分析有一些偏倚無法避免。但本研究相對充分地對GSTP-1基因Ile105Val位點的預(yù)后影響意義進行了評估，同時也從mRNA表達層面揭示了該位點造成預(yù)后差異的部分原因，對術(shù)后接受替莫唑胺聯(lián)合放療的腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后評估具有一定的臨床指導(dǎo)意義。