中藥“心肌一號”在動員干細胞治療心肌損傷過程中對炎癥反應的干預

馬元 屈百鳴 車賢達 徐強 俞堅武 張慶剛 王利宏 盛蘭

1.浙江省人民醫(yī)院 杭州 310014 2.杭州醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院 3.浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院

各種原因（如急性心肌缺血）引起的心肌損傷可導致心臟結構異常和功能障礙，甚至引發(fā)患者死亡，傳統(tǒng)的治療方式雖能改善癥狀，但不能挽救壞死心肌。干細胞具有增殖能力和多向分化潛力，能夠從根本上增加有功能的心肌細胞的數(shù)量，進而改善心功能，因此干細胞治療為缺血性心臟病的治療開辟了新的途徑[1-6]。干細胞動員劑能夠動員骨髓干細胞，提高外周血干細胞數(shù)量，推動干細胞向受損心肌歸巢和橫向分化，被稱為體內(nèi)自身移植。這一過程由骨髓動員、歸巢、轉(zhuǎn)化三個階段組成，干細胞動員劑主要干預第一階段?！靶募∫惶枴笔怯牲S芪、麥冬、茯苓、佩蘭、防風、大棗共6味中藥組成的經(jīng)驗復方，課題組前期實驗中已證實其具有與干細胞動員劑粒細胞集落刺激因子相似的作用[7]，但對干細胞歸巢的影響尚不明確。本研究擬探討心肌損傷后“心肌一號”在干細胞體內(nèi)自身移植第二階段中的作用機制，即對炎癥反應的干預，力求使“心肌一號”更好地應用于心肌損傷后的治療，彌補粒細胞集落刺激因子在干細胞體內(nèi)自身移植第二、三階段中可能存在的不足。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性清潔級SD大鼠30只，8周齡，體質(zhì)量200～250g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002]，由杭州師范大學實驗動物中心提供，動物飼養(yǎng)和實驗研究由杭州師范大學實驗動物中心和浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心協(xié)同完成。

1.2 藥品及試劑 異丙基腎上腺素購于上海禾豐制藥有限公司（批號：41160301）；中藥“心肌一號”由浙江省人民醫(yī)院中藥房提供；基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）及其配體CX-C基序趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4） 酶聯(lián) 免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測試劑盒購于ELISA Genie公司（批號：RTFI01117、RTFI01297）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-4（interleukin-4，IL-4）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA 試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司（批號：EK0526、EK0412、EK0406、EK0418）；SDF-1、CXCR4、TNF-α、IL-10多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司（批號：BA1389、PA1237、BA0131、A00021-2）。

1.3 急性心肌缺血模型的建立和分組 30只SD大鼠分別腹腔注射異丙基腎上腺素（5mg/kg），48h后隨機分為治療組、對照組、模型組3組，每組10只。模型組即刻處死后觀察心肌組織，心內(nèi)膜見彌散的白色點狀缺血灶表示造模成功[8]。

1.4 藥物處理 模型建立后，治療組每天同一時間給予“心肌一號”14g/kg（生藥量）灌胃，連續(xù)灌胃28d；對照組每天同一時間以等量0．9%氯化鈉溶液灌胃。

1.5 外周血炎癥及趨化因子測定 灌胃第7天和第28天采集兩組大鼠尾靜脈血，離心取上層血清，采用ELISA 法檢測 SDF-1、CXCR4、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平。

1.6 心肌組織學觀察 第28天尾靜脈取血后，以戊巴比妥麻醉，15%氯化鉀溶液靜脈注射處死大鼠，使大鼠心臟處于舒張期停搏狀態(tài)。2%多聚甲醛灌注后分離心臟，固定、脫水、包埋劑包埋后制成冷凍切片。HE染色后，200倍顯微鏡下計數(shù)單個視野中毛細血管數(shù)，每張切片選5個視野取平均值。Masson染色后，400倍顯微鏡下采用Image Pro Plus 6．0軟件定量分析單個視野纖維化面積，每張切片選5個視野取平均值。

1.7 免疫組化分析 標本取材處理同1．6，免疫組化染色后，100倍顯微鏡下采用Image Pro Plus 6．0軟件定量分析單個視野染色程度，以灰度值表示SDF-1、CXCR4、TNF-α、IL-10 和膠原的表達水平，每張切片選3個視野取平均值。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 14．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠外周血炎癥及趨化因子水平比較 至灌胃28d結束，對照組大鼠死亡1只。第7天和第28天兩組大鼠 TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10 水平部分太低無法測出，故未進行統(tǒng)計；第7天兩組大鼠SDF-1、CXCR4 水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），第 28天治療組SDF-1水平低于對照組、CXCR4水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05，P＜0．01）。見表 1。

表1 兩組大鼠外周血趨化因子水平比較（x±s）Tab.1 Comparison of chemotactic factors in peripheral blood of rats in each group(±s)

表1 兩組大鼠外周血趨化因子水平比較（x±s）Tab.1 Comparison of chemotactic factors in peripheral blood of rats in each group(±s)

注：與對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01Note：Compared with control group,*P＜0．05,**P＜0．01

第28天SDF-1（pg·mL-1） CXCR4（ng·mL-1） SDF-1（pg·mL-1） CXCR4（ng·mL-1）治療組對照組組別 第7天images/BZ_67_1433_2810_1462_2858.png145．278±31．528 162．590±14．958 1．737±0．498 1．705±0．367 195．506±24．686*225．274±30．030 1．562±0．259**0．511±0．058

2.2 兩組大鼠心肌毛細血管密度和纖維化面積比較第 28 天治療組大鼠心肌毛細血管密度（2．76±2．471）條，與對照組（2．62±2．543）條比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；治療組大鼠心肌纖維化面積（1．64±1．590）×104像素小于對照組（5．12±4．963）×104像素，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。見圖 1、2。

圖1 第28天兩組大鼠心肌毛細血管密度比較（HE染色，200×）Fig．1 Comparison of myocardial capillary density in each group on the 28th day(HE stain,200×)

圖2 第28天兩組大鼠心肌纖維化面積比較（Masson染色，400×）Fig．2 Comparison of myocardial fibrosis area in each group on the 28th day(Masson stain,400×)

2.3 兩組大鼠心肌炎癥及趨化因子水平比較 第28天治療組大鼠心肌SDF-1、CXCR4、IL-10水平高于對照組，而心肌TNF-α水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。見表 2、圖 3。

3 討論

表2 第28天兩組大鼠心肌炎癥及趨化因子免疫組化陽性面積比較（±s，像素）Tab.2 Comparison of positive area through immunohistochemical stain in myocardial inflammatory and chemotactic factors in each group on the 28th day±s,pixel)

表2 第28天兩組大鼠心肌炎癥及趨化因子免疫組化陽性面積比較（±s，像素）Tab.2 Comparison of positive area through immunohistochemical stain in myocardial inflammatory and chemotactic factors in each group on the 28th day±s,pixel)

注：與對照組比較，**P＜0．01Note：Compared with control group,**P＜0．01

組別 TNF-α（×103） IL-10（×104） SDF-1（×105） CXCR4（×104）治療組對照組2．00±1．905**28．87±21．505 29．83±15．442**1．89±1．867 20．07±8．479**4．87±0．324 3．61±1．341**1．49±0．877

所有組織損傷（包括心肌損傷）后，損傷部位釋放炎癥因子和趨化因子[9]，這些因子對于干細胞歸巢至關重要。炎癥因子包括促炎因子，如TNF-α、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 等；抗炎因子，如 IL-4、IL-10等，對炎癥反應起調(diào)控作用。趨化因子誘導干細胞從外周血向受損心肌遷移，主要通過SDF-1及其配體CXCR4組成的SDF-1/CXCR4軸發(fā)揮作用[10]。有些細胞因子同時具備炎癥因子和趨化因子的作用，如TNF-α[11]。適當?shù)难装Y反應有利于清除壞死細胞，形成新生血管，但過度的炎癥反應在加速心臟重構的同時，還會影響干細胞在受損心肌的定植，而心肌損傷常伴隨免疫系統(tǒng)的過度激活[12-13]，導致過度的炎癥反應。與此同時，抗炎治療往往又容易抑制正常的炎癥反應，同時削弱趨化作用。因此，對干細胞歸巢的干預，亦即對炎癥因子和趨化因子的干預。

圖3 第28天兩組大鼠心肌炎癥及趨化因子水平比較（100×）Fig．3 Comparison of level of myocardial inflammatory factors and chemotactic factors in each group on the 28th day(100×)

“心肌一號”是由黃芪、麥冬、茯苓、佩蘭、防風、大棗共6味中藥組成的經(jīng)驗復方，具有補氣升陽、利水滲濕、補中益氣、活血化瘀等功效。在筆者所在科室，該藥物已經(jīng)被用于擴張型心肌病、心力衰竭的臨床治療，并已被臨床證實能夠延緩心臟擴大，提高左室射血分數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪等中藥具有抑制炎癥反應的作用，機制包括減輕炎癥細胞浸潤、調(diào)控炎癥相關細胞因子、減少黏附分子表達、抑制核轉(zhuǎn)錄因子活性等[14-16]。筆者團隊前期研究結果顯示，“心肌一號”具有正向調(diào)節(jié)SDF-1/CXCR4軸的作用[17]，而且能夠促進骨髓間充質(zhì)干細胞生成和釋放，其作用與粒細胞集落刺激因子類似[7]。因此本研究進一步考察“心肌一號”調(diào)節(jié)炎癥反應的作用，探究“心肌一號”調(diào)節(jié)炎癥反應的同時對趨化作用有何影響，以及以上作用在干細胞歸巢、心肌修復過程中的具體體現(xiàn)。

一般認為，心肌損傷后炎癥反應在7d內(nèi)達到最強；前期研究則提示，以用藥第28天作為評估“心肌一號”療效的時間點是合適的。通過對兩組大鼠第7天和第28天的外周血檢測發(fā)現(xiàn)，炎癥因子水平部分太低無法測出，故未進行統(tǒng)計，但觀察原始數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，“心肌一號”對心肌損傷后外周血炎癥因子的實際影響并不大（至少不存在成倍增減的情況）。第28天治療組外周血趨化因子SDF-1水平顯著低于對照組、CXCR4顯著高于對照組，故SDF-1/CXCR4總體變化可能并不大，而心肌免疫組化染色以及圖像分析提示治療組趨化因子SDF-1、CXCR4水平均顯著高于對照組，這與Li等[18]研究顯示的趨化因子在受損組織局部-外周血中應成梯度關系一致。免疫組化染色以及圖像分析還提示，第28天治療組促炎癥因子TNF-α水平顯著低于對照組，而抗炎癥因子IL-10顯著高于對照組，說明在受損心肌局部，促炎癥因子受到抑制而抗炎癥因子釋放增多。組織學觀察提示兩組大鼠毛細血管密度差異無統(tǒng)計學意義，而治療組心肌纖維化面積較對照組顯著減少，與預期大致相符。

綜上所述，“心肌一號”在損傷心肌局部有效抑制炎癥反應，同時明顯升高趨化因子濃度，作用強于外周血中，可能的機制是心肌細胞對“心肌一號”具有高度敏感性，當然也不能排除外周血容量大、細胞因子濃度低及檢測方法等因素對結果造成的干擾。對于急性心肌損傷高炎癥反應狀態(tài)而言，“心肌一號”抑制促炎癥效應、促進抗炎癥效應，使心肌纖維化范圍相對縮小，但促進干細胞在受損心肌定植的趨化作用反而增強，且并不影響心肌新生血管的形成，總體療效較理想?！靶募∫惶枴睖p弱炎癥反應，但總體結果與炎癥反應減弱-趨化作用下降、炎癥反應減弱-新生血管形成減少的常規(guī)關系[12,19]不相符，這可能需要用“心肌一號”獨立于炎癥反應外的其他作用機制來解釋。“心肌一號”最終使急性心肌損傷的炎癥反應調(diào)控于一個合理水平，體現(xiàn)了中藥復方不同藥效物質(zhì)群由“調(diào)”至“平”的系統(tǒng)效應。當然，本研究存在選取的炎癥因子及趨化因子種類偏少、觀察時間點偏少等不足之處，有待今后進一步研究深入探討。