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    不同性別PyMT自發(fā)性乳腺癌小鼠成瘤特點和不同時間肺轉(zhuǎn)移觀察

    2019-11-26 06:13:46郎佳麗金璐邵霞曹貝貝嚴(yán)楷蕾傅惠英壽旗揚(yáng)
    關(guān)鍵詞:雌性雄性周齡

    郎佳麗金璐邵霞曹貝貝嚴(yán)楷蕾傅惠英壽旗揚(yáng)

    1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 3.湖州市中心醫(yī)院

    在女性癌癥發(fā)病率中,乳腺癌的發(fā)病率是首屈一指的[1]。雖然治愈率較高,但仍是重要的致死因素。因此如何進(jìn)一步研究乳腺癌靶向藥物、藥物作用的機(jī)理及相應(yīng)的臨床治療手段日益受到廣泛重視[2]。在研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)特征、藥物及治療方法中,乳腺癌動物模型功不可沒。在生物學(xué)、病理學(xué)和組織學(xué)上越貼近人乳腺癌指標(biāo)的動物模型,提供的實驗結(jié)果越是客觀準(zhǔn)確[3-4],其應(yīng)用范圍就越廣泛[5]。

    目前已建立了多種乳腺癌模型,如誘發(fā)性、移植性、自發(fā)性以及乳腺癌轉(zhuǎn)基因?qū)嶒瀯游锬P蚚6]。但誘發(fā)性和移植性乳腺癌模型在實驗過程中具有明顯的缺點:誘導(dǎo)乳腺腫瘤模型其乳腺癌性質(zhì)和發(fā)病程度受脂肪消耗的影響,同時存在建模耗時長、癌癥發(fā)生率不高及轉(zhuǎn)移性低等多種弊端[7-9]。相比之下,以小鼠乳腺腫瘤病毒啟動子(mouse mammary tumor virus,MMTV)控制下表達(dá)多瘤中間T抗原(polyoma middle T-antigen,PyMT)的轉(zhuǎn)基因自發(fā)性乳腺癌小鼠具有與人體腫瘤病理相似、試驗周期短、癌癥自發(fā)率良好、成瘤時間短和試驗現(xiàn)象明顯[10-12]等客觀優(yōu)點而被選為研究乳腺癌的經(jīng)典模型。故本實驗采用MMTV-PyMT乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象來觀察在完整生命周期內(nèi)不同性別、不同周齡下的癌癥發(fā)展過程與病理變化指標(biāo),以研究該模型的客觀規(guī)律,為乳腺癌藥物篩選及治療方法更新提供研究思路。

    1 材料

    1.1 實驗動物 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson實驗室,品系名為FVB/N-Tg(MMTV-Py VT)634Mul/J。保種培育后,選取SPF級雌性PyMT小鼠10只,雄性PyMT小鼠5只,雌性FVB小鼠5只,共20只(15雌,5雄),均為8周齡,飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心屏障實驗室[(浙)2013-0184];環(huán)境溫度:(22±1)℃;相對濕度 50%~60%;光照 12小時明暗交替;噪音:<50dB;小鼠飼養(yǎng)于IVC中,自由飲食;在實驗過程中遵循3R原則給予實驗動物人道主義關(guān)懷。

    1.2 儀器及試劑

    1.2.1 主要儀器 Bayer2120全自動血液細(xì)胞分析儀(德國西門子公司),PCR儀(美國Bio-Rad伯樂),Tanon-2500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析儀(上海天能科技有限公司),ASP200S全自動脫水機(jī)、半自動切片機(jī)(德國Leica公司),AP280-2包埋機(jī)(德國MICROM公司),NanoZoomer 2.0 RS數(shù)字切片掃描儀(日本濱松光子公司)。

    1.2.2 主要試劑 Taq 酶、dNTP Mixture、MgCl2、5×buffer、DNA marker、6×loading buffer等均購自 Takara公司,Biowest瓊脂糖粉購自北京艾普立邦科技有限公司,Gelreg凝膠核酸染料購自美國BIOTIUM公司。

    1.3 方法

    1.3.1 保種及擴(kuò)群 從Jackson實驗室購買的乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因雄性小鼠即轉(zhuǎn)基因PyMT小鼠(+)與正常雌性小鼠FVB(-)合籠配種,通常1:2比例雜交。子代剪尾提取DNA,提取小鼠DNA后,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物序列分別為:5'-CAA ATG TTG CTT GTC TGG TG-3':5'-gTC AGTCGA GTG CAC AGT TT-3':5'-GGA AGC AAG TACTTC ACA AGG g-3':5'-GGA AAG TCA CTA GGAGCA GGG-3'。反應(yīng)條件為:94℃變性 2min;94℃ 20s,64℃ 1min,72℃ 1min,35個循環(huán);72℃ 2min充分延伸,擴(kuò)增產(chǎn)物為556bp?;蛐丸b定后,選取雄性PyMT小鼠與雌性FVB小鼠全同胞兄妹交配,進(jìn)行擴(kuò)群,繼續(xù)通過以上鑒定方法篩選實驗小鼠。

    1.3.2 一般觀察 每天觀察雄性與雌性PyMT小鼠的腫瘤是否長出,記錄腫瘤發(fā)病時間;每周記錄體重變化,并用小鼠游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小,觀察腫瘤生長趨勢、特征的變化。瘤體積計算:V=(長徑×短徑2)/2。

    1.3.3 雄性與雌性小鼠生存率及生存時間比較 每天觀察雄性與雌性PyMT小鼠的精神狀態(tài)與腫瘤生長情況,且觀察是否有死亡情況并記錄其自然死亡時間。

    1.3.4 血常規(guī)檢測 觀察雌性MMTV-PyMT小鼠腫瘤生長8周后,利用CO2實行安樂死。心臟取適量血液于2ml抗凝管中,血常規(guī)檢測42項指標(biāo),對其中以下7項指標(biāo)進(jìn)行比較:白細(xì)胞(white blood cell,WBC)、淋巴細(xì)胞(lymphcyte,LYMPH)、嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils,EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞(basophil granule,BASO)、中性粒細(xì)胞(granulocyte,NUET)、單核細(xì)胞(monocyte,MONO)和未染色大細(xì)胞(large unstained cell,LUC)數(shù)量。

    1.3.5 病理檢測 PyMT雌性小鼠與FVB雌性小鼠分別觀察4周、8周后,取完整肺觀察拍照,保存于10%甲醛溶液中,過夜固定,48h后取材,進(jìn)行常規(guī)的脫水包埋后,用石蠟切片機(jī)將蠟塊切成4μm的薄片,進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,用NanoZoomer數(shù)字切片掃描儀對切片進(jìn)行成像掃描,并用NDP.view軟件分析其病理變化。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±standard errors of mean,SEM)表示,用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,兩樣本間采用t檢驗,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.001表示差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定圖 經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增后,加入 2μL 6×loading buffer,混勻,上樣 10μL 于1.5%瓊脂糖凝膠上樣孔中,電泳30min后,結(jié)果如圖1中所示,MMTV-PyMT陽性小鼠基因檢測條帶為556bp,由此推斷樣本2、4和9均為MMTV-PyMT陽性小鼠,樣本 1、3、4、5、6、7、8 和 10 無條帶,為MMTVPyMT陰性小鼠即FVB小鼠。

    2.2 雌性與雄性鼠腫瘤生長趨勢比較 如圖2B、2D中所示,乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠無論雌雄均會自發(fā)性出現(xiàn)腫瘤。雌性小鼠組在第8周出現(xiàn)可捫及的腫瘤,雄性組則在第18周出現(xiàn)可捫及的腫瘤,雌性小鼠出現(xiàn)腫瘤時間遠(yuǎn)早于雄性小鼠,且雌性小鼠模型組腫瘤發(fā)展速度較雄性鼠快。隨著時間的推移,腫瘤的體積逐漸增大,數(shù)目增多。如圖2A、2C所示,兩組體重均呈現(xiàn)穩(wěn)定增長的趨勢。

    圖1 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定圖Fig.1 Genotypic identification of MMTV-PyMT mice

    圖2 乳腺癌MMTV-PyMT小鼠腫瘤生長情況與體重變化Fig.2 Changes of tumor growth and body weight of MMTV-PyMT mice

    2.3 雌性與雄性鼠生存率及生存時間比較 如圖3所示,在觀察雄性與雌性小鼠生存率和生存時間的實驗中,雌鼠最早死亡發(fā)生在16周,于第20周全部死亡,而雄鼠組最早死亡發(fā)生在38周,于第46周全部死亡。

    2.4 雌性MMTV-PyMT與FVB小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較 在雌性MMTV-PyMT與FVB小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較中,如圖4A中所示,雌性PyMT的 WBC數(shù)量明顯高于FVB小鼠,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。白細(xì)胞分類中,如圖4B、4C、4F、4G中所示,PyMT小鼠的 NUET、LYMPH、BASO及 LUC數(shù)量均明顯高于FVB 小鼠,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。如圖 4E、4D中所示,PyMT小鼠的EOS也顯著高于FVB小鼠,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而 PyMT 小鼠的 MONO 數(shù)量高于FVB小鼠,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    圖3 雌性與雄性鼠生存時間比較Fig.3 Comparison of survival time between female and male mice

    圖4 雌性MMTV-PyMT與FVB小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較Fig.4 Comparison of blood routine indexes between MMTV-PyMT and FVB of female mice

    2.5 腫瘤肺轉(zhuǎn)移情況 如圖5所示,F(xiàn)VB小鼠肺部表面平整邊緣光滑,顏色淡紅色無異常充血;PyMT小鼠16周時肺部表面出現(xiàn)若干卵石狀分布且充血暗紅的瘤體,說明該小鼠肺部出現(xiàn)嚴(yán)重的腫瘤轉(zhuǎn)移。

    如圖6所示,肺HE染色結(jié)果顯示PyMT小鼠12周齡時肺泡結(jié)構(gòu)部分被破壞,肺組織中大量炎癥細(xì)胞浸潤,氣管璧增厚,某些小鼠開始出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移。PyMT小鼠16周齡時肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重的肺轉(zhuǎn)移,出現(xiàn)彌漫性分布,大小不等、質(zhì)實、染色深的癌巢,呈非典型增生,導(dǎo)管受壓變窄,細(xì)胞間推擠或重疊,細(xì)胞大小形態(tài)不同,偶爾可見核分裂現(xiàn)象;腫瘤細(xì)胞排列紊亂,失去正常的結(jié)構(gòu)和層次,胞核增大,核分裂增多。

    3 討論

    在小鼠乳腺癌病毒(mouse mammary tumor virus,MMTV)的轉(zhuǎn)錄控制下,特異性表達(dá)活化的neu酪氨酸激酶長鏈重復(fù)(long terminal repeat,LTR),形成于整個乳腺上皮細(xì)胞有關(guān)的腺癌[15]。影響neu酪氨酸激酶活性的另一因素是多瘤病毒(polyoma virus,PyV)中的T抗原。新生小鼠感染PyV會導(dǎo)致大量上皮細(xì)胞和間質(zhì)腫瘤的形成,其中乳腺癌占據(jù)相當(dāng)大比例。將上述兩個基因融合整合到小鼠的基因組中,即為乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠的建立[16]。乳腺上皮中PyMT中T癌基因轉(zhuǎn)化特性的分析提供了對惡性進(jìn)展過程的重要啟示。在四種獨立的MMTV/中T轉(zhuǎn)基因小鼠中,轉(zhuǎn)基因的表達(dá)最終導(dǎo)致了乳腺上皮的形態(tài)轉(zhuǎn)化,進(jìn)一步證實了乳腺中T抗原的潛在致癌潛力。

    圖5 乳腺癌MMTV-PyMT小鼠肺部觀察(100×)Fig.5 Observation of lung tissue in MMTV-PyMT mice(100×)

    圖6 乳腺癌MMTV-PyMT小鼠肺組織HE染色圖(100×)Fig.6 HE staining of lung tissue in MMTV-PyMT mice(100×)

    本實驗在乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠完整生命期中,系統(tǒng)地觀察記錄腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。雌性PyMT小鼠約在第8周開始出現(xiàn)可測量的腫瘤,隨著小鼠周齡的增加,小鼠體重逐漸增大,同時小鼠的瘤數(shù)目與瘤體積同樣呈現(xiàn)出上升的趨勢,且實驗結(jié)果顯示15周時瘤鼠開始出現(xiàn)死亡,到20周小鼠全部死亡。而雄性鼠約在第18周開始出現(xiàn)可測量的腫瘤,比雌性鼠發(fā)病時間晚,生存時間長,導(dǎo)致實驗周期長,因此較雄性PyMT小鼠而言,雌性PyMT小鼠是研究乳腺癌發(fā)展及轉(zhuǎn)移良好的動物模型。

    白細(xì)胞分為顆粒細(xì)胞與無顆粒細(xì)胞,顆粒細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞及嗜堿性細(xì)胞,無顆粒細(xì)胞包括單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞。中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的主要驅(qū)動者。中性粒細(xì)胞除了釋放細(xì)胞因子和趨化因子,還能促進(jìn)腫瘤生長和侵襲[17]。已有文獻(xiàn)證明乳腺癌組織中有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤[18]。單核細(xì)胞釋放到組織中成為巨噬細(xì)胞,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可使腫瘤細(xì)胞免受CD8+細(xì)胞殺傷[19]、維持免疫抑制微環(huán)境[20]、減少抗原遞呈和阻礙T細(xì)胞增殖[21]。淋巴細(xì)胞可識別腫瘤細(xì)胞表面抗原,其數(shù)量的增加或與腫瘤細(xì)胞入侵有關(guān)。本實驗血常規(guī)檢測中發(fā)現(xiàn),雌性PyMT小鼠白細(xì)胞及亞群(除單核外)數(shù)量均明顯高于FVB小鼠,產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致這種結(jié)果的原因可能是腫瘤感染或者是腫瘤細(xì)胞不可控地分泌一些激素或者因子,促進(jìn)白細(xì)胞的生成或抑制其凋亡等,但越來越多的實驗結(jié)果證實炎癥促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移,腫瘤微環(huán)境可趨化募集巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞以及白細(xì)胞等[22-23]。

    雌性PyMT小鼠12周齡及16周齡肺部病理切片也顯示在腫瘤細(xì)胞侵襲肺部時會募集大量的炎癥細(xì)胞浸潤肺部組織,其中雌鼠12周時腫瘤細(xì)胞入侵肺部,而16周時已檢測到發(fā)生明顯的肺轉(zhuǎn)移,有文獻(xiàn)報道11周左右開始出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移瘤,已有多篇文章報道此種自發(fā)性乳腺癌出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移現(xiàn)象[24-25],與本實驗結(jié)果一致。

    綜上所述,雖然乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病機(jī)制與人體的發(fā)病機(jī)制有所不同,但其自然的發(fā)病過程與人體相似,可從動物、細(xì)胞、分子等不同層面了解乳腺癌,是篩選抑制腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移等藥物良好的乳腺癌模型。在多方面可為臨床研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)理提供思路,同時在預(yù)防、治療乳腺癌疾病上有一定參考意義。本研究與其他文獻(xiàn)不同之處在于從乳腺癌模型實驗動物性別選擇的角度出發(fā),乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因雌性小鼠相較于雄性小鼠發(fā)病早、轉(zhuǎn)移快、生存周期短,有利于節(jié)省實驗時間及物資,大力度篩選高效抗腫瘤藥物,同時也減少了乳腺癌自發(fā)性模型腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、死亡等關(guān)鍵時間點的偏差。此外,乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因雌性小鼠和普通FVB小鼠比較,血液中白細(xì)胞總數(shù)及白細(xì)胞各個不同分類細(xì)胞數(shù)量均有上升,說明腫瘤與炎癥反應(yīng)密不可分;比較乳腺癌MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因雌性小鼠12周齡及16周齡肺部病理結(jié)果,也可以觀察到在腫瘤細(xì)胞侵襲肺部組織時產(chǎn)生的炎癥反應(yīng),為該模型腫瘤發(fā)生及肺轉(zhuǎn)移觀察提供參考。

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