地下滴灌條件下不同接種處理對(duì)苜蓿根瘤菌的定殖、結(jié)瘤和固氮的影響

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(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052； 2. 新疆自治區(qū)高校農(nóng)林有害生物監(jiān)測(cè)與安全防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 烏魯木齊 830052； 3. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

西北干旱、半干旱區(qū)是我國苜蓿集中種植區(qū)，面積占全國種植面積的78.5%[1]。苜蓿是一種高耗水作物，水資源短缺、栽培粗放、生產(chǎn)水平低，嚴(yán)重制約了苜蓿生產(chǎn)的規(guī)模與效益。傳統(tǒng)苜蓿栽培采用大水漫灌，不僅地面蒸發(fā)損失嚴(yán)重，還造成植株受淹后根系呼吸受阻，不定根減少，直接影響根瘤菌的侵染結(jié)瘤和固氮效率[2-3]。地下滴灌是通過鋪設(shè)于地下的毛管將水分?jǐn)U散到根系層供作物吸收的新興、高效節(jié)水的微灌技術(shù)，近年來開始應(yīng)用于苜蓿生產(chǎn)中。試驗(yàn)證明在干旱區(qū)苜蓿生產(chǎn)中地下滴灌能提高水分利用率，增產(chǎn)效果顯著[4-5]。

研究表明，接種優(yōu)良根瘤菌能促進(jìn)苜蓿早結(jié)瘤、多結(jié)瘤，增加固氮量，是降低氮肥投入，促進(jìn)苜蓿高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，提質(zhì)增效的重要舉措[6]。根據(jù)不同地域的氣候環(huán)境特點(diǎn)和生產(chǎn)模式，篩選相匹配的優(yōu)良菌株，建立適宜的接種技術(shù)，促進(jìn)根瘤菌在土壤繁殖存活、穩(wěn)定定殖和高效結(jié)瘤是發(fā)揮其固氮功能的關(guān)鍵。地下滴灌模式下的苜蓿生產(chǎn)，改變了灌溉制度和施肥管理措施，由此引發(fā)土壤水分分布格局、運(yùn)移規(guī)律[7]，苜蓿生長性狀和根系分布特征發(fā)生改變[8]，必然會(huì)對(duì)根瘤菌的存活定殖、競爭結(jié)瘤和固氮功能產(chǎn)生影響，將直接關(guān)系到根瘤菌的接種效果。目前，對(duì)根瘤菌的應(yīng)用研究多集中在常規(guī)灌溉模式下, 對(duì)地下滴灌條件下苜蓿接種根瘤菌的定殖、結(jié)瘤和固氮功能的研究少見報(bào)道。

本研究在前期工作中已篩選獲得固氮活性高、抗逆性能強(qiáng)的優(yōu)良苜蓿根瘤菌菌株的基礎(chǔ)上，采用綠色熒光蛋白報(bào)告基因(GFP)標(biāo)記菌株，原位研究在地下滴灌條件下，不同接種處理的根瘤菌在苜蓿根際的存活定殖、結(jié)瘤動(dòng)態(tài)和固氮性能，為構(gòu)建苜蓿根瘤菌應(yīng)用技術(shù)體系，充分發(fā)揮根瘤菌的高效固氮功能，促進(jìn)干旱區(qū)苜蓿產(chǎn)業(yè)的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2015年在呼圖壁縣種牛場新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草地生態(tài)試驗(yàn)站進(jìn)行。試驗(yàn)站位于呼圖壁河右岸沖洪積扇緣與沖積平原交錯(cuò)地帶，地理位置44°15′ N，86°55′ E，海拔439～454 m，年降水量155.2 mm，年蒸發(fā)量2 300 mm，冬季有積雪，生長季(4～9月)平均氣溫18.5℃，無霜期165～190 d。小區(qū)試驗(yàn)地為耕種多年的農(nóng)田，土壤為輕度鹽漬化灰鈣土。前茬作物為蘇丹草，灌溉方式為地下滴灌。

1.2 根瘤菌菌株

苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)XGL026菌株，是課題組在前期研究中從新疆紫花苜蓿根瘤中分離、篩選出的固氮活性高、抗逆性強(qiáng)、具有促生性能的苜蓿根瘤菌株。S.melilotiXGL026-GFP菌株：課題組前期研究中采用三親本雜交法對(duì)供試XGL026菌株進(jìn)行GFP基因的標(biāo)記，構(gòu)建出的遺傳性能穩(wěn)定、在熒光顯微鏡下發(fā)出明亮的綠色熒光、兼具四環(huán)素抗性(Tetr10 μg·mL-1)，對(duì)苜蓿的共生結(jié)瘤、生長性狀無明顯影響的標(biāo)記功能菌株。

1.3 供試苜蓿品種

‘新牧一號(hào)’紫花苜蓿，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院提供。

1.4 培養(yǎng)基及營養(yǎng)液

根瘤菌培養(yǎng)采用YMA培養(yǎng)基[9]。苜蓿沙培培養(yǎng)采用無氮營養(yǎng)液(g·L-1)[9]：MgSO40.49 g；KH2PO40.5 g；MnCl20.001 g；H3BO30.001 g；ZnSO40.001 g；鉬酸鈉0.001 g；CuSO40.0001 g；Na2Fe EDTA 0.02 g；蒸餾水1 000 mL。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在苜蓿打草試驗(yàn)地進(jìn)行。地下滴灌系統(tǒng)為苜蓿建植當(dāng)年鋪設(shè)，采用主管+支管+毛管系統(tǒng)，主管道直徑90 mm，支管道直徑63 mm，毛管為迷宮式，直徑12.5 mm，毛管鋪設(shè)行距60 cm，埋管深度10 cm。以地下井水為水源，滴頭標(biāo)定流量1.38 L·h-1。苜蓿于2015年4月22日播種，行距30 cm，播種量4.5 kg·hm-2，不施化肥，播后灌出苗水。接種根瘤菌試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理(表1)。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每處理3次重復(fù)，共21個(gè)小區(qū)。小區(qū)面積25.9 m2(3.7 m×7 m)。每茬苜蓿均于返青期、分枝期和現(xiàn)蕾期共滴灌3次，每次滴水時(shí)間24 h，10月23日冬灌。分別于2015年7月3日、8月17日和10月11日，苜?，F(xiàn)蕾期刈割3次。常規(guī)田間管理，適時(shí)澆水，除草等。

表1 地下滴灌苜蓿接種根瘤菌的小區(qū)試驗(yàn)處理Table 1 Plots trial treatments of inoculation rhizobium in alfalfa field under subsurface drip irrigation

1.6 根瘤菌接種液

活化根瘤菌菌種，接種至YMA(含10 μg·mL-1四環(huán)素)液體培養(yǎng)基中，120 r·min-1，28℃搖瓶培養(yǎng)至菌液OD600nm值為0.8～1.0，測(cè)定活菌濃度為2.0×109個(gè)·mL-1。

1.7 參比植物和無氮沙培試驗(yàn)

在苜蓿田間小區(qū)試驗(yàn)行間種植黑麥草(Loliumperenne)作為不固氮的參比植物[10]。

無氮沙培試驗(yàn)：用于測(cè)定在無土壤因素影響下苜蓿植株15N同位素豐度。將河沙反復(fù)清洗、干燥后裝入營養(yǎng)缽(直徑：20 cm，高：30 cm)內(nèi)。種子經(jīng)表面消毒后，28℃催芽，待主根長出2～3 cm，側(cè)根未長出時(shí)，用菌液浸種15 min后植栽入盛有河沙的營養(yǎng)缽中。苜蓿生長期間定期澆灌無氮營養(yǎng)液(300 mL·營養(yǎng)缽-1)，同時(shí)以無菌水培養(yǎng)液浸種的處理作對(duì)照。

1.8 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.8.1根瘤菌在苜蓿根際土壤的定殖 分別在苜蓿不同茬次、不同生育期各處理小區(qū)連根完整挖取10～15株苜蓿植株，收集根際土樣，稱重。土樣放入裝有無菌玻璃珠的三角瓶中震蕩10 min，10倍稀釋，取合適濃度稀釋液涂布于四環(huán)素抗性平板，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)發(fā)光菌落數(shù)。

1.8.2結(jié)瘤數(shù)，主、側(cè)根根瘤分布及標(biāo)記根瘤占瘤率 分別在苜蓿不同茬次、不同生育期，每小區(qū)每次連根完整取出10～15株苗，調(diào)查總根瘤數(shù)，主、側(cè)根根瘤數(shù)及發(fā)光根瘤數(shù)。采集的根瘤經(jīng)表面滅菌后，用無菌鑷子壓破根瘤制備菌懸液，在含抗生素的YMA平板上劃線分離，28℃培養(yǎng)2～3 d，熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)熒光菌落。

1.8.3苜蓿植株生物固氮率和固氮量 根瘤菌固氮率采用15N自然豐度法測(cè)定[11]。植株收獲后，75℃烘干、粉碎。莖葉15N%測(cè)定采用測(cè)量精度為0.001%的精密同位素質(zhì)譜儀，全氮含量測(cè)定采用凱氏定氮法。計(jì)算不同處理的根瘤菌固氮百分率、固氮量。

根瘤菌固氮百分率(%Ndfa)通過下式計(jì)算：

%Ndfa=(δ15Ns-δ15Nf)/(δ15Ns-δ15Na)×100%

(1)

其中δ15Ns為參比植物(本試驗(yàn)中為與苜蓿生長在同一試驗(yàn)小區(qū)的黑麥草)的15N豐度，δ15Nf為試驗(yàn)小區(qū)苜蓿的15N豐度，δ15Na為生長于無氮沙培上苜蓿的15N豐度。

根瘤菌固氮量用下式計(jì)算：

Ndfa=%Ndfa×Mlb×Cnc

(2)

Ndfa為單位面積根瘤菌的生物固氮量(kg·hm-2)，%Ndfa為根瘤菌生物固氮所占比例，Mlb為單位面積苜蓿生物量(kg·hm-2)，Cnc為苜蓿植株全氮含量(kg·kg-1)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并采用 Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種處理根瘤菌在苜蓿根際土壤的定殖動(dòng)態(tài)

在不同茬次、不同生育期分別對(duì)各接種處理苜蓿根際土壤中S.melilotiXGL026-GFP的定殖數(shù)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。播前拌種根瘤菌(B)，第1茬苜蓿苗期根際土壤中根瘤菌的定殖數(shù)量最高(1.02×104±0.165 cfu·g-1干土)，到分枝期數(shù)量急劇下降(減少41.18%)，至現(xiàn)蕾期數(shù)量基本維持穩(wěn)定；第2茬苜蓿根際根瘤菌的定殖量較第1茬下降25.00%～34.92%；第3茬定殖量基本穩(wěn)定在2.30×103±0.315 cfu·g-1干土。第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(D)處理，根瘤菌在根際土壤中的定殖數(shù)量顯著高于B處理(>1000倍)，且定殖菌量隨生長期的延長逐漸增加，至第3茬依然持續(xù)升高，保持較高的定殖量。拌種結(jié)合第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(B+D1)，第2茬苜蓿根際根瘤菌定殖量高于D處理。拌種結(jié)合第1、2茬苜蓿刈割后滴施2次根瘤菌(B+D2)，第3茬苜蓿根際土壤中根瘤菌的定殖量顯著高于B+D1處理(P<0.01)。拌種結(jié)合滴施根瘤菌并加施少量氮肥(B+D1+N1，B+D2+N2)處理較不施氮肥(B+D1，B+D2)的處理，苜蓿根際土壤中根瘤菌的定殖量略有差異，但差異不顯著。

圖1 不同接種處理根瘤菌在苜蓿根際定殖動(dòng)態(tài)Fig.1 Colonization dynamics of S.meliloti XGL026-GFP strain in the rhizosphere of alfalfa under different inoculation treatments注：CK-對(duì)照；B-拌種根瘤菌；D-追施根瘤菌；B+D1-拌種+滴施1次根瘤菌；B+D1+N1-拌種+滴施1次根瘤菌+施氮肥1次；B+D2-拌種+滴施2次根瘤菌；B+D2+N2-拌種+滴施2次根瘤菌+施氮肥2次，下同Note: CK means control group; B means soaking seeds with rhizobia; D means drip irrigation rhizobia; B+D1 means soaking seeds and drip irrigation rhizobia once; B+D1+N1 means soaking seeds and drip irrigation rhizobia once and nitrogenous fertilizer once; B+D2 means soaking seeds and drip irrigation rhizobia twice; B+D2+N2 means soaking seeds and drip irrigation rhizobia twice and nitrogenous fertilizer twice, the same as below

2.2 不同接種處理對(duì)苜蓿結(jié)瘤數(shù)的影響

統(tǒng)計(jì)各處理苜蓿的單株結(jié)瘤數(shù)(圖2)，結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，各接種根瘤菌的處理均能有效增加苜蓿結(jié)瘤數(shù)。播前拌種根瘤菌(B)，第1茬苜蓿結(jié)瘤數(shù)從苗期至現(xiàn)蕾期迅速增加，至現(xiàn)蕾期時(shí)達(dá)到最高(33±0.005個(gè)·株-1)，較對(duì)照組增加13個(gè)·株-1。第2茬苜蓿的平均結(jié)瘤數(shù)依次為：B+D1+N1(34±2.118個(gè)·株-1)>B(28±0.032個(gè)·株-1)>B+D1(27±0.005個(gè)·株-1)>D(23±0.120個(gè)·株-1)>CK(17±0.218個(gè)·株-1)，各接菌處理均能顯著增加苜蓿結(jié)瘤數(shù)(P<0.05)，較對(duì)照增加6～17個(gè)·株-1(平均11個(gè)·株-1)，其中B+D1+N1處理的增幅最大。第3茬苜蓿結(jié)瘤數(shù)依次為：B+D2+N2(33±0.580個(gè)·株-1)>B+D1+N1(31±2.212個(gè)·株-1)>B+D2(30±0.223個(gè)·株-1)>B+D1(26±0.012個(gè)·株-1)>B(23±1.123個(gè)·株-1)>D(22±0.605個(gè)·株-1)>CK(16±0.045個(gè)·株-1)，接菌處理較對(duì)照組增加6～17個(gè)·株-1(平均12個(gè)·株-1)，其中B+D2+N2的增幅最大。

圖2 不同接種處理苜蓿單株結(jié)瘤數(shù)Fig.2 Nodule number of alfalfa under different inoculation treatments

2.3 不同接種處理標(biāo)記根瘤菌的競爭占瘤率

采集各接種處理的苜蓿根瘤，抗性平板分離根瘤菌,檢測(cè)標(biāo)記熒光菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)接種菌株的占瘤率。圖3顯示，各接種處理，1～3茬苜蓿上接種菌株S.melilotiXGL026-GFP的平均占瘤率達(dá)52.91%～76.71%，顯著高于土著根瘤菌，具有較強(qiáng)的田間競爭結(jié)瘤能力。播前拌種根瘤菌(B)，第1茬苜蓿根部根瘤菌的占瘤率逐漸上升(苗期34.50±0.577%～現(xiàn)蕾期47.22±0.334%)，到第2茬分枝期迅速上升至最大(67.30±1.339%)，在之后的生長期中基本維持該水平。D、B+D1和B+D1+N1處理，根瘤菌在第2、3茬苜蓿根部的占瘤率均逐漸上升，第2茬(分枝期)至第3茬(苗期)分別為46.6±1.220%～55.97±0.188%、66.70±0.415%～68.70±0.577%和69.50±1.322%～72.17±3.756%，其中B+D1+N1處理的占瘤率最高且持續(xù)穩(wěn)定。B+D2及B+D2+N2處理，第3茬苜蓿上接種根瘤菌的占瘤率分別為67.57±0.368%和76.71±0.883%，B+D2+N2處理占瘤率更高，可見滴施接菌并加施少量氮肥對(duì)根瘤菌的占瘤率具有一定的促進(jìn)作用。

圖3 不同接種處理對(duì)標(biāo)記根瘤菌占瘤率的影響Fig.3 The labeled nodule occupancy of alfalfa under different treatments

2.4 不同接種處理苜蓿主、側(cè)根根瘤分布

對(duì)各處理苜蓿主、側(cè)根根瘤的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖4所示。播前拌種根瘤菌(B)，第1茬苜蓿從苗期到現(xiàn)蕾期主根根瘤占總根瘤數(shù)的比例由86.05±0.263%下降至40.16±3.352%，側(cè)根上形成根瘤比例由13.95±0.541%上升59.84±0.595%，較未接種對(duì)照平均增加5.68%。第2、3茬苜蓿的根瘤主要分布在側(cè)根上，接種處理側(cè)根根瘤比例分別為55.31±1.764%～71.00±0.263%(平均63.19±0.985%)、89.91±0.882%～91.25±0.887%(平均90.77±0.884%)，較對(duì)照增加0.09%～15.44%，以滴施處理的第2茬苜蓿的增幅最明顯。結(jié)果說明地下滴灌條件下接種根瘤菌，能明顯增加苜蓿新生側(cè)根和毛根數(shù)量，有利于根瘤菌侵染，增加側(cè)根根瘤分布。

圖4 不同接種處理苜蓿主、側(cè)根根瘤分布Fig.4 The nodule number in main, lateral root of different treatments

2.5 不同接種處理對(duì)生物固氮率、固氮量的影響

各處理的3茬苜蓿刈割后，分別測(cè)定根瘤菌的固氮率和固氮量(表2)。由圖可知，與對(duì)照組(CK)相比，接種優(yōu)良根瘤菌菌株能顯著提高3茬苜蓿的固氮率和固氮量。播前拌種根瘤菌(B)，第1、2、3茬苜蓿根際根瘤菌的生物固氮率和固氮量較對(duì)照分別增加了40.41%、16.06%、11.10%和56.19 kg·hm-2、44.66 kg·hm-2、43.56 kg·hm-2，以第1茬苜蓿根際根瘤菌的固氮率、固氮量的增幅最大。第2茬苜蓿，各處理根瘤菌的固氮率和固氮量的大小依次為：B+D1+N1>B+D1>B>D>CK，接種處理的固氮率和固氮量較對(duì)照分別提高了3.35%～30.15%，26.17～72.83 kg·hm-2，以B+D1+N1的增幅最大，其次是B+D1的處理。第3茬苜蓿，各處理根瘤菌的固氮率的大小依次是：B+D1+N1>B+D2>B+D2+N2>B+D1>D>B>CK，固氮量的大小依次為B+D2+N2>B+D2>B+D1+N1>B+D1>D>B>CK，各接種處理根瘤菌的固氮率和固氮量較對(duì)照分別提高了11.01%～35.86%，13.56～83.86 kg·hm-2，其中B+D1+N1、B+D2和B+D2+N2處理根瘤菌的固氮率都保持較高，達(dá)到了75%以上，B+D2+N2處理的固氮量最高，固氮效應(yīng)最為突出。

表2 不同接種處理苜蓿的生物固氮率和固氮量Table 2 The proportion of N fixed and the amount by alfalfa under different treatments

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)

Note: Different small letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level, different capital letters indicate significant difference at the 0.01 level

3 討論與結(jié)論

3.1 不同接種處理對(duì)根瘤菌在苜蓿根際定殖和結(jié)瘤的影響

3.1.1不同接種處理根瘤菌的根際定殖量 接種根瘤菌種群定殖動(dòng)態(tài)受多種因素的影響，涉及接種方法、土壤非生物因素和生物因素的制約[12-13]。地下滴灌下的苜蓿生產(chǎn)模式改變了土壤環(huán)境，必然對(duì)接種根瘤菌的生存定殖、侵染結(jié)瘤和固氮功能產(chǎn)生影響[14]。利用基因標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記根瘤菌株，依據(jù)標(biāo)記基因作用于特異性底物產(chǎn)生的顏色反應(yīng)或發(fā)光現(xiàn)象區(qū)別于土著菌，能直觀地原位示蹤、檢測(cè)功能菌株的環(huán)境行為[15-16]。本研究利用綠色熒光蛋白基因(GFP)作為報(bào)告基因，對(duì)前期研究中分離篩選出的優(yōu)良根瘤菌菌株XGL026進(jìn)行分子標(biāo)記，通過地下滴灌田間小區(qū)試驗(yàn)，示蹤、檢測(cè)不同接種處理對(duì)根瘤菌在苜蓿根際定殖和競爭結(jié)瘤性能的影響。結(jié)果顯示，不同接種處理根瘤菌的定殖動(dòng)態(tài)和水平差異顯著。播前拌種根瘤菌(B)，在第1茬苜蓿苗期根際定殖密度最大，至第2茬苜蓿定殖密度下降，第3茬苜蓿僅有少量存留。第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(D)，拌種結(jié)合第1茬苜蓿刈割后滴施1次根瘤菌(B+D1)，拌種結(jié)合第1、2茬苜蓿刈割后滴施2次根瘤菌(B+D2)和拌種結(jié)合滴施同時(shí)增施少量氮肥(B+D1+N1，B+D2+N2)處理，根瘤菌的定殖數(shù)量顯著高于B處理，在第2、3茬定殖數(shù)量持續(xù)升高，保持較高的定殖量。

3.1.2不同接種處理對(duì)結(jié)瘤數(shù)、占瘤率的影響 接種根瘤菌在根際存活、定殖是發(fā)生在根瘤菌侵染和建立共生關(guān)系的最初階段，對(duì)于成功與土著菌競爭占據(jù)根系，提高結(jié)瘤率至關(guān)重要。本研究表明，接種能顯著增加苜蓿結(jié)瘤數(shù)。B處理在第1茬苜蓿上的結(jié)瘤量最多，第2、3茬苜蓿上的結(jié)瘤數(shù)減少。而B+D1+N1處理第2、3茬苜蓿的結(jié)瘤數(shù)、占瘤率都明顯高于拌種(B)、滴施(D)和拌種結(jié)合滴施(B+D1、B+D2)處理。B+D2+N2第3茬苜蓿的結(jié)瘤數(shù)、接種菌占瘤率均達(dá)到最高，明顯優(yōu)于其他處理。

李友國[17]等發(fā)現(xiàn)，接種根瘤菌在豆科植物根際的定殖水平與苜蓿結(jié)瘤量和固氮效應(yīng)密切相關(guān)。但也有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)瘤數(shù)量、占瘤率高的菌株并不與其在根際的定殖水平呈正相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，第1茬刈割后滴施1次根瘤菌(D)較播前拌種(B)能顯著提高根瘤菌在苜蓿根際的定殖量，但結(jié)瘤數(shù)和占瘤率均低于B處理。分析其原因，可能與苜蓿根系是根瘤的載體，接種根瘤菌結(jié)瘤量與根系發(fā)育密切相關(guān)。播前拌種處理(B)促進(jìn)了苜蓿根系生長，根系活力顯著增加，有利于根瘤菌的侵染結(jié)瘤。而D處理是在第1茬苜蓿刈割后才接菌，盡管根瘤菌定殖量大，但苜蓿根系發(fā)育狀況劣于B處理，影響了根瘤菌共生結(jié)瘤。

播前拌種是目前根瘤菌應(yīng)用中最主要的接種方式。此方式由于根瘤菌的遷移速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于根系的生長速度，造成根瘤菌與根系的接觸時(shí)間短，侵染結(jié)瘤率降低，影響接種效果[19]。實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，隨著苜蓿種植年限延長、刈割茬次增加，毛根減少、根皮老化，根瘤菌難于侵染、根瘤數(shù)會(huì)急劇減少，由此帶來的氮素供應(yīng)缺乏，苜蓿產(chǎn)量、品質(zhì)下降是苜蓿生產(chǎn)中的突出問題，能否通過補(bǔ)充接種根瘤菌提高其固氮能力也是當(dāng)前需要解決的技術(shù)難題。本研究結(jié)果表明，苜蓿地下滴灌栽培模式下，采用常規(guī)的播前拌種接種根瘤菌(B)，在頭茬苜蓿根際定殖密度、結(jié)瘤數(shù)和占瘤率最高，但在第2、3茬苜蓿上則明顯降低。拌種結(jié)合在第1、2茬苜蓿刈割后滴施根瘤菌(B+D1，B+D2)和拌種結(jié)合滴施并增施少量氮肥(B+D1+N1，B+D2+N2)處理能顯著增加2、3茬苜蓿根際根瘤菌的定殖密度、結(jié)瘤數(shù)和占瘤率(P<0.05)，其中B+D1+N1和B+D2+N2處理的接種效應(yīng)最為突出。利用地下滴灌的地下毛管在灌水的同時(shí)將菌劑滴施到根區(qū)土壤中，可實(shí)現(xiàn)菌劑的可控、均勻和靶向施入，為不同種植年限、不同茬次的根瘤菌接種提供了新的途徑。

3.2 地下滴灌對(duì)根瘤在苜蓿主、側(cè)根分布的影響

姚新春等[20]的試驗(yàn)顯示，隨著苜蓿生長期延長，主根皮層細(xì)胞不斷衰老而變厚，根瘤菌不易侵染形成根瘤，轉(zhuǎn)而去侵染幼嫩的側(cè)根和不斷更新的毛根，導(dǎo)致側(cè)根根瘤比例不斷增加，而主根上根瘤的比例持續(xù)下降。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示出相似的特點(diǎn)。苜蓿地下滴灌種植模式下，隨著生長期推移和刈割茬次的增加，根瘤的形成不斷向側(cè)根轉(zhuǎn)移，主、側(cè)根根瘤比例分布呈現(xiàn)明顯變化。播前拌種根瘤菌(B)，第1茬苜蓿苗期以主根根瘤為主，至現(xiàn)蕾期側(cè)根根瘤比例上升為優(yōu)勢(shì)。在第2、3茬苜蓿各接種處理側(cè)根根瘤比例繼續(xù)上升。刈割會(huì)使側(cè)根在淺層土壤中的集中分布愈加明顯, 可能是2、3茬苜蓿側(cè)根根瘤比例增加的重要原因。另一可能的原因是地下滴灌條件改善了較淺土層的水分條件，能促進(jìn)苜蓿新生側(cè)根形成、增加根毛和活根量；距滴灌滴頭越近毛根量越大[21]，使接種根瘤菌易于定殖和侵染，從而提高根瘤在側(cè)根上所占的比例。地下滴灌條件下，苜蓿根系的空間分布與根瘤菌侵染結(jié)瘤的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律還有待繼續(xù)深入研究。

3.3 不同接種處理對(duì)不同茬次苜蓿固氮效率的影響

3.3.1不同接種處理下的固氮效率 本試驗(yàn)結(jié)果表明，地下滴灌苜蓿接種優(yōu)良根瘤菌菌株能顯著提高固氮率，增加固氮量，不同接種處理、不同茬次苜蓿的固氮效率存在較大差異。采用拌種、滴施、拌種結(jié)合滴施、拌種結(jié)合滴施并加施少量氮肥等接種處理，在一個(gè)生長期的3茬苜蓿上的固氮百分率為54.52%～76.80%，較未接種對(duì)照提高了3.35%～40.41%；固氮量為43.00～183.39 kg·hm-2，較對(duì)照增加13.56～83.86 kg·hm-2。播前拌種(B)處理對(duì)第1茬苜蓿的固氮效應(yīng)最突出，之后明顯下降。第2茬苜蓿上， B+D1+N1處理根瘤菌的固氮率和固氮量增幅最為顯著。在第3茬苜蓿上，B+D1+N1、B+D2和B+D2+N2處理都有較高的固氮率，其中B+D2+N2處理的固氮量增加最大。結(jié)果證明，在播前拌種基礎(chǔ)上，在2、3 茬苜蓿上配合滴施根瘤菌1～2次，并配施少量氮肥能顯著提高固氮效率，改善植株的氮素營養(yǎng)，促進(jìn)苜蓿生長，提高了地上部干物質(zhì)積累，達(dá)到了顯著的增產(chǎn)效果(另文報(bào)道)。

3.3.2根瘤菌接種和氮肥配施

氮素是影響根瘤菌固氮能力的重要限制因子，其影響非常復(fù)雜。氮肥施用量、氮肥類型、施用時(shí)期和方式等都會(huì)影響到根瘤菌的固氮效能[22]。Liu等[23]的研究發(fā)現(xiàn)豆科作物在返青期根瘤較少或在刈割后苜蓿的光合作用較弱時(shí)，根瘤菌尚未與其建立起有效的共生關(guān)系，得不到充足的碳水化合物，導(dǎo)致固氮作用較弱，苜蓿生長主要依靠吸收土壤氮素。此時(shí)期加施少量氮肥作為“起爆氮”能促進(jìn)植株生長，增加結(jié)瘤和固氮。但氮肥供應(yīng)過多，會(huì)影響根瘤菌對(duì)根毛的侵染，對(duì)固氮效率表現(xiàn)出明顯的抑制作用[24]。因此，在苜蓿生產(chǎn)中協(xié)調(diào)好充分發(fā)揮根瘤菌固氮作用和經(jīng)濟(jì)有效地施用氮肥這一矛盾是一個(gè)值得研究解決的問題。

本研究結(jié)果表明，B+D1+N1、B+D2+N2處理，在第1、2茬苜蓿刈割后滴施根瘤菌同時(shí)加施少量氮肥(30 kg·hm-2尿素)1～2次，促進(jìn)了苜蓿根系發(fā)育，有利于苗期返青生長，增加地上部光合產(chǎn)物向地下部分輸導(dǎo)，進(jìn)而有利于根瘤菌的侵染、結(jié)瘤，起到顯著提高苜蓿固氮效率的作用。B+D2+N2較B+D1+N1處理增加了施菌和施氮肥的次數(shù)，在第3茬苜蓿上獲得了最高的固氮效應(yīng)，體現(xiàn)出累加效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，土壤中根瘤菌群體的“載菌量”有一定閾值，增加接菌量提高接種效果的作用有限；同時(shí)增加接菌、施氮肥次數(shù)會(huì)增加生產(chǎn)成本。因此，根瘤菌施用次數(shù)和施菌量、加施氮肥的次數(shù)，氮肥施用量和施用時(shí)期等都還有待進(jìn)一步優(yōu)化，以期實(shí)現(xiàn)最佳生產(chǎn)效益。本研究結(jié)果對(duì)滴灌苜蓿栽培生產(chǎn)中應(yīng)用根瘤菌和氮肥的高效利用，建立高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效的苜蓿生產(chǎn)體系具有重要的實(shí)踐意義。