食品中葉酸分析方法及穩(wěn)定性研究進(jìn)展

康文懷　葉曉利　李慧　李巧玲　秦玲

摘 要：通過(guò)優(yōu)化樣品前處理體系，建立精確的葉酸分析檢測(cè)方法，對(duì)促進(jìn)葉酸的多方面、深層次研究具有迫切的現(xiàn)實(shí)意義。

介紹了葉酸的分子結(jié)構(gòu)及其主要存在形式，以及常見(jiàn)食品中葉酸的含量。闡述了化學(xué)法和酶解法等樣品前處理方法，分析表明在測(cè)定富含淀粉、蛋白質(zhì)的豆類、谷物等食品中的葉酸時(shí)，更適合采用與淀粉酶、蛋白酶等聯(lián)合使用的酶解法。綜述了微生物法、熒光分析法、液相色譜法等常見(jiàn)葉酸檢測(cè)方法，指出高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法可快速測(cè)定不同形式的葉酸，且具有高效、精確等特點(diǎn)。探討了影響葉酸穩(wěn)定性的因素，以及提高葉酸攝入量和穩(wěn)定性的措施，

認(rèn)為可通過(guò)在主糧作物中添加葉酸、蛋白質(zhì)膠囊包裹葉酸、促進(jìn)葉酸與蛋白質(zhì)結(jié)合等方式來(lái)提高葉酸的攝入量及其穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：食品檢驗(yàn)學(xué);葉酸;提取;農(nóng)產(chǎn)品;穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：TS210.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.7535/hbkd.2019yx05010

Advances in research on analysis methods and

stability of folic acid in food

KANG Wenhuai， YE Xiaoli， LI Hui， LI Qiaoling， QIN Ling

（School of Bioscience and Bioengineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang， Hebei 050018， China）

[WT5HZ][HJ2.4mm]Abstract：

It is urgently and practically significant to optimize the sample pretreatment， and to establish accurate detection of folic acid content in food and the presence of folic acid， in order to promote the in-depth research of various aspects of folic acid.

In the paper， the molecular structure of folic acid and its main forms， as well as the content of folic acid in common foods are introduced. The sample pretreatment methods such as chemical method and enzymatic hydrolysis method are described. It is indicated that the enzymatic hydrolysis method is more suitable for the determination of folic acid in foods such as beans and grains， so that the folic acid combined with protein， starch and the like is fully hydrolyzed by using a combination of protease and amylase. The common methods for detecting folic acid， such as microbial method， fluorescence analysis method and high performance liquid chromatography （HPLC）， are reviewed. HPLC is characterized by high efficiency and precision， especially ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry/-mass spectrometry （UPLC-MS/MS）， which can quickly determine different forms of folic acid. Factors affecting the stability of folic acid and measures to increase folic acid intake and stability are explored.

It shows that the measures to increase folic acid intake and stability includes adding folic acid in staple crops， packaging folic acid with protein capsule， facilitating the combination of folic acid and protein， etc.

Keywords：food inspection; folic acid; extraction; agricultural products; stability

葉酸（folic acid，folate，F(xiàn)A），化學(xué)名為蝶酰谷氨酸（pteroylglutamic acid，PGA），是蝶啶系列衍生物的總稱，屬于水溶性B族維生素。葉酸作為甲基供體參與了許多重要的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，特別在維生素B12和維生素B6合成、修復(fù)，以及嘌呤嘧啶和甲基化DNA的合成等方面發(fā)揮著重要作用[1-3]。缺乏葉酸會(huì)引起諸多健康問(wèn)題，如新生兒神經(jīng)管畸形、癌癥、心血管疾病、巨幼紅細(xì)胞貧血、動(dòng)脈硬化、急性心肌梗塞和腦中風(fēng)等[4]。葉酸作為人體的必須營(yíng)養(yǎng)成分之一，卻不能在人體內(nèi)合成，需通過(guò)日常飲食來(lái)攝入[2]。而日常食品中葉酸含量較低，又容易在加工過(guò)程中損失，所以，普遍存在葉酸攝入不足的問(wèn)題，中國(guó)北方是葉酸的重缺乏區(qū)[4-5]。

世界衛(wèi)生組織WHO建議正常成年人的每日葉酸（游離態(tài)）攝入量為200 μg，孕婦和乳母為400 μg。為提高葉酸的日常攝入量，可選用葉酸含量豐富的食物，如：綠葉蔬菜、豆類、谷類、柑橘類水果、堅(jiān)果、肝臟等;也可在主糧中添加葉酸。攝入葉酸須有科學(xué)的指導(dǎo)，才能安全有效，這就迫切需要開(kāi)展不同方向的分析方法研究，例如：分析測(cè)定各類食物中葉酸的存在形式及其含量，監(jiān)測(cè)添加到谷物中的葉酸劑量是否符合標(biāo)準(zhǔn)等。鑒于食品中化學(xué)成分復(fù)雜（含大量蛋白質(zhì)、淀粉、多糖等），對(duì)其中葉酸定性定量的測(cè)定難度較大;而且葉酸本身的穩(wěn)定性差，容易受到光、熱、pH值等因素的影響，而造成定量分析不準(zhǔn)確。本文針對(duì)葉酸分析過(guò)程中，樣品的預(yù)處理、分析方法、影響葉酸穩(wěn)定性因素等方面進(jìn)行綜述，以期獲得更高效的分析方法，為進(jìn)一步開(kāi)展食品中葉酸的深入研究提供參考。

1 食品中的葉酸

1.1 葉酸的結(jié)構(gòu)

葉酸具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖1），由蝶啶（Pteridine）、對(duì)氨基苯甲酸（p-Aminobenzoate）和谷氨酸鏈（Glutamyl chain）3部分組成。其中：

在植物和細(xì)菌中葉酸合成步驟相同，涉及3個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。蝶啶在細(xì)胞質(zhì)中合成，對(duì)氨基苯甲酸在

葉綠體中合成，隨后二者被轉(zhuǎn)入線粒體中形成二氫蝶酸，再與谷氨酸作用，逐漸形成單尾或多尾葉酸

[6]。如表1所示，依據(jù)不同的取代基—R1，—R2，可形成不同的葉酸衍生物。例如：當(dāng)取代基

—R1，—R2分別是—CH3，—H時(shí)，則分子式為5-CH3H4PteGlu （5-甲基四氫葉酸），它是葉酸的主要衍生物。

1.2 常見(jiàn)食品中的葉酸

增加葉酸日常攝入量的途徑主要包括：1）增加富含葉酸的食物比例;2）提高葉酸強(qiáng)化食品的供給;3）使用葉酸補(bǔ)充劑等。此外，美國(guó)、加拿大等發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)開(kāi)始執(zhí)行強(qiáng)制性的谷物葉酸強(qiáng)化補(bǔ)充政策[6-7]。

天然葉酸存在于蔬菜、水果、谷物、豆類、乳制品等食物中，其葉酸含量見(jiàn)表2。由表2可知，豆類的葉酸含量最為豐富;小麥的葉酸含量較低;大部分大米的葉酸含量也較低。此外，菠菜、蘿卜、青菜、芹菜等蔬菜中的葉酸含量較為豐富，是葉酸的主要膳食來(lái)源。值得注意的是，過(guò)量攝入葉酸也可能會(huì)引起健康風(fēng)險(xiǎn)，如增加前列腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，掩蓋維生素B12缺乏癥等[8]。

2 食品中葉酸的提取

葉酸的提取是分析檢測(cè)食品中葉酸的關(guān)鍵和前提。食品中的葉酸含量低，對(duì)化學(xué)和物理?xiàng)l件敏感，只有經(jīng)過(guò)正確的樣品前處理才能最大程度地將葉酸及其衍生物提取出來(lái)。

在葉酸提取過(guò)程中，為減少氧的影響，需添加抗氧化劑，保護(hù)葉酸免受氧化并減少葉酸衍生物之間的相互轉(zhuǎn)化[10]?？箟难猁}作為一種抗氧化劑，常在中性或堿性條件下使用，且常與巰基乙醇或二硫蘇糖醇配合使用[11]。為避免光的影響，建議采用棕色容器或包裹避光材料，以防止葉酸降解。

一般采用化學(xué)法或酶解法來(lái)提取食品中的葉酸。化學(xué)法主要利用葉酸易溶于中性或堿性溶液的特性進(jìn)行提取，如熱沸偏磷酸提取法[12]，常用的浸提液有磷酸緩沖液[13]、HCl和三氯乙酸溶液[14]、NaOH溶液[15]、乙酸銨（pH值為7.9）緩沖液[16]等。該方法常與加熱、超聲波等相結(jié)合，不僅有助于細(xì)胞溶解，還會(huì)使蛋白質(zhì)變性，釋放結(jié)合態(tài)葉酸。邵麗華等[13]比較了恒溫水浴法和超聲波振蕩法的葉酸提取效果，認(rèn)為恒溫水浴法優(yōu)于超聲波振蕩法。有研究者提出，加熱時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)導(dǎo)致葉酸降解，特別是在酸性條件下，表現(xiàn)更為明顯[17]。化學(xué)法提取葉酸，還應(yīng)注意γ-谷氨酰水解酶（GGH）對(duì)聚谷氨酰葉酸的水解。該酶在植物中普遍存在，可在提取過(guò)程中將多谷氨?；獬蓡挝祯；蚨替湽劝滨；问?。WANG等[16]在研究含有不同個(gè)數(shù)谷氨酸鏈的5-甲基四氫葉酸時(shí)，利用蒸汽處理蔬菜樣品，可使GGH快速失活。

豆類、谷物等食品中富含淀粉、蛋白質(zhì)等，常采用酶解法來(lái)提取其中的葉酸。酶解法就是利用蛋白酶、淀粉酶等聯(lián)合處理樣品，使與蛋白質(zhì)、淀粉等相結(jié)合的葉酸充分水解，可使各種形式的葉酸轉(zhuǎn)變成單谷氨酸葉酸或2～3個(gè)谷氨酸尾的葉酸[18-19]。HEFNI等[7]在谷物、小扁豆和豆類等研究中，比較了蛋白酶、淀粉酶等單獨(dú)使用以及與多種酶聯(lián)合使用的效果，發(fā)現(xiàn)多種酶聯(lián)合使用可提高葉酸的提取率。

3 葉酸的分析檢測(cè)方法

葉酸的分析檢測(cè)方法很多，常見(jiàn)的有微生物法、熒光分析法、液相色譜法（HPLC）等。

3.1 微生物法

微生物法是應(yīng)用最廣的檢測(cè)方法，由于葉酸也是某些微生物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將菌液接種至含有葉酸試樣液的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)一段時(shí)間后測(cè)定其透光率（吸光度值），可據(jù)此確定葉酸的含量。

GB 5009.211—2014《食品中葉酸的測(cè)定》[20]將鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus）（ATCC 7469）作為測(cè)定用菌。目前，國(guó)外在檢測(cè)蔬菜、豆類、面包等食品中的葉酸時(shí)，測(cè)定用菌也采用鼠李糖乳桿菌[21-23]。

微生物法靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，但操作復(fù)雜、試驗(yàn)周期較長(zhǎng)、菌種傳代保存比較繁瑣，所測(cè)定的結(jié)果為葉酸總含量，不能反映葉酸不同衍生物的細(xì)節(jié)。目前，可采用試劑盒微生物法測(cè)定葉酸，揚(yáng)長(zhǎng)避短，方便快捷。

3.2 熒光分析法

熒光分析法的原理是葉酸結(jié)構(gòu)中的吡嗪-嘧啶環(huán)具有特殊的吸收光譜，在紫外線照射下產(chǎn)生藍(lán)色熒光，其熒光強(qiáng)度和葉酸濃度成正比。葉酸本身熒光較弱，需加入某些強(qiáng)氧化劑（過(guò)硫酸鉀（K2S2O8）、高碘酸鉀（KIO4）、高錳酸鉀（KMnO4）、Fenton試劑等）將其氧化，氧化后產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度大大增加，這就是間接熒光法。

王夢(mèng)等[24]以KMnO4作為氧化劑，用熒光法測(cè)定了蘋(píng)果、梨、菠菜等果蔬中的葉酸含量。同時(shí)，郭秀珠等[25]和遲曉星等[26]也以KMnO4作氧化劑，先后用熒光分光光譜法和間接熒光法測(cè)定了蔬菜中的葉酸含量。蘇文斌[27]則采用Fenton試劑作為氧化劑，用間接熒光法測(cè)定了果蔬中的葉酸含量，發(fā)現(xiàn)Fenton試劑產(chǎn)生的羥自由基可將葉酸氧化為蝶呤-6-羧酸，其熒光值較葉酸的熒光值大大增強(qiáng)。

熒光分析法具有測(cè)定快速、靈敏、選擇性好、儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

3.3 液相色譜法

目前，常利用液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）來(lái)測(cè)定食品中葉酸的含量。該方法具有結(jié)果精確、操作步驟簡(jiǎn)單、分析速度快、分離效果理想等特點(diǎn)。采用HPLC和LC-MS測(cè)定食品中葉酸的色譜條件，因研究對(duì)象不同、所用儀器不同，存在較大差異。色譜柱一般為C18柱，洗脫液差異較大，采用HPLC時(shí)多為乙腈和磷酸緩沖液，采用LC-MS時(shí)多為乙腈和甲酸水溶液，詳情見(jiàn)表3。

常采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）分析不同形式葉酸的含量及其變化。PAWLOSKY等[34]比較了LC-MS法和微生物法之間的差異，認(rèn)為L(zhǎng)C-MS法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性均高于微生物法，且能測(cè)定不同形式的葉酸。同時(shí)，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的靈敏度更高，蔡建[35]在運(yùn)動(dòng)飲料的葉酸研究中，通過(guò)優(yōu)化LC-MS色譜條件、質(zhì)譜條件、提取劑等，檢出限可達(dá)到0.4 μg/kg。

3.4 其他方法

除微生物法、熒光檢測(cè)法、液相色譜法用于葉酸的檢測(cè)外，還有伏安法、酶聯(lián)免疫反應(yīng)方法（ELISA）等。

JAMALI等[37]用磷酸鹽緩沖液（pH值為7.0）和2-巰基乙醇浸泡提取樣品，然后以一種新型納米合金（Pt：Co）室溫離子液體RTIL修飾的碳糊電極作為高靈敏傳感器，采用伏安法測(cè)定了食品中的葉酸，線性響應(yīng)范圍為1.0×10-7～5.0×10-4 mol/L，檢出限為4.0×10-8 mol/L，并成功應(yīng)用于其他食品樣品中葉酸的測(cè)定。張娟等[38]利用差示脈沖溶出伏安技術(shù)和葉酸在電極表面的吸附特性，建立了測(cè)定痕量葉酸的電化學(xué)分析方法，用于小米和玉米中微量和痕量葉酸的測(cè)定，其線性范圍為6.78×10-10～12.27×10-8 mol/L。

李貞[39]和李江等[40]用ELISA方法分別檢測(cè)了牛奶和奶粉中的葉酸含量。李貞[39]用競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫、棋盤(pán)法確定最佳抗體包被條件、封閉條件、酶標(biāo)抗原濃度等，并進(jìn)行了性能評(píng)價(jià)測(cè)定，此方法的最低檢測(cè)限為2.22 ng/mL。李江等[40]以奶粉為試材，選擇葉酸檢測(cè)試劑盒，建立了一種檢測(cè)奶粉中葉酸的酶聯(lián)免疫分析方法。

4 葉酸的穩(wěn)定性研究

4.1 影響葉酸穩(wěn)定性的因素

葉酸性質(zhì)不穩(wěn)定，其主要影響因素包括光、熱、pH值等[1，4，6]。1）光照：在對(duì)葉酸和其他3種含蝶啶的分子進(jìn)行的穩(wěn)態(tài)光物理研究中，測(cè)定了pH值對(duì)其熒光量子產(chǎn)量、壽命、發(fā)射光譜和激發(fā)光譜的影響，結(jié)果表明葉酸在酸性和堿性介質(zhì)中都有非常低的熒光量子產(chǎn)量，但與酸性介質(zhì)相比，堿性介質(zhì)的熒光發(fā)射光譜呈現(xiàn)出與pH值相關(guān)的紅移現(xiàn)象。眾所周知，紫外光可以降解葉酸，并且純?nèi)芤涸诠庹諚l件下?lián)p失得很快。2）熱效應(yīng)：據(jù)報(bào)道[1，6]，正常儲(chǔ)存條件下（20 ℃和65%的濕度），葉酸以每年1%的速度分解。在100 ℃下保存2 h，葉酸損失率為8%～25%。3）pH值：通過(guò)研究不同pH值下葉酸在水溶液中的變化發(fā)現(xiàn)，在pH值為1時(shí)，葉酸可完全降解;在pH值為3時(shí)，葉酸部分降解（40%～45%）;在pH值為4～12時(shí)，葉酸降解率低（10%～30%）。此外，氧、電子束等均對(duì)葉酸的穩(wěn)定性有一定的影響。

4.2 提高食品中葉酸含量的措施

為確保植物性食品可以提供足夠量的葉酸，許多研究者正努力尋找各種方法來(lái)提高食品中葉酸的含量。美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）規(guī)定所有富含谷物的產(chǎn)品都要加入葉酸[41]。玉米面粉是許多西班牙裔群體的主要食物來(lái)源，可制成各種玉米食品。玉米經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的研磨或烘烤等環(huán)節(jié)，被加工成玉米粉、玉米餅和薯片后，添加的葉酸僅有20%得以保留[41]。ADOLPHSON等[42]對(duì)玉米成品中葉酸在保存期內(nèi)的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估，認(rèn)為在加工成玉米粉圓餅或其他產(chǎn)品前，在高溫條件下長(zhǎng)時(shí)間保持濕潤(rùn)的強(qiáng)化玉米粉，由于熱化學(xué)降解作用，會(huì)造成葉酸的損失。ARIYARATHNA等[43]使用從鷹嘴豆中分離出來(lái)的蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)膠囊，包裹葉酸形成微膠囊結(jié)構(gòu)，以此來(lái)提高葉酸的熱穩(wěn)定性。在蛋白質(zhì)基質(zhì)中，通過(guò)包裹葉酸可有效防止其在儲(chǔ)存或加工過(guò)程中被降解，并提高了其生物利用率[44]。

為提高葉酸的穩(wěn)定性，PUTHUSSERI等[45]用水楊酸處理香菜葉片，觀察到葉片的葉酸含量增加;

DAZ等[46]在此基礎(chǔ)上用水楊酸處理擬南芥葉片也可使葉酸含量明顯增加（約4倍），此外，還考查了與葉酸代謝途徑有關(guān)的19個(gè)關(guān)鍵基因，其中7種用于葉酸的生物合成，7種用于分解代謝，5種用于葉酸穩(wěn)定。GORELOVA等[47]在番茄果實(shí)和水稻種子中，運(yùn)用代謝工程技術(shù)調(diào)控葉酸生物合成基因來(lái)增加葉酸的穩(wěn)定性，但由于其產(chǎn)生的葉酸在植物中易降解，因此還需進(jìn)一步了解葉酸的分解代謝和維護(hù)葉酸穩(wěn)定的可能機(jī)制[48]。

5 結(jié) 語(yǔ)

葉酸分布廣泛，但其含量較少，精確測(cè)定各類葉酸及其衍生物需建立完備的分析體系。

1）葉酸提取方法一般為化學(xué)法和酶解法。測(cè)定富含淀粉、蛋白質(zhì)的豆類、谷物等食品中葉酸時(shí)，常采用酶解法，以盡可能將與淀粉、蛋白質(zhì)等相結(jié)合的葉酸水解出來(lái)。

2）常見(jiàn)的葉酸檢測(cè)方法有微生物法、熒光分析法、液相色譜法等。微生物法是一種傳統(tǒng)檢測(cè)方法，但具有一定的局限性，操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng);熒光分析法常需要使用強(qiáng)氧化劑來(lái)提高其靈敏度;液相色譜法具有靈敏度高、檢測(cè)準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在不同果蔬、谷物等的檢測(cè)過(guò)程中得到了廣泛應(yīng)用。特別是LC-MS，LC-MS/MS，UPLC-MS/MS的應(yīng)用，靈敏度更高，測(cè)定的葉酸衍生物種類更為豐富。

3）葉酸的性質(zhì)不穩(wěn)定，影響因素較多，其中光、熱、pH值對(duì)葉酸穩(wěn)定性的影響較大。在葉酸分析檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)注意避光、添加抗氧化劑、使用堿性或中性浸提液等。人們可通過(guò)在主糧作物中添加葉酸、蛋白質(zhì)膠囊包裹葉酸、促進(jìn)葉酸與蛋白質(zhì)結(jié)合等方式，提高葉酸的攝入量及其穩(wěn)定性。

總之，由于食品成分復(fù)雜、葉酸性質(zhì)不穩(wěn)定，對(duì)葉酸的精確、穩(wěn)定檢測(cè)會(huì)比較困難。隨著現(xiàn)代分析檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，為精確檢測(cè)食品中葉酸的含量以及全面確認(rèn)葉酸的存在形式提供了可能。谷物、玉米、小麥等作為中國(guó)的主糧作物，是人們攝入天然葉酸的主要來(lái)源。因此，通過(guò)優(yōu)化樣品前處理體系，建立精確的食品中葉酸的分析檢測(cè)方法，可促進(jìn)對(duì)葉酸的多方面、深層次研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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