AMP依賴的蛋白激酶二甲雙胍對老年大鼠肺氣腫作用的實(shí)驗(yàn)研究

鄧海波，龍苗，賈坤林，余林

(1四川省簡陽市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，簡陽 641400；2成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，成都 610081)

肺氣腫是指終末期細(xì)支氣管遠(yuǎn)端的氣道彈性減退、過度膨脹充氣及容積增大或同時伴有氣道壁破壞的病理狀態(tài)。臨床上，根據(jù)發(fā)病原因肺氣腫分為老年性肺氣腫、代償性肺氣腫、阻塞性肺氣腫及灶性肺氣腫等多種類型。其中老年肺氣腫病因較多，主要與支氣管阻塞、蛋白酶-抗蛋白酶失衡等有關(guān)，還有部分患者與吸煙、感染及大氣污染有關(guān)。老年肺氣腫臨床表現(xiàn)為呼吸困難、運(yùn)動時氣短及乏力等，這些嚴(yán)重影響了患者的身體健康及正常生活。地塞米松是治療老年肺氣腫的常用藥物，能改善患者癥狀，但遠(yuǎn)期治療預(yù)后較差，且長期用藥不良反應(yīng)發(fā)生率較高。AMP依賴的蛋白激酶(AMP-dependent protein kinase,AMPK)是一種保守的蛋白激酶，具有α、β及γ三種亞基，主要作用是協(xié)調(diào)代謝與控制能量平衡，參與細(xì)胞的衰老與早衰調(diào)控，但在老年肺氣腫中的應(yīng)用研究較少。因此，本文以老年SD大鼠作為肺氣腫模型開展研究，探討AMPK在老年大鼠肺氣腫中的應(yīng)用效果及對炎癥因子的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

老年SD大鼠40只[醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物合格證號SCXX(川)-2017-0001]，24月齡(相當(dāng)于老年人60歲以上)，體質(zhì)量(233.00±12.00)g。酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司)、高速冷凍離心機(jī)(KUBOTA)、恒溫振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)、酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(美國RD Biosiences公司)、蘇木素伊紅(HE)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)及手術(shù)器械(本醫(yī)院提供)。

1.2 方法

1.2.1 分組 按隨機(jī)數(shù)表法將40只大鼠分為空白對照組、模型組、地塞米松組和聯(lián)合干預(yù)組，每組10只。除對照組外，余3組大鼠采用煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)滴注豬胰彈性蛋白酶法完成大鼠肺氣腫動物模型制作。模型構(gòu)建成功后，對照組與模型組大鼠常規(guī)腹腔灌注5 ml生理鹽水，1次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。地塞米松組大鼠腹腔灌注等體積地塞米松(三才石岐制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H44024276)2 mg/kg，1次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。聯(lián)合干預(yù)組大鼠在地塞米松組基礎(chǔ)上聯(lián)合AMPK二甲雙胍(北京圣永制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20058567)250 mg/kg腹腔灌注，聯(lián)合藥物體積5 ml，連續(xù)干預(yù)14 d。干預(yù)過程中大鼠未出現(xiàn)不良反應(yīng)及死亡情況。

1.2.2 老年大鼠肺氣腫模型構(gòu)建 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食。將大鼠放置在大小為70 cm×40 cm×30 cm的自制熏箱中，熏箱側(cè)壁開有大小為5 cm×5 cm的通氣孔2個，對大鼠點(diǎn)燃5只煙卷，每隔15 min通氣1次，2次/d，每天總暴露時間2 h，每周5 d，連續(xù)熏蒸4個月。大鼠在熏箱內(nèi)可自由活動及飲水。第1、15天，大鼠氣道內(nèi)滴入豬胰彈性蛋白酶溶液3 ml(2 kU/kg)(當(dāng)天不進(jìn)行煙熏)。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)HE染色。各組大鼠干預(yù)完畢后，每組取老年SD大鼠5只，以斷頸方式處死，取肺部組織，常規(guī)石蠟包埋后制備5 μm切片，蘇木精15 min染色，倒置顯微鏡下觀察肺部組織情況。(2)炎癥因子。每組取老年SD大鼠5只，以斷頸方式處死，迅速打開胸腔，分離肺臟組織，將PBS 3 ml通過氣管注入肺內(nèi)，保持壓力1.96 kPa，注射器反復(fù)回抽3次，回收灌洗液，回收率80.0%視為合格。利用200目篩網(wǎng)過濾灌洗液并將其收集在離心管中，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法完成大鼠腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-a，TNF-a)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-8水平的測定。(3)生化指標(biāo)。取上述分離的灌洗液標(biāo)本，分離后采用全自動生化分析儀完成白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞比例及淋巴細(xì)胞比例測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠肺組織HE染色結(jié)果

對照組HE染色下未見異常。模型組大鼠HE染色下呼吸性支氣管、肺泡大小不一，肺泡數(shù)量明顯減少，肺泡間隔變薄，部分間隔斷裂導(dǎo)致肺泡融合等肺氣腫樣改變。地塞米松組大鼠肺泡數(shù)目略減少，肺泡間隔一般，可見少許間隔斷裂，伴有肺氣腫樣改變。聯(lián)合干預(yù)組大鼠肺氣腫樣改變不明顯，肺泡數(shù)量未見明顯減少(圖1)。

2.2 4組大鼠炎癥因子水平比較

與對照組比較，模型組和地塞米松組TNF-a、IL-6及IL-8水平顯著升高；與模型組比較，地塞米松組和聯(lián)合干預(yù)組TNF-a、IL-6及IL-8顯著降低；與地塞米松組比較，聯(lián)合干預(yù)組TNF-a、IL-6及IL-8水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表1)。

2.3 4組大鼠生化指標(biāo)比較

與對照組比較，模型組和地塞米松組白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞比例顯著升高；與模型組比較，地塞米松組和聯(lián)合干預(yù)組白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞比例顯著降低；與地塞米松組比較，聯(lián)合干預(yù)組白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞比例顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表2)。

圖1 4組大鼠肺組織HE染色結(jié)果

Group TNF-aIL-6IL-8Joint intervention213.69±15.32#△102.49±7.46#△89.43±6.59#△Dexamethasone243.66±18.68?#323.32±25.69?#132.31±10.51?#Model261.39±23.21?753.23±43.24?323.59±17.85?Control178.53±19.5596.58±0.0674.55±5.68

TNF-a: tumor necrosis factor-a; IL-6: interleukin-6; IL-8: interleukin-8. Compared with control group,*P<0.05; compared with model group,#P<0.05; compared with dexamethasone group,△P<0.05.

表2 4組大鼠生化指標(biāo)比較

GroupWhite blood cellcount (×108/L)Neutrophilratio (%)Lymphocyteratio (%)Joint intervention6.31±1.12#△21.59±4.31#△21.29±3.45#△Dexamethasone9.48±1.35?#25.69±5.32?#32.51±4.34?#Model13.29±1.46?34.69±4.64?43.53±5.77?Control3.49±0.6817.35±3.2412.29±2.45

Compared with control group,*P<0.05; compared with model group,#P<0.05; compared with dexamethasone group,△P<0.05.

3 討 論

肺氣腫好發(fā)于老年人群中，多為吸煙、感染、大氣污染等有害因素刺激引起的終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端的氣道彈性減退、過度膨脹，造成充氣與肺容量增大，部分可伴有氣道壁破壞。臨床研究表明，肺氣腫是慢性阻塞性肺疾病的主要病理改變之一，能引起氣道炎癥細(xì)胞聚集、細(xì)胞因子與炎癥因子的大量釋放，且常伴有蛋白酶的過度表達(dá)，增加機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而造成肺氣腫病理變化，導(dǎo)致機(jī)體黏液分泌細(xì)胞增多，上皮下纖維化與氣道發(fā)生重構(gòu)。在本研究中，以老年SD大鼠作為研究對象，構(gòu)建肺氣腫動物模型，并分別給予地塞米松、地塞米松及AMPK二甲雙胍聯(lián)合干預(yù)，HE染色結(jié)果表明，聯(lián)合干預(yù)組大鼠肺氣腫樣改變不明顯，肺泡數(shù)量未見明顯減少，說明AMPK能夠改善老年肺氣腫大鼠肺組織情況，利于大鼠恢復(fù)。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能調(diào)節(jié)細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)和代謝，已經(jīng)被證實(shí)是一種抗衰老、抗炎分子。在本研究中，聯(lián)合干預(yù)組大鼠肺組織TNF-a、IL-6及IL-8水平均低于地塞米松組和模型組(P<0.05)，說明AMPK能降低老年肺氣腫大鼠炎癥因子水平。TNF-a是一種能直接殺死腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，主要由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能抑制成骨細(xì)胞，刺激破骨細(xì)胞；IL-6也是一種細(xì)胞因子，主要由纖維母細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及多種瘤細(xì)胞產(chǎn)生，能參與機(jī)體免疫反應(yīng)，提高細(xì)胞增殖活性；IL-8屬于趨化因子家族中的一種細(xì)胞因子，參與、調(diào)節(jié)生殖生理、病理過程。TNF-a、IL-6及IL-8在正常機(jī)體中表達(dá)水平較低或不表達(dá)，但在肺氣腫大鼠中，持續(xù)的應(yīng)激反應(yīng)能增加TNF-a、IL-6及IL-8表達(dá)水平。而將AMPK用于老年肺氣腫中則能夠降低炎癥因子水平，緩解大鼠肺氣腫。另外，本研究結(jié)果還顯示聯(lián)合干預(yù)組干預(yù)后白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞比例及淋巴細(xì)胞比例水平均低于地塞米松組和模型組(P<0.05)，提示AMPK能夠降低老年肺氣腫大鼠生化指標(biāo)水平，能從根本上控制疾病的發(fā)展。盡管如此，我們的研究仍存在一定的局限性，一方面實(shí)驗(yàn)納入的大鼠數(shù)量較少，使得在完成有關(guān)數(shù)據(jù)分析、統(tǒng)計方面存在諸多局限性，仍需要進(jìn)一步研究、探討；另一方面，我們僅根據(jù)炎癥水平及生化指標(biāo)對肺氣腫進(jìn)行定量分析，未涉及其他如動脈血?dú)夥治鲋笜?biāo)(二氧化碳分壓及氧分壓等)，因此可進(jìn)一步收集數(shù)據(jù)進(jìn)行多方面驗(yàn)證。

綜上所述，AMPK二甲雙胍用于老年肺氣腫大鼠效果理想，能降低炎癥因子水平，改善肺組織的損傷，能為臨床肺氣腫治療提供思路。