消癌平對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2差異表達(dá)基因及可變剪接的影響

魏 柏， 楊盛力， 占 靜， 陳景三

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430077；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心

基因的可變剪接(alternative splicing, AS)是指來(lái)自于同一個(gè)基因座位的mRNA前體在剪接過程中產(chǎn)生的多基因異構(gòu)體現(xiàn)象，可變剪接增加生物體編碼蛋白的多樣性及調(diào)控基因表達(dá)的復(fù)雜性[1-3]?，F(xiàn)已明確可通過AS來(lái)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，對(duì)腫瘤AS的研究也逐步深入，對(duì)異常剪接機(jī)制的認(rèn)識(shí)為疾病的治療提供了新的作用靶點(diǎn)[4-5]。

消癌平源于中藥通關(guān)藤，具有消炎、清熱解毒、散結(jié)止痛等功效，臨床主要應(yīng)用于治療消化道腫瘤，且顯示出良好前景，但對(duì)其抗癌作用僅僅做了一些初步的探索[6-8]。為進(jìn)一步明確消癌平抗腫瘤的作用機(jī)制，本研究利用已有的癌癥基因組數(shù)據(jù)，對(duì)消癌平作用肝癌細(xì)胞HepG2前后的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEG)和AS特征進(jìn)行了比較分析，探討差異剪接基因(differentially spliced genes, DSG)在消癌平治療肝癌中的潛在作用機(jī)制，為后續(xù)研究消癌平抗腫瘤的分子機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；消癌平購(gòu)自南京圣和藥業(yè)有限公司(原液濃度為40 mg/L)；RNA質(zhì)檢為Agilent RNA 6000 Nano試劑盒；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)液，RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Life Technologies公司；轉(zhuǎn)錄測(cè)序委托華大基因公司采用Illumina HiSeq平臺(tái)檢測(cè)。

1.2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株HepG2采用質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，生長(zhǎng)至60%～80%融合時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)及本團(tuán)隊(duì)前期研究基礎(chǔ)[9]，以質(zhì)量濃度為40 mg/L的消癌平作用24 h后的肝癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，以未處理的HepG2細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析采用Trizol法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的總RNA提取，利用Nanodrop檢測(cè)RNA質(zhì)量。測(cè)序部分委托華大基因采用Illumina HiSeq平臺(tái)檢測(cè)完成，主要包括RNA文庫(kù)構(gòu)建，測(cè)序數(shù)據(jù)過濾和比對(duì)。

1.4 DEG功能分析采用PossionDis算法進(jìn)行DEG檢測(cè)，通過控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)來(lái)決定P值的閾值，DEG默認(rèn)定義為FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因，使用rMATS軟件檢測(cè)不同樣品間的AS，AS和DEG檢測(cè)通過基因本體(gene on tology, GO)和KEGG注釋結(jié)果及官方分類。

2 結(jié)果

2.1 消癌平作用前后HepG2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序過濾與參考基因組比對(duì)提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，其A260/A280為1.7～2.2，RIN≥7.0，28S/18S>0.7，證實(shí)已提取到高純度的RNA。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序過濾后使用基因比對(duì)軟件(Hierarchical indexing for Spliced Alignment of Transcripts, HISAT)比對(duì)到參考基因序列組，平均每個(gè)樣本的比對(duì)率達(dá)76.19%，同時(shí)樣品均勻的比對(duì)率表明樣品之間的數(shù)據(jù)具有可比性(見表1)。

表1 消癌平作用前后HepG2細(xì)胞測(cè)序及比對(duì)數(shù)據(jù)Tab 1 Effect of Xiaoaiping on genome maping in HepG2 %

2.2 消癌平作用前后HepG2中DEG檢測(cè)收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的RNA，采用Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序分析后，使用PossionDis算法進(jìn)行差異基因檢測(cè)。結(jié)果提示,本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序按照差異表達(dá)篩選標(biāo)準(zhǔn)得到DEG 608個(gè)，其中上調(diào)基因147個(gè)，下調(diào)基因461個(gè)(見圖1)。

注：A:基因表達(dá)量分布圖，顏色深淺表示不同表達(dá)量水平：FPKM≤1為極低表達(dá)水平的基因，F(xiàn)PKM 1～10為較低水平，F(xiàn)PKM≥10為中高表達(dá)水平;B：DEG量散點(diǎn)圖。X和Y軸均代表基因表達(dá)量的對(duì)數(shù)值，紅色代表上調(diào)的DEG，藍(lán)色表達(dá)下調(diào)的DEG，灰色代表非DEG。

圖1 消癌平作用HepG2前后DEG檢測(cè)
Fig 1 Effect of Xiaoaiping on DEG expression distribution in HepG2

2.3 消癌平作用前后HepG2中DSG檢測(cè)與參考基因組比對(duì)之后，利用rMATS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異剪接，對(duì)外顯子(SE)選擇性保留或切除、外顯子3′端或5′端可變剪接(A3SS或A5SS)、內(nèi)含子保留(RI)、相互排斥選擇性外顯子(MXE)這5種AS進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(見圖2)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組AS分別為19 265個(gè)和21 387個(gè)，且兩組均以SE最多而RI最少。與此同時(shí)還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組AS減少2 122個(gè)，兩組變化均以SE減少最多而A3SS減少最少。

2.4 消癌平作用HepG2前后DSG的GO功能分析對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的DSG通過GO功能進(jìn)行分類及富集分析。GO分為分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)和生物過程(biological process)三大功能類，對(duì)三大功能類單獨(dú)進(jìn)行進(jìn)一步的分類及富集分析(見圖3)。其中生物過程相關(guān)的DSG 22個(gè)，主要涉及行為、生物黏附、生物調(diào)控等；細(xì)胞成分相關(guān)DSG 13個(gè)，主要涉及細(xì)胞、細(xì)胞連接、細(xì)胞部分、胞外區(qū)域等；分子功能相關(guān)的DSG有8個(gè)，主要涉及催化活性、分子功能調(diào)控、分子傳導(dǎo)活性等。

圖2 消癌平作用于HepG2前后AS數(shù)目

注：X軸代表GO功能分類，Y軸表示對(duì)應(yīng)DEG數(shù)目。不同顏色代表不同剪接類型。

以AS差異最少的A3SS為例，進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組DSG做GO功能富集分析(見表2)，從GO的生物學(xué)過程富集條目結(jié)果來(lái)看差異基因的AS能夠顯著調(diào)節(jié)生物學(xué)過程，將成為后續(xù)研究關(guān)注的重點(diǎn)。

表2 DSG的功能富集分析

續(xù)表2

基因編號(hào)基因名稱 基因功能所在染色體名稱所在鏈方向P值FDR校正后的統(tǒng)計(jì)值1591CYP24A1biological_processcellular_componentmolecular_function chr20-0.0001280.0320081933EEF1B2biological_processcellular_componentmolecular_function chr20.0001480.03333756916SMARCAD1biological_processcellular_componentmolecular_function chr4+0.0002340.0478773149HMGB3biological_processcellular_componentmolecular_function chrX+0.0002670.0494063856KRT8biological_processcellular_componentmolecular_function chr12-0.0002850.049406

3 討論

肝癌是多因素、多步驟、多基因、多突變的結(jié)果。既往研究表明，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，許多基因的不同選擇性剪接產(chǎn)物在腫瘤中的功能也大不相同，但對(duì)其調(diào)控的相關(guān)研究剛剛起步，針對(duì)剪接基因的藥物是否提高腫瘤治療療效值得進(jìn)一步探索[4，10-11]。

隨著人類基因組計(jì)劃的初步實(shí)現(xiàn)，及大規(guī)模高通量實(shí)驗(yàn)手段的日益完善，使得從基因組范圍尋找可能的剪接基因成為可能。本研究利用RNA-seq技術(shù)檢測(cè)了消癌平對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響，篩選到消癌平處理前后肝癌細(xì)胞內(nèi)DEG共608個(gè)，其中具有表達(dá)上調(diào)的基因147個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因461個(gè)，提示消癌平對(duì)肝癌細(xì)胞基因的影響以下調(diào)為主。

目前已發(fā)現(xiàn)了多種mRNA的AS[12-14]，現(xiàn)已明確mRNA AS極大增加了真核生物基因表達(dá)的復(fù)雜程度和蛋白質(zhì)功能的多樣性，且與包括腫瘤在內(nèi)的疾病的發(fā)生存在密切聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中有大量AS，且兩組均以SE最多而RI最少，可見大量AS和肝癌細(xì)胞內(nèi)剪接調(diào)控模式的復(fù)雜性相關(guān)。此外，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組AS減少2 122個(gè)，可見消癌平相關(guān)的AS變化趨勢(shì)和DEG相同，與此同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)兩組變化均以SE為最多而A3SS最少為主，由此推測(cè)特異性剪接變異體的減少可能用以解釋消癌平的抗腫瘤作用[15]。

進(jìn)一步對(duì)A3SS這一可變剪接形式進(jìn)行分析，DSG中最為明顯的是RPL11、ACSL4、SEPT6等。核糖體蛋白L11(ribosomal protein L11，RPL11)是核糖體60S大亞基的重要組成部分，參與細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生等過程的調(diào)控。RPL11與抑癌蛋白ARF功能相類似，它能夠與癌蛋白HDM2相互作用，激活P53抑痛蛋白的活性；與癌蛋白c-Myc相互作用，負(fù)反饋調(diào)控c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性，由此推測(cè)RPL11本身可能具有腫瘤抑制功能[16]。ACSL4屬于多基因編碼家族酶，除了參與脂代謝，還通過PI3K/AKT、mTOR通路等調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖[17-18]，已有報(bào)道過表達(dá)ACSL4和肝癌患者預(yù)后相關(guān)[19]。DEG和DSG生物學(xué)通路重疊比例很高，提示相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)受到轉(zhuǎn)錄表達(dá)與外顯子剪接兩個(gè)水平的共同調(diào)控。上述變化一方面體現(xiàn)了DSG在腫瘤中的功能，另一方面也體現(xiàn)了消除DSG可能是消癌平作用于肝癌細(xì)胞靶點(diǎn)。

本研究中采用的芯片結(jié)果主要反映了基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化，但數(shù)據(jù)類型和測(cè)序方式等對(duì)AS產(chǎn)生影響，因此具有一定局限性，尚需進(jìn)一步研究。

本研究應(yīng)用RNA-seq篩選了消癌平對(duì)肝癌細(xì)胞DEG及AS表達(dá)的影響，在基因功能分析中獲取了消癌平可能參與抑制腫瘤相關(guān)的DSG，為深入探討消癌平在肝癌中的作用提供了新的線索。