鐵筷子花瓣中花青素苷成分及含量對其呈色的影響

陳思琪，孟 晗，衡 蒙，金雪花，孔祥瑩

(昆明理工大學 建筑與城市規(guī)劃學院，昆明 650504)

鐵筷子(HelleborusthibetanusFranch.)別名黑嚏根草、九牛七、小桃兒七，作為觀賞植物又稱之為圣誕玫瑰，為毛茛科鐵筷子屬多年生常綠草本[1-2]，因其在冬季開花、花期長，且花型葉型頗具觀賞價值，近年來逐漸成為深受人們喜愛的觀賞植物，但因該植物多為國外引種栽培，市價普遍居高，國內(nèi)對于鐵筷子觀賞價值的研究鮮有報道，因此開展鐵筷子觀賞性狀方面的研究工作迫在眉睫。

目前有關于毛茛科植物花色的研究已有不少記載，但對于毛茛科鐵筷子屬植物花色的研究還未見詳細報道，前人對鐵筷子的研究多以其種子培育[3]、藥用價值[4]、葉[5]及根莖化學成分[6-8]方面為主，其觀賞性狀方面的研究甚少，花色呈色機理尚未清楚。植物花色的呈色與其色素有關[9-11]，這些色素包括三大類：類黃酮、類胡蘿卜素和生物堿，花青素苷是類黃酮中最重要的一類水溶性色素[12-13]能夠使植物呈現(xiàn)從紅到藍的不同顏色，主要包含了矢車菊素、飛燕草素、矮牽牛素、錦葵素、天竺葵素和芍藥素等6類；此外花色的呈色還受金屬離子的螯合[14]、液泡pH等[15]多方面因素的影響。本研究選用7個不同花色的鐵筷子作為試驗材料，對不同品種花瓣中色素成分及含量進行分析，以期解析鐵筷子花色呈色機理，為該物種花色改良、新品種培育提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供試植物材料均于2020年12月下旬至2021年1月上旬期間收集并栽培在昆明理工大學園林植物溫室中直至花朵開放，選擇處于盛花期的不同單株且著色均勻的花瓣作為研究材料。按照顏色將7個品種鐵筷子分為紅色系(A、B)、紫色系(C)、粉色系(D、E)和黃色系(F、G)(圖1)。

圖1 鐵筷子各色系品種及編號Fig.1 The different varieties and numbers of H. thibetanus

1.2 花色表型測定

每個品種選擇3個長勢相近的不同單株采集花瓣，利用英國皇家園藝學會比色卡(RHSCC)進行比色和色差儀進行測色，測量環(huán)境選擇于室內(nèi)避免陽光直射的區(qū)域。使用RHSCC比色卡測色時將花瓣中間部分與比色卡進行比色，以3人在相同的角度和距離條件下觀察到的結果為依據(jù)記錄色系范圍。

使用色差儀(CR-400Konica Minolta China investment Ltd.)以光源C/2°為條件測量花色，測量時將花瓣正面平置于干凈的白紙上，將激光口對準花瓣中間部位進行測量，每個單株測量3次取平均值。記錄測量出的明度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)，并利用公式C*=[(a*)2+(b*)2]1/2；h°=arctan(b*/a*)計算出彩度C*和色相角的值h°。

1.3 色素種類及含量分析

1.3.1 花青素苷提取將存于-80 ℃條件下的鐵筷子樣品取出，放入研缽內(nèi)用液氮迅速研磨至細粉末狀，待液氮揮發(fā)后加入配制好的花青素苷提取液(V甲醇∶V水∶V甲酸∶V三氟醋酸=70∶27∶2∶1)提取花青素苷[16]。每250 mg樣品加入1 mL提取液，將樣品和提取液放入離心管混合，并置于震蕩器上充分震蕩后放置于4 ℃冰箱內(nèi)浸提，期間每隔12 h震蕩一次，待浸提24 h后用0.22 μm微孔濾膜過濾上清液得到樣品，保存于-80 ℃環(huán)境下以待檢測。

1.3.2 花青素苷成分及含量測定花青素苷含量的測定采用高效液相色譜法-光電二極管陣列檢測方法(HPLC-DAD)，檢測儀器為Agilent Q-TOF 6540液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，泵為P680型，自動進樣器(UltiMate 3000)，紫外可見光檢測器(DAD-100)，柱溫箱(TCC-100)，色譜柱為Agilent公司的ZORBAX型SB-C18(4.6 mm×250 mm)，濾鏡為5 μm。HPLC測定條件為：設置流動相A、B兩項，A相為水∶甲酸∶三氟醋酸=97.9∶2∶0.1；流動相B相為水∶乙腈∶甲酸∶三氟醋酸=62.9∶35∶2∶0.1。進樣前先進行超聲脫氣和0.2 μm超微過濾，進樣量為10 μL，柱溫25 ℃，流速0.8 mL/min。流動相B的洗脫梯度為：0～3 min，10%～10%；3～30 min，10%～20%；30～40 min，20%～45%；40～45 min，45%～80%；45～56 min，80%～10%；56～65 min，10%～10%；在波長為525 nm處檢測花瓣中花青素苷吸收的峰面積[17-18]。采用半定量法計算花青素苷含量，根據(jù)HPLC-DAD分析結果，對氯化矢車菊素(Cyanidin chloride)進行線性回歸分析，繪制其濃度與峰面積之間的標準曲線，利用待測樣品的峰面積計算花青素苷濃度及鐵筷子花瓣中花青素苷的含量。所用標準品購于成都普思生物科技股份有限公司。

花青素苷成分的定性分析采用高效液相色譜-電噴霧離子化-質(zhì)譜聯(lián)用技術(HPLC-ESI-MS)選取具有典型特征的樣本進行測定，再根據(jù)特征離子進行花青素苷結構的推定。液相色譜分析條件及程序同上，質(zhì)譜檢測條件為：電噴霧離子化(ESI)，離子阱分析器，全質(zhì)量掃描范圍(m/z):100～1 700 u；正離子檢測模式，毛細管電壓為3 500 V，噴霧器壓力200 kPa，毛細管出口電壓100 V,保護蓋出口電壓117 V，干燥溫度350 ℃，干燥氣體流速為8.0 L/min[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析和逐步多元回歸分析。

2 結果與分析

2.1 花色表型分析

通過分析7個品種鐵筷子花瓣的明度(L*)、紅度(a*)和黃度 (b*)值發(fā)現(xiàn)不同品種的鐵筷子花色越深則L*值越低(表1)，其中黃色(G)、黃紅色(F)及桃粉色(E)的品種L*值相比于深紅色(A)、紫紅色(B)及紫色(C)品種的L*值較高，且顏色最深的B品種L*值為7個品種中最低的。紫色(C)品種的a*值最高，其次是深紅色(A)品種，而兩個黃色系品種紅度值(a*)是最低的。反觀b*值，黃色品種(G)的b*值最高，紫色品種(C)的b*值最低。由于彩度值(C*)是通過a*值和b*計算得到的，因而紅度和黃度值對C*值影響比較大，在所測品種中黃色品種的彩度值較高，而紫紅色品種的彩度值最低。

表1 鐵筷子各品種花瓣花色表型

對7個品種的鐵筷子所測的L*、a*、b*值和C*值進行擬合曲線分析，經(jīng)過相關性檢驗及分析得出L*值與a*值呈顯著的負相關(R2=0.8142)，(圖2，A)；L*值與b*值呈顯著的正相關(R2=0.7042)，(圖2，B)；L*值與C*值呈顯著的正相關(R2=0.5522)，(圖2，C)，由此說明鐵筷子花瓣的b*、C*值均為其花色的明暗程度變化的影響因素。

A為L*值與a*值的相關性分析；B為L*值與b*值的相關性分析；C為L*值與C*值的相關性分析圖2 鐵筷子花瓣L*與a*、b*和C*的關系Fig.A is the correlation analysis between L* value and a* value; Fig.B shows the correlation analysis between L* value and b* value. Fig.C shows correlation analysis between L* value and C* valueFig.2 The relationship between L* and a*, b*,C* of H. thibetanus flowers

2.2 鐵筷子花青素苷結構的推定分析

采用高效液相色譜法在波長525 nm處對鐵筷子樣品進行檢測，結果(表2)顯示在供試的7個品種中有2個品種未檢測出花青素苷的成分，為桃粉色(E)和純黃色(G)，其余的5個品種共檢測出11種不同類型的花青素苷成分，將它們按保留時間由短到長依次編號為：S1～S11。

表2 鐵筷子花瓣中花青素苷HPLC-ESI-MS分析及結構推定

利用HPLC-ESI-MC技術輔助獲得樣品的特征峰，根據(jù)不同保留時間的出峰情況和特征離子的質(zhì)荷比(m/z)進行推算花青素苷的種類和結構;參照紫外可見光譜440 nm波長下吸收峰與最大波長下吸收峰的比值(A440/Avis-max)判斷花青素苷是否發(fā)生5位取代，若比值小于20%則5位被糖苷化，比值大于30%時花青素苷的結構為3-O-糖苷類型且5位處未發(fā)生糖苷化[20];根據(jù)290～340 nm處是否有肩峰的出現(xiàn)判斷化合物是否被芳香酸?；痆21]，以往的研究表明同科植物具有相似的代謝途徑，在毛茛科植物中發(fā)現(xiàn)含有槐糖修飾的花青素苷[22]，推測在鐵筷子花瓣色素成分中可能含有槐糖基團的修飾。

自然條件下的花青素極不穩(wěn)定，需要與糖類結合形成穩(wěn)定的花青素苷，再進一步甲基化、?；揎椥纬刹煌N類的花青素苷[28]，從而影響植物花色的呈色?；ㄇ嗨氐奶腔揎検紫仍贑-3位[20]，有時進一步C-5、C-7位糖基化[24],花青素苷經(jīng)過?；揎椏尚纬筛叻€(wěn)定性和顯色性的花青素苷，?；幕鶊F分為脂肪?；?主要有乙二酰基、丙二酰基、丁二?；?、乙?；?與芳香?；?主要有肉桂?；⑾愣辊；?、咖啡?；?[29-30]。

本研究檢測出的11種花青素苷中有6種矢車菊素苷(S1、S3、S4、S7、S10、S11)；4種飛燕草素苷(S2、S5、S8、S9)以及一種矮牽牛素苷(S6)，它們分別使植物呈紅色、藍色和紫色。通過紫外可見光分析發(fā)現(xiàn)供試的鐵筷子品種中所含花青素均只在C-3位置上發(fā)生了糖苷化，?；揎椂嘁苑枷沲；鶠橹?，脂肪酰基為輔。深紅色品種的色素成分中有5種花青素苷被芳香?；揎?，紫紅色和紫色品種中均含有4種酰基修飾的花青素苷，粉白色品種中含有3種?；揎椀幕ㄇ嗨剀?，黃紅色品種中僅含2種?；揎椀幕ㄇ嗨剀?。不同糖基、?；男揎検菍е妈F筷子花色差異的一個原因，本研究在鐵筷子花瓣中發(fā)現(xiàn)含有芳香?；揎椀钠贩N花瓣藍移進而使花色加深。

2.3 鐵筷子花瓣花青素苷含量分析

采用標準品半定量法計算7種鐵筷子花瓣中總花青素苷含量(TA)，結果顯示(表3)品種A(深紅色花瓣)中總花青素苷含量最高，品種B(紫紅色花瓣)次之，然后依次是品種C(紫色花瓣)、品種D(粉白色花瓣)、品種F(黃紅色花瓣)，但在G(黃色花瓣)、E(桃粉色花瓣)中未檢測出花青素苷成分。所檢測出含有花青素苷的5個品種均含有矢車菊素和飛燕草素，在品種C(紫色花瓣)中除了飛燕草素和矢車菊素之外，還檢測到矮牽牛素成分。其中品種A(深紅色花瓣)矢車菊素的含量占總花青素苷含量的84.96%，植物呈現(xiàn)出深紅色；品種B(紫紅色花瓣)中，飛燕草素的含量占總花青素苷含量的75.91%，花瓣呈現(xiàn)出紫紅色；品種C(紫色花瓣)中矢車菊素含量占總花青素苷含量的56.79%，矮牽牛素含量占總花青素苷含量的25.10%，飛燕草素含量僅占總花青素苷含量的18.11%;品種D(粉白色花瓣)中，矢車菊素和飛燕草素含量分別占總花青素苷含量的53.11%和46.89%，品種F(黃紅色花瓣)中分別為54.54%和45.46%。綜上，矢車菊素苷和飛燕草素苷為鐵筷子總花青素苷含量的主要貢獻者。

表3 不同品種鐵筷子的總花青素苷含量和主要花青素苷含量

進一步通過制作擬合曲線來分析花青素苷含量與不同花色之間的關系，將總花青素苷的含量(TA)作為自變量，以所測的L*、a*、b*、C*值作為因變量形成擬合曲線(圖3，A～D)。圖3顯示，總花青素苷含量與紅度值(a*)呈正相關,與L*、b*、C*值呈負相關關系，其中與L*值之間的相關性顯著(回歸系數(shù)為0.8671)與a*、b*、C*值之間的相關性不顯著。當總花青素苷含量的累積，則a*值增加，花瓣的顏色越趨向紅色。

A為總花青素苷含量與L*值的相關性分析；B為總花青素苷含量與a*值的相關性分析；C為總花青素苷含量與b*值的相關性分析；D為總花青素苷含量與C*值的相關性分析圖3 鐵筷子花瓣TA與L*、a*、b*和C*的關系A shows the correlation analysis between total anthocyanin content and L* value; B shows the correlation analysis between total anthocyanin content and a* value; C shows the correlation analysis between total anthocyanin content and b* value. Fig.D shows correlation analysis between total anthocyanin content and C* valueFig.3 The relationship between TA and L*, a*, b*, C* of H. thibetanus Franch. flowers

將矢車菊素苷、飛燕草素苷含量分別與L*、a*、b*、C*值進行相關性分析，以矢車菊素苷和飛燕草素苷作自變量，L*、a*、b*、C*值作因變量繪制擬合曲線，以此推導數(shù)量關系發(fā)現(xiàn)色素含量除與紅度值(a*)呈正相關外，與L*、b*、C*均呈現(xiàn)負相關，但單一種類的花青素苷含量與L*、a*、b*值之間未見顯著的相關性，除飛燕草素苷與L*值之間的回歸系數(shù)R2=0.511以外，其他系數(shù)均小于0.5。

3 討 論

植物花青素苷的累積量不同影響著植物花色明度、紅度、黃度和彩度的變化[12,31],本研究供試的7種鐵筷子花瓣的L*值由低到高分別為紫紅色、深紅色、紫色、粉白色、桃粉色、黃紅色、純黃色，且L*值與總花青素苷的含量TA值呈顯著負相關，即隨著花青素苷的積累明度下降，這與前人研究的紫花含笑(Micheliacrassipes)[32]、麗格海棠(Riegerbegonia)[33]有關花青素苷含量對花色明度影響的結果一致，說明花青素苷含量的變化是影響鐵筷子花色明暗變化的重要因素之一。從花青素苷含量與花瓣的彩度值、紅度值方面的分析來看，隨著總花青素苷含量增加鐵筷子花瓣的彩度值下降，這與王歡等[34]對雙色百合(bicolor lily)研究的結論一致；花青素苷含量的增加鐵筷子花瓣的紅度值也增加，植物花瓣所呈現(xiàn)的顏色越向紅色偏移，該結果與前人對貼梗海棠[Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai][21]研究中花青素苷含量的累積有助于紅色形成的結論相符。值得注意的是品種B中總花青素苷含量不是本研究所有品種中最高，但其顏色卻是最暗，在關于深色花的相關研究中發(fā)現(xiàn)致使花色變深的原因不僅有花青素苷的高積累，還有花瓣顯微結構下色素的分布[35]、花瓣的結構特點、不同花青素苷對呈色的貢獻[36]以及其他色素(如原花青素苷)的作用等多方面因素，因此本研究中B品種鐵筷子顏色深的原因有待進一步研究。

花青素苷的不同成分是影響其花色變化的重要因素，不同的花青素、修飾基團的數(shù)量和修飾方式都對植物花色呈色產(chǎn)生不同程度的影響。在檢測出花青素苷的5個品種中矢車菊素為主要的色素物質(zhì)，其次為飛燕草素,在石蒜屬(LycorisHerb)植物[31]和耐寒睡蓮(Nymphaeaspp.)[13]中也發(fā)現(xiàn)矢車菊素和飛燕草素兩類花青素為影響呈色的主要物質(zhì)。矢車菊素苷和飛燕草素苷分別是使植物呈紅色和藍色的重要物質(zhì),兩者同時存在時可使植物呈現(xiàn)出紫紅色。花瓣著色會向含量更高的色素偏移，而其他色素成分則起到輔助作用[37]，在供試材料B品種中檢測出2種飛燕草素衍生物和3種矢車菊素衍生物，該品種中飛燕草素衍生物的含量是矢車菊素衍生物含量的3倍多，在兩種色素的共同作用下花色呈現(xiàn)紫紅色。酰基化的作用使植物藍色加深[38-40]，本研究發(fā)現(xiàn)含有多種?；揎椀娘w燕草素苷[41]的鐵筷子所呈現(xiàn)的紫色越深，即品種B、C中含有2類酰基化飛燕草素苷，而品種A中僅含有1類，品種B、C比A的顏色越向藍色偏移呈現(xiàn)出越深的紫色。此外，脂肪族?；头枷阕艴；揎棇﹁F筷子花色的呈現(xiàn)也有影響，通常情況下脂肪族酰基化對花青素苷的顏色變化影響較小[42]，芳香?；ㄇ嗨剀毡戎觉；姆€(wěn)定性更強[43]，在鐵筷子花瓣的色素結構分析中發(fā)現(xiàn)酰基修飾多以芳香酰基為主，咖啡酰、香豆酰、肉桂酰的修飾可能是鐵筷子花色產(chǎn)生差異的因素。

綜上，花青素苷的成分及含量是導致鐵筷子花瓣呈現(xiàn)不同顏色的主要原因，矢車菊素苷和飛燕草素苷的互作以及酰基化的修飾使鐵筷子呈現(xiàn)不同程度的紫色，花青素苷的不同累積量影響了花瓣顏色的明暗變化，從而使鐵筷子花瓣顏色豐富。本研究的結果為鐵筷子花色呈色機理的研究奠定了基礎，為進一步挖掘花色基因、花色改良、培育花色新品種提供一定的參考。