蘇云金芽孢桿菌毒性研究

李依韋 尹萌萌 袁琴

摘要?以菜青蟲(chóng)為試驗(yàn)材料，用蘇云金芽孢桿菌浸泡過(guò)的小白菜飼喂菜青蟲(chóng)，提取菜青蟲(chóng)體內(nèi)的伴孢晶體，通過(guò)生物測(cè)定法對(duì)蘇云金芽孢桿菌的毒性進(jìn)行研究，并對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變篩選高毒性菌株。結(jié)果表明，蘇云金芽孢桿菌毒性與伴孢晶體含量有關(guān)，伴孢晶體含量越多，毒力越高;紫外誘變16min時(shí)得到菌株B16，伴孢晶體含量比出發(fā)菌株提高8.2%，殺蟲(chóng)效率比出發(fā)菌株提高77%。該研究為蘇云金芽孢桿菌生產(chǎn)高效率生物農(nóng)藥提供菌種。

關(guān)鍵詞?蘇云金芽孢桿菌;伴孢晶體;毒力測(cè)定;紫外誘變

中圖分類號(hào)?Q939.96文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）20-0159-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.042

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Toxicity Study of Bacillus thuringiensis

LI Yi?wei，YIN Meng?meng，YUAN Qin?（College of Life Science，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao，Inner Mongolia 028000）

Abstract?Cabbage caterpillar were used as research materials in the experiment，which was fed cabbage caterpillars with cabbage soaked in Bacillus thuringiensis.Parasporal crystals from Pieris rapae was extracted，study on the toxicity of Bacillus thuringiensis by bioassay and screening of highly virulent strains by UV mutagenesis of the starting strains were done.The results showed that the toxicity of Bacillus thuringiensis was related to the content of spore crystals，the more the content of the accompanying spore crystal，the higher the virulence.The strain B16 obtained by UV mutagenesis at 16min raised the content of parasporal crystals by 8.2% compared with the original strain，insecticidal efficiency raised by 77% compared to the original strain.The study provides strains for the production of high?efficiency biological pesticides by Bacillus thuringiensis.

Key words?Bacillus thuringiensis;Parasporal crystal;Virulence determination;UV mutagenesis

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中害蟲(chóng)防治是一項(xiàng)重要任務(wù)，隨著人們環(huán)保意識(shí)的不斷增強(qiáng)，生物農(nóng)藥正引起廣泛關(guān)注[1]。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）制劑克服了傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥污染環(huán)境、危害人畜、易產(chǎn)生抗性等缺點(diǎn)，具有選擇性強(qiáng)、安全、原料簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是目前用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲(chóng)劑[2]。

利用蘇云金芽孢桿菌生產(chǎn)的生物農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大[3]。對(duì)100多種害蟲(chóng)有致病和毒殺作用。針對(duì)目前蘇云金芽孢桿菌殘效期短、殺蟲(chóng)譜窄、見(jiàn)效慢的問(wèn)題，篩選高毒力菌株以提高蘇云金芽孢桿菌生物制劑的殺蟲(chóng)效果成為研究熱點(diǎn)[4]。筆者對(duì)蘇云金芽孢桿菌進(jìn)行紫外誘變，篩選得到高毒力菌株，為以后生產(chǎn)高毒性生物農(nóng)藥提供菌種。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?菌種。蘇云金芽孢桿菌（內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.1.2?菜青蟲(chóng)。

在室外人工種植小白菜，使其自然生長(zhǎng)，定期進(jìn)行觀察，會(huì)有蟲(chóng)卵出現(xiàn)[5]，均采用菜青蟲(chóng)幼蟲(chóng)，其體征表現(xiàn)為青綠色，體圓筒形，中段較肥大，背部有一條不明顯的斷續(xù)黃色縱線，氣門線黃色，每節(jié)的線上有2個(gè)黃斑。密布細(xì)小黑色毛瘤，各體節(jié)有4～5條橫皺紋。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?蘇云金芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線繪制。將純化的蘇云金芽孢桿菌單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)1 h，此時(shí)測(cè)得細(xì)胞濃度為93.9%。取此培養(yǎng)物接種于LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處每隔2 h測(cè)定吸光度，繪制生長(zhǎng)曲線。每次測(cè)完吸光度的菌液番紅染色，顯微鏡下觀察伴孢晶體[6-7]。在伴孢晶體出現(xiàn)期間，每隔2 h從菌液中取8 mL菌液于離心管中，離心管命名為E11、E12、E1 用于后續(xù)測(cè)定伴孢晶體。

1.2.2?伴孢晶體制備。

配制溶菌酶溶液500、250、200、100 μg/mL，各取200 μL分別加入含有1 mL菌液的離心管中， 20 min后染色鏡檢觀察細(xì)胞的完整性。選擇500 μg/mL的溶菌酶制備孢晶混合液。

在“1.2.1”中每隔2 h取培養(yǎng)物加入配好的500 μg/mL溶菌酶溶液1 mL，溶解20 min后 -20 ℃冷凍30 min，取出立即放入40 ℃水浴中溫浴15 min，反復(fù)凍融3次，即為孢晶混合液。將孢晶混合液高速低溫離心20 min，棄上清，蒸餾水懸浮沉淀物，振蕩使懸浮液產(chǎn)生大量泡沫，棄去泡沫，重復(fù)幾次，直到產(chǎn)生很少的泡沫為止，重復(fù)此操作2次后收集沉淀， 40 ℃烘干得到淡黃色晶體蛋白粗提物，即為伴孢晶體[8]。

1.2.3?蘇云金芽孢桿菌毒力測(cè)定。

1.2.3.1?不同培養(yǎng)時(shí)間出發(fā)菌株毒力測(cè)定。

通過(guò)葉片浸泡飼喂法，在菌液培養(yǎng)到22～30 h時(shí)，每2 h取菌液進(jìn)行毒力測(cè)定，將菌液依次命名為A22、A24、A26、A28、A30。將新鮮的白菜嫩葉切割成3～4 cm見(jiàn)方的小塊，并用刀背在葉片上劃成縱橫交錯(cuò)的刻痕，然后浸入菌懸液中，使葉片各部分比較均勻地接觸菌液然后取出，陰干，最后放入養(yǎng)蟲(chóng)瓶。不同時(shí)間菌液各放入菜青蟲(chóng)（2～3齡健康幼蟲(chóng)）9頭，室溫下培養(yǎng)，每天觀察死亡情況，根據(jù)下列公式計(jì)算死亡率并進(jìn)行分析，篩選蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生毒蛋白的最佳時(shí)間[9]。

死亡率=死亡菜青蟲(chóng)數(shù)供試菜青蟲(chóng)數(shù)×100%

校正死亡率=處理組死亡率-對(duì)照組死亡率1-對(duì)照組死亡率×100%

1.2.3.2?菜青蟲(chóng)腸道內(nèi)菌群及其毒力檢測(cè)。

為了驗(yàn)證蘇云金芽孢桿菌導(dǎo)致菜青蟲(chóng)死亡，把殺死的菜青蟲(chóng)腸液取出接入液體培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)20 h，顯微鏡下觀察。繼續(xù)培養(yǎng)至26 h，以“1.2.3.1”中方法和條件測(cè)定毒力，其結(jié)果與出發(fā)菌株毒力相比較[10]。

1.2.3.3?紫外誘變。

將培養(yǎng)26 h的蘇云金芽孢桿菌按照“1.2.2”方法制備孢晶混合液進(jìn)行紫外誘變，誘變時(shí)間為12、14、16、18、20 min，編號(hào)B12、B14、B16、B18、B20，誘變菌液用于菌種篩選。

1.2.3.4?誘變菌液毒力測(cè)定。

不同誘變時(shí)間的菌液按“1.2.3.1”中方法進(jìn)行毒力測(cè)定，分別在12、24、36、48 h計(jì)算菜青蟲(chóng)死亡率。同時(shí)對(duì)誘變菌液進(jìn)行培養(yǎng)并按照“1.2.2”中方法提取伴孢晶體，每種誘變菌液設(shè)置3個(gè)重復(fù)F21、F22、F2 提取結(jié)果與出發(fā)菌株比較篩選高毒力菌株。

2?結(jié)果與分析

2.1?蘇云金芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，0～8 h為遲緩期，顯微鏡下觀察到此期間菌體形態(tài)細(xì)小且數(shù)量較少，8～20 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌體增大，數(shù)量急劇增長(zhǎng)。20～26 h為穩(wěn)定期，此時(shí)菌體生長(zhǎng)遲緩。26 h后進(jìn)入衰退期，菌體數(shù)量下降。

每2 h觀察菌體形態(tài)，在培養(yǎng)20 h后芽孢開(kāi)始出現(xiàn)，后逐漸增多，22 h有伴孢晶體形成。

2.2?不同培養(yǎng)時(shí)間伴孢晶體含量

由表1可知，在培養(yǎng)22～26 h，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，伴孢晶體增多，26 h時(shí)最多，為0.010 5 g/mL。培養(yǎng)26～30 h伴孢晶體數(shù)量呈下降趨勢(shì)。

2.3?不同培養(yǎng)時(shí)間出發(fā)菌株毒力測(cè)定?由表2可知，將各菌株浸泡過(guò)的小白菜給菜青蟲(chóng)飼喂后，殺蟲(chóng)效率經(jīng)SPSS 22.0軟件分析，殺蟲(chóng)率有顯著差異（P<0.05）。

由圖2可知，培養(yǎng)不同時(shí)間蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)率不同，A26菌株殺蟲(chóng)率最高，即培養(yǎng)26 h的菌液殺蟲(chóng)效果最好，毒性最強(qiáng)。

2.4?腸液菌株檢測(cè)及毒力測(cè)定

由圖3可知，在同一培養(yǎng)時(shí)間下，菜青蟲(chóng)腸液內(nèi)蘇云金芽孢桿菌毒力比出發(fā)菌株低，與腸液內(nèi)的蛋白對(duì)菌株毒性有減弱作用有關(guān)，這與邵宗澤等[11]的研究結(jié)果一致。

2.5?誘變菌株毒力測(cè)定

由表3可知，用誘變后菌株浸泡過(guò)的小白菜飼喂菜青蟲(chóng)，殺蟲(chóng)效率經(jīng)SPSS 22.0軟件分析，與出發(fā)菌株比較B16在不同誘變時(shí)間殺蟲(chóng)效果均顯著高于其他菌株（P<0.05）。

由圖4可知，B14、B16、B20菌株的殺蟲(chóng)率均比出發(fā)菌株高，但B16菌株殺蟲(chóng)效果最好，與出發(fā)菌株相比，殺蟲(chóng)率提高77%。

2.6?誘變菌株伴孢晶體含量

分別提取B12、B14、B16、B18、B20在培養(yǎng)26 h時(shí)的伴孢晶體，并提取出發(fā)菌株伴孢晶體作對(duì)照。由表4可知，B16菌株伴孢晶體含量最高，為0.011 36 g/mL，與出發(fā)菌株相比提高8.2%。

3?結(jié)論

該研究利用蘇云金芽孢桿菌毒殺菜青蟲(chóng)，并測(cè)定不同時(shí)間菌株的殺蟲(chóng)能力以及伴孢晶體含量，通過(guò)紫外誘變技術(shù)獲得高毒力誘變菌株。結(jié)果表明菌株毒力的強(qiáng)弱與伴孢晶體含量有關(guān)，伴孢晶體量越多，菌株毒力越強(qiáng);篩選到一株高毒力菌株B16，其伴孢晶體含量比出發(fā)菌株提高8.2%，毒力比出發(fā)菌株提高77%，為以后蘇云金芽孢桿菌高毒力菌株的選育提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉石泉，單世平，夏立秋.蘇云金芽孢桿菌高效價(jià)殺蟲(chóng)劑的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（7）：1091-1095.

[2] 何獻(xiàn)君.蘇云金芽孢桿菌對(duì)菜青蟲(chóng)的防治技術(shù)研究[D].成都：四川師范大學(xué)，2003.

[3] 趙應(yīng)，姜培躍.4種生物農(nóng)藥對(duì)高粱蚜蟲(chóng)的田間防控研究[J].植物醫(yī)生，2019，32（1）：20-22.

[4] 周愛(ài)萍，羅定榮，余兵.蘇云金桿菌WP防治水稻稻縱卷葉螟田間藥效試驗(yàn)[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2019，25（6）：54，75.

[5] 王利平，代林遠(yuǎn)，李鵬.蘇云金芽孢桿菌研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（9）：224-227.

[6] 李恩杰.蘇云金芽胞桿菌和伊氏殺線真菌對(duì)松材線蟲(chóng)致病毒力的研究[D].北京：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，2018.

[7] 王子佳，李紅梅，弓愛(ài)君，等.蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的制備[J].化學(xué)與生物工程，2009，26（9）：56-58.

[8] 李雪，馬玉超，李煦，等.蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：5920-5924.

[9] 石美林，江濤.1.1%阿維·蘇云金桿菌可濕性粉劑對(duì)小菜蛾的田間防效研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2018（9）：146，148.

[10] 劉景坤，高華山，師永東，等.幾種殺蟲(chóng)劑防治西蘭花小菜蛾的藥效評(píng)價(jià)試驗(yàn)[J].中國(guó)農(nóng)技推廣，2019，35（1）：77-79.

[11] 邵宗澤，喻子牛.昆蟲(chóng)中腸液性質(zhì)對(duì)蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體毒力的影響[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2002，45（3）：384-390.