連麥系列及部分澳麥品質性狀相關基因的分子檢測

張廣旭 孫中偉 王康君 郭明明 李強 陳鳳 樊繼偉

摘要?小麥品質性狀是由多個位點控制的數量性狀。為明確連云港市農業(yè)科學院選育的112份新品系及引進的16份澳大利亞種質資源品質基因分布情況，利用主要HMW-GS（Bx7、By8、By9和Dx5）、抗穗發(fā)芽（Vp1B3）、黃色素質量YP7A及1B/1R的特異性標記進行分子檢測。結果顯示，共檢測到56種品質基因組合類型，供試材料基因組合豐富多樣。連麥A1731檢測到含有6個優(yōu)異品質基因及非1B/1R易位系;檢測到含有Dx5及多個HMW-GS基因且非1B/1R易位系材料29份;利用分子標記檢測技術手段可助力連云港市農業(yè)科學院優(yōu)質小麥新品種選育及種質資源篩選，從而提高連云港市農業(yè)科學院小麥品質育種新步伐。

關鍵詞?小麥;品質性狀;分子標記

中圖分類號?S512文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）20-0037-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.011

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Molecular Detection for Quality Traits?Related Genes in Lianmai Series and Australian Wheat Varieties

ZHANG Guang?xu，SUN Zhong?wei，WANG Kang?jun et al（Institute of Lianyungang Agricultural Science of Xuhuai Area/Lianyungang Institute of Agricultural Sciences，Lianyungang，Jiangsu 222000）

Abstract?Wheat quality traits are quantitative traits controlled by multiple loci.In order to clarify the 112 new lines selected by the author and the distribution of 16 Australian germplasm quality genes，the main HMW?GS （Bx7，By8，By9 and Dx5），anti?ear germination （Vp1B3），yellow pigment quality YP7A And 1B/1R specific markers for molecular detection.A total of 56 gene type combinations were detected.Lianmai A1731 detected 6 excellent quality genes and non?1B/1R translocation lines; at least Dx5 and multiple HMW?GS genes were detected and did not contain 1B/1R 17 parts of translocation material; functional molecular marker detection can help the author to select high?quality wheat varieties，which is expected to improve the new pace of wheat quality breeding in the author.

Key words?Wheat; Quality characters; Molecular markers

連麥系列品種的選育為江蘇省淮北區(qū)域全國麥區(qū)及高產穩(wěn)產、品優(yōu)及抗逆發(fā)揮了重要作用，早熟品種連麥7號被評為“江蘇好品種”，同時為稻茬晚播早熟小麥品種提供了保障[1]。前人對已育成的連麥系列品種的選育過程及形態(tài)特征等方面進行了較多系統(tǒng)研究[2-7]，但整體研究其小麥品質方面的報道較少。小麥的品質形成及加工產品的優(yōu)質是受多個基因位點控制的數量性狀且易受環(huán)境影響。高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS）對小麥面筋形成及質量具有決定性作用，進而會影響到加工產品的優(yōu)劣。HMW-GS對小麥的面團特性和面筋強度發(fā)揮著重要作用，并且不同類別的HMW-GS組合對小麥品質改良的貢獻各異[8-10]。HMW-GS主要受基因Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1等不同基因型組合所控制編碼，Glu-A1位點上Ax2*亞基優(yōu)于Null亞基編碼;Glu-B1位點主要由Bx7、By8、By9或Bx17、By18的基因組合，這些組合比其他亞基組合優(yōu)越;Glu-D1位點上的Dx5與Dy10基因組合對加工產品具有較大促進作用，Dx5與Dy10緊密連鎖可利用Dx5標記準確快速的檢測和判斷小麥品種中是否含有Dx5+Dy10[11]。含有1B/1R易位小麥品種的面筋質量下降，因其易位系上含有編碼黑麥堿蛋白會導致面粉吸水量增加、面團黏性增大，從而造成加工品質變劣[9，12-13];近年極端天氣時有發(fā)生，小麥在成熟期常遇陰雨天氣便會造成穗發(fā)芽。穗發(fā)芽使小麥產量降低和品質變差，使小麥籽粒的淀粉水解，進而降低面筋強度，最終使得面條的韌性和彈性變差。Vp-1B3對控制胚成熟和休眠發(fā)揮重要作用，是與穗發(fā)芽密切相關的主要基因之一[14]。對小麥加工面制品來說，使用亮度好和低黃色素質量分數小麥面粉對成品的良好外觀起到關鍵作用，研究和選育低黃色素質量分數的新品種是改良成品主要途徑，在7A染色體的Psy-A基因位點對低黃色素質量分數貢獻較大，標記YP7A與其緊密連鎖，能有效區(qū)分出控制高、低黃色素質量分數的等位基因[15-16]。如今，許多小麥科研工作者已開發(fā)出多種基于上述基因內部等位基因差異的功能標記[17-22]，這些分子標記能夠初步檢測品質相關基因組成。國內很多小麥育種單位已選育出較多品質優(yōu)良品種。根據《2018年度中國小麥質量狀況報告》，2018年度生產上品質表現好品種有山農26、濟麥229、新麥26、藁優(yōu)5218、龍麥60、中優(yōu)578、西農511、偉隆169共8個強筋小麥品種，對國內優(yōu)質小麥市場發(fā)揮重要作用。為進一步加速連云港市農業(yè)科學院品質育種進程及了解連云港市農業(yè)科學院新育成的品系品質情況，為后續(xù)的遺傳育種和生產應用方面提供理論支撐，連云港市農業(yè)科學院選育了112份小麥新品系及16份澳大利亞品種資源，利用重要HMW-GS（Bx7、By8、By9和Dx5）的基因位點標記、抗穗發(fā)芽（Vp1B3）基因位點標記、黃色素質量YP7A及1B/1R的特異性標記進行連麥系列及部分澳麥分子檢測，分析了連云港市農業(yè)科學院育成品系中所含相關品質基因的種類及分布情況，為連云港市農業(yè)科學院小麥品質育種提供有價值的遺傳信息，從而加快品質育種選育進程。

1?材料與方法

1.1?供試材料

供試材料為112份連云港市農業(yè)科學院自主選育的高世代（F6：7）穩(wěn)定品系和引進的澳大利亞種質資源16份。2017—2018年，在連云港市農業(yè)科學院小麥育種基地種植128份供試材料并建穗行譜繁種，成熟時收獲。

1.2?基因組DNA的提取

供試材料在穗行譜收獲的種子中選取3粒發(fā)芽，7 d后選取每份材料新鮮幼嫩的幼苗，利用SDS法提取小麥總基因組DNA，利用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計檢測DNA質量，進而進行相關品質基因位點的檢測，并依據檢測結果確定供試材料所含有基因型。

1.3?PCR 擴增及電泳檢測

根據已發(fā)表的小麥與品質特性相關的主要基因（Bx7、By8、By9、Dx5、Vp1B3、YP7A及1B/1R），引物均由擎科生物（南京）合成。以上所列特異分子標記與品質相關基因的相應引物名稱、序列及其他相關信息見表1。聚合酶鏈式反應在 Eppendorf nexus GSX1 PCR儀中進行擴增，目的基因相對的PCR反應相關程序采用表1

參考文獻方法進行。用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，凝膠濃度為1%，電極溶液為1×TAE緩沖溶液，并在120 V恒壓下進行電泳30 min。利用國產凝膠成像系統(tǒng)與設備掃描成像并進行結果統(tǒng)計分析。

2?結果與分析

2.1?供試小麥材料中部分HMW-GS的分布

利用HMW-GS部分特異標記檢測可以快速推斷該材料是否含有該亞基。在Glu-B1位點，標記Bx7可擴增出兩種目的條帶如圖?擴增出669 bp的供試材料含有Bx17，同時可以擴增出來630和766 bp共2條帶型的供試材料含有Bx7亞基;By8特異性標記在供試材料中如擴增出527 bp目的條帶如圖2，則該材料含By8亞基;By9的標記標可以同時擴增出707和662 bp共2條目的類型，但是只有擴增出662 bp的目的條帶材料含By9材料（圖3）;在Glu-D1位點，標記Dx5在含有該目的亞基的品種中可擴增出目的條帶為450 bp（圖4）。經統(tǒng)計結果分析，128份供試材料中含By9亞基材料數最多為74份，占總檢測材料的57.81%，其中包含連麥系列材料59份，澳大利亞材料15份;其次為Dx5亞基，共計53份占總檢測材料的41.41%，其中連麥系列46份，澳大利亞材料7份;在供試材料都檢測到65份含有Bx7或By8，占總檢測品系百分率50.78%;其中含有By7的65份材料均為連云港市農業(yè)科學院自主選育的，含有By8的材料包含連麥系列60份，澳大利亞材料5份;含Bx17材料15份，占總檢測材料的11.72%，其中包含連麥系列9份材料，澳大利亞材料6份。

2.2?1B/1R易位系的分布

利用1B/1R易位系的特異性標記對128份供試材料進行檢測，含1B/1R易位系的材料可擴增出1 500 bp的目的條帶，條帶類型如圖5。含有1B/1R易位系共檢測出38份，占所有檢測材料的29.69%，均為連云港市農業(yè)科學院自主選育新品系;澳大利亞材料未檢測到含有1B/1R易位系的材料。

2.3?抗穗發(fā)芽基因檢測

穗發(fā)芽共顯性STS功能標記Vp1B3可擴增出849、569或652 bp的3種目的條帶類型，其結果分別表示含有Vp1Bb和Vp1Bc抗穗發(fā)芽基因型及Vp1Ba易感穗發(fā)芽基因型。通過分子檢測共有78份材料擴增出目的條帶569 bp，含有抗穗發(fā)芽基因Vp1Bc，占供試材料的60.94%，其中連云港市農業(yè)科學院自主選育62份，澳大利亞16份材料均含有抗穗發(fā)芽基因;未檢測到Vp1Bb（849 bp）。共有26份材料檢測出含有感穗發(fā)芽基因型Vp1Ba（652 bp），其中連麥系列24份，占連云港市農業(yè)科學院自主選育品系的18.75%。

2.4?黃色素含量

YP7A是判定黃色素水平的主要關鍵基因位點，主要與八氫番茄紅素合成酶（PSY）的PSYA1基因有關，利用該標記可擴增出194和231 bp大小的片段，分別代表高黃色素含量等位基因PSY-A1a和低黃色素含量等位基因PSY-A1b（圖6）。通過利用該特異標記對材料檢測，在128份材料中共檢測到26份低黃色素PSY-A1b材料，占供試材料的20.36%，其中連麥系列21份，澳大利亞材料7份;共檢測到102份含高黃色素PSY-A1a材料，占供試材料的79.69%，其中連麥系列93份，澳大利亞材料9份。

2.5?供試材料的品質基因型分析

含HMW-GS基因Bx7、By8、By9、Dx5及抗穗發(fā)芽基因Vp-1Bc、低黃色素含量等位基因Psy-A1b和非1B/1R易位系對小麥品質及加工產品具有正向促進作用，有利于提高小麥的面筋強度和改善面條、饅頭等面制品的顏色。統(tǒng)計結果分析顯示，128份供試材料共有56種基因類型組合。連麥A1731是唯一檢測到同時含有6個優(yōu)異品質基因及非1B/1R易位系的小麥新品系，該品系作為優(yōu)質特色小麥進行小麥參試同時可作為優(yōu)質育種的親本。含有Dx5優(yōu)質亞基面筋的小麥面筋強度大，其貢獻大于其他幾個亞基，檢測到含有Dx5及多個HMW-GS基因且非1B/1R易位系材料28份（不包含連麥17A31），共計16種基因組合類型;連麥A1779、連麥A17107和AU7共3份材料含抗穗發(fā)芽基因Vp1Bc和低黃色素含量等位基因Psy-A1b，比其他24份材料優(yōu)異;連麥A1728含低黃色素含量等位基因Psy-A1b，但其也含有穗發(fā)芽敏感基因Vp1Ba，易發(fā)生穗發(fā)芽;經主要優(yōu)異品質基因檢測，連麥系列共計檢測到22份材料在品質基因方面較為突出，占供試總材料的19.64%，具有多種優(yōu)異品質基因的材料比例相對較小，這些優(yōu)異品系可作為品質育種方向材料種質及推薦品系參試;澳大利亞7份材料含優(yōu)異品質基因較多且整體不含1B/1R易位系。

3?討論

3.1?功能標記助力品質育種

近年來為適應國內對優(yōu)質小麥的需求，國內許多育種單位已經在注重產量的基礎上更注重品質的改良，連云港市農業(yè)科學院也加大加速了品質育種進程。蘆靜等[23]對高分子量谷蛋白亞基PCR 檢測結果與SDS-PAGE 電泳結果進行比較，吻合率都在95%左右，采用基因特異性標記可快速鑒別小麥品質并進行分子標記輔助選;白升升等[24]研究證明，分離膠濃度為8.5%的SDS-PAGE與HMW-GS分子標記方法相結合鑒定的方法更加準確。馬紅勃等[25]認為基于該基因的功能性PCR技術不受環(huán)境和發(fā)育期的限制，比SDS-PAGE和化學檢測更方便、準確、可靠。根據前人研究結果和結合當下實際情況，筆者認為相對于SDS-PAGE，采用功能性標記作為品質輔助手段更快捷，如需進一步深入挖掘研究品質特性等可以兩者結合，并對其加工產品進行更深一步探索。

3.2?品質基因及其組合分布情況

該研究采用的7個特異性標記在供試材料中均檢測出，單個基因在材料中檢測到除PSY-A1b外比例都較高，但其優(yōu)異組合類型較少。優(yōu)質亞基Dx5可增強小麥品種面筋強，改善面筋質量，但1B/1R易位系的引入對小麥品質有極顯著的負面影[26]，該研究共檢測到29份含有Dx5且不含1B/1R易位系材料，占供試材料的25.89%，比例相對較低，原因在于連云港市農業(yè)科學院早期更關注豐產性和抗病性，對品質相關方面研究較少，同時對含有1B/1R易位系材料在未來品質育種對該部分材料應慎用。在供試材料中只檢測到Vp1Bc未檢測到含抗穗發(fā)芽Vp1Bb基因材料，需引進新的種質資源提高小麥穗發(fā)芽抗性。小麥品質是一個復雜的網絡機制，小麥含有優(yōu)質基因但對其加工產品及用途還需進一步探索。下一步應將篩選出來的幾份優(yōu)異品系進行面包、饅頭和面條等產品的加工與評價，為優(yōu)質專用小麥篩選奠定基礎。

4?結論

利用主要HMW-GS（Bx7、By8、By9和Dx5）、抗穗發(fā)芽（Vp1B3）、黃色素質量YP7A及1B/1R的特異性標記進行分子檢測，共檢測到56種基因類型組合，供試材料基因組合豐富多樣。連麥A1731檢測到含有6個優(yōu)勢品質基因及非1B/1R易位系的優(yōu)質小麥新品系;檢測到至少含有Dx5及多個HMW-GS基因且不含1B/1R易位系材料28份;連麥A1779、連麥A17107和AU7 共3份材料含抗穗發(fā)芽基因Vp1Bc和低黃色素含量等位基因Psy-A1b。連麥系列共計檢測到25份材料在優(yōu)異品質基因方面較為突出且對穗發(fā)芽具有一定抗性。澳大利亞7份材料在品質優(yōu)質基因方面較為突出且整體不含1B/1R易位系。連云港市農業(yè)科學院在小麥品質育種與品質系統(tǒng)研究方面進度較緩慢，其自主選育主要品系及種質資源的主要品質基因分布、組成尚不明確，通過分子標記輔助可快速、簡便、助力選育優(yōu)質小麥新品種，有望提高小麥品質育種新步伐。

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