玉米黃曲霉毒素污染拮抗菌的篩選·鑒定及控制效果

杜立武 高素艷 杜瑞煥 張立田 王玉麗 項(xiàng)愛麗 董李學(xué)

摘要?黃曲霉毒素是飼料等農(nóng)副產(chǎn)品中重要的有毒有害污染物，是一類強(qiáng)致癌性、劇毒性真菌毒素，對畜禽健康危害巨大。該研究對黃曲霉毒素污染拮抗菌開展研究，為黃曲霉毒素污染治理提供技術(shù)支持。從河北遷安、遷西、遵化、玉田及豐南飼用玉米或飼料中分離細(xì)菌，通過室內(nèi)外試驗(yàn)，獲得對黃曲霉具有較強(qiáng)拮抗力的菌株B45和B6。經(jīng)分子生物學(xué)及理化性質(zhì)鑒定，菌株B45和B6為解淀粉芽孢桿菌。進(jìn)一步開展了B45和B6對黃曲霉菌絲生長的抑制作用、黃曲霉毒素的消減作用及黃曲霉毒素的分解作用研究，結(jié)果表明，拮抗菌可以顯著抑制產(chǎn)毒黃曲霉菌絲生長，降低黃曲霉毒素的產(chǎn)生及消除黃曲霉毒素。

關(guān)鍵詞?農(nóng)產(chǎn)品;飼料;黃曲霉毒素污染;拮抗菌;抗菌活性

中圖分類號?TS210.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）20-0007-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.20.002

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Screening，Identification and Control Effects of Aflatoxin?contaminated Antagonistic Bacteria in Corn

DU Li?wu?GAO Su?yan2， DU Rui?huan2，3 et al

（1.The Agricultural and Pastoral Bureau of Qianxi County，Tangshan，Hebei064000;2.Tangshan City Food and Drug Comprehensive Inspection and Testing Center，Tangshan，Hebei 063000;3.Hebei Province Agricultural Products Quality and Safety Engineering Technology Research Center，Tangshan，Hebei063000）

Abstract?Aflatoxin is a kind of important pollutants in corn and fodder，is extremely strong harmful for beasts and birds health.Aflatoxin?contaminated antagonistic bacteria was screened in order to provide support for controlling aflatoxin.The antagonistic bacteria were isolated from corn kernel and fodder in Qianxi，Qianan，Zunhua，Yutian and Fengnan County.Through indoor screening and control test，two strong strains B45 and B6 were obtained.B45 and B6 isolation were characterized to be Bacillus subtilis by molecular biology and physiology.They were studied on several aspects including the inhibition against the germination of Aspergillus spores，the inhibition against the growth of A.flavus，the extension of their mycelia，the reduction of the aflatoxin production，and the degradation effects of aflatoxin.The results showed that the inhibition strains could significantly inhibit the growth of toxin?producing Aspergillus strains and the extension of their mycelia，reduce the production of aflatoxin，as well as the degradation of aflatoxin.

Key words?Agricultural products;Fodder;Aflatoxin contamination;Antagonistic bacteria;Antagonistic activity

玉米是世界上重要的糧食作物和飼料原材料，它們在收獲、儲藏、轉(zhuǎn)運(yùn)及加工過程中極易受到霉菌的侵染而染毒，特別是黃曲霉毒素。黃曲霉毒素（Aftatoxin）是主要由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等曲霉屬真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的致癌性和毒性，廣泛存在于玉米、花生、油菜籽和稻米等農(nóng)產(chǎn)品中[1-3]。這將嚴(yán)重威脅農(nóng)產(chǎn)品及食品的質(zhì)量安全，影響人畜健康[1-3]。如何科學(xué)高效地治理農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素污染是一個(gè)亟待解決的全球性難題。根據(jù)現(xiàn)有的研究，黃曲霉毒素能夠?qū)е聞游锏母喂δ芟陆?、降低動物的免疫力、影響奶牛的產(chǎn)奶量，受到毒素污染的動物更易感染其他微生物而發(fā)病，通常年幼的動物對黃曲霉菌較敏感，更易受到毒素污染的危害[4-6]。

自黃曲霉毒素被發(fā)現(xiàn)以來，科技人員研究出許多毒素治理的辦法和措施，包括物理、化學(xué)脫毒等方法。但上述辦法或多或少都存在一定的局限性和不足，甚至?xí)r(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)造成極大的破壞，且化學(xué)方法可能會造成二次污染，因而極大地限制了這些方法的應(yīng)用。黃曲霉毒素污染重在源頭治理，生物防控由于綠色環(huán)保、生態(tài)安全、防治兼?zhèn)涠饾u受到科研人員的青睞[7-8]。以黃曲霉及其毒素為研究對象，構(gòu)建抑黃曲霉毒素拮抗菌高效篩選體系，篩選有效微生物菌株，研究其抗菌活性、抑毒效果及解毒能力，以期為農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素污染治理探索新的途徑。

1?材料與方法

1.1?供試菌株

黃曲霉菌株由筆者所在團(tuán)隊(duì)從玉米籽粒中分離獲得;拮抗菌從河北省遷安市、遷西縣、遵化市、玉田縣及豐南區(qū)等多個(gè)玉米主產(chǎn)區(qū)的飼用玉米籽粒上分離獲得。

1.2?內(nèi)生菌的獲得?將從各個(gè)區(qū)縣采回的玉米籽粒帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離，將籽粒放在3%的次氯酸鈉溶液中浸泡3～5 min，然后用無菌水沖洗3～5次，瀝干水分備用。用研缽將玉米籽粒研碎后放置LB平板上，于28℃恒溫條件下培養(yǎng)，及時(shí)分離生長良好的單菌落并進(jìn)行純化，在LB斜面上保藏備用[9-10]。

1.3?拮抗菌離體篩選?采用離體對峙培養(yǎng)法對黃曲霉拮抗菌進(jìn)行篩選，具體方法

參考文獻(xiàn)[10]。

1.4?拮抗菌活體篩選

拮抗菌培養(yǎng)液、發(fā)酵液、上清液及濾液的準(zhǔn)備及活體篩選參照文獻(xiàn)[10]的方法。

1.5?拮抗菌對黃曲霉的抑制作用

1.5.1?上清液和過濾液制備。將活化后的拮抗菌于37℃在LB培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)， 160 r/min振蕩48 h，制備的培養(yǎng)液在12 000 r/min條件下離心15 min，分離的上清液用0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾后制備成過濾液。

1.5.2?菌懸液制備。培養(yǎng)液離心后棄上清，加入無菌水制備成菌懸液。

1.5.3?蛋白粗提液。為達(dá)70%的飽和度，在上清液中加入固體硫酸銨，過夜后在10 000 r/min及4℃下離心20 min，在沉淀中加入pH7.0磷酸緩沖液進(jìn)行懸浮，然后用0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾。

1.5.4?拮抗菌對黃曲霉菌絲生長及毒素產(chǎn)生的影響。將黃曲霉培養(yǎng)在制備好的上清液、過濾液及蛋白粗提液中，測定其對黃曲霉菌生長及其毒素的作用[9]。

1.5.5?拮抗菌對黃曲霉毒素的消減作用。將4種黃曲霉毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)品加入經(jīng)拮抗菌發(fā)酵24 h的肉湯培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng)2、4、6 d 后，檢測毒素含量，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5.6?模擬胃液的耐受性試驗(yàn)。模擬胃液的制備參照Huang等[11]的方法，將0.5 mL菌液加入4.5 mL模擬胃液中，在振蕩器上混合后置于培養(yǎng)箱中在37 ℃條件下充分培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、2和4 h后取出并統(tǒng)計(jì)殘存芽孢的活菌數(shù)。

1.6?拮抗菌株的鑒定

1.6.1?常規(guī)鑒定。常規(guī)鑒定方法參見文獻(xiàn)[12]。

1.6.2?16S rDNA PCR擴(kuò)增及序列測定。拮抗菌DNA的提取采用試劑盒的方法。以27 F（5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）為引物擴(kuò)增拮抗菌16S rDNA。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃ 5 min;95 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 8 min。PCR擴(kuò)增體系：dNTPs （10 mmo1）l μL，模板DNA約10 pmol，引物27f 和R1492 （10 μmol/L） 各1 μL，引物Taq酶 （5 μmol/μL） 0.25 μL，10×PCR緩沖液5 μL，加重蒸水至50 μL。測序結(jié)果利用BLAST軟件在GenBank進(jìn)行同源性比較，鑒定拮抗菌。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌株分離

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色及出現(xiàn)早晚，從玉米籽粒中共獲得細(xì)菌350株，其中，從玉田獲得35株，從遷西獲得86株，從遷安獲得45株，從遵化獲得66株，從豐南獲得118株。

2.2?拮抗菌的篩選

2.2.1?離體拮抗效果。菌株B45對黃曲霉的抑制率可達(dá)97.5%，其次為菌株B162的96.0%和B6的94.5%，3株拮抗菌抑菌作用顯著（表1）。

2.2.2?活體條件下拮抗效果。

將離體條件下篩選獲得的具有較強(qiáng)拮抗效果的菌株在玉米籽粒中開展抑黃曲霉毒素污染活體拮抗試驗(yàn)，LC/MS/MS檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拮抗菌在玉米籽粒上對黃曲霉毒素污染表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制效果。其中，菌株B45對黃曲霉毒素的抑制效果可達(dá)75.5%，其次為B6的70.0%，B12的68.3%，

B162的63.8%，B325的60.0%，B45的55.5%，B88的50.5%，B253的50.0%。

2.3?拮抗菌代謝物對黃曲霉生長的效果

研究發(fā)現(xiàn)，拮抗菌培養(yǎng)液、上清液、過濾液及蛋白粗提液對黃曲霉抑制作用顯著。菌株B45培養(yǎng)液對黃曲霉菌絲生長的抑制率可達(dá)92%，其上清液、過濾液及蛋白粗提液對黃曲霉生長的抑制率分別達(dá)75.0%、70.5%及71.6%;菌株B6培養(yǎng)液對黃曲霉菌絲生長的抑制率達(dá)81.5%，其上清液、過濾液對黃曲霉生長的抑制率達(dá)70.0%、60.5%，與菌株B45相比，菌株B6蛋白粗提液抑菌率較低（表2）。

2.4?拮抗菌對黃曲霉毒素產(chǎn)生的抑制作用

研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉與菌株B45及B6混合培養(yǎng)后能顯著降低毒素的產(chǎn)生，培養(yǎng)72 h后4 種黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1及AFG2）均未檢出（表3）。

2.5?拮抗菌對毒素的降解作用

利用LC/MS/MS檢測技術(shù)，研究表明，拮抗菌B45和B6能夠顯著降解黃曲霉毒素。培養(yǎng)第4天時(shí)，拮抗菌對黃曲霉毒素AFG1和AFG2完全降解，均未檢出，對AFB1和AFB2的降解率在90%以上，表明菌株B45和B6能夠顯著降解黃曲霉毒素。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，拮抗菌對AFG1、AFG2 的降解速度顯著高于對黃曲霉毒素AFB1、AFB2的降解速度（表 4）。

2.6?模擬胃液的耐受性試驗(yàn)?試驗(yàn)顯示，在模擬胃液條件下，菌株B45活菌數(shù)比B6活菌數(shù)高;經(jīng)模擬胃液處理2、4 h后，菌株B45活菌數(shù)沒有顯著受到模擬胃液的影響，活菌率達(dá)95.75%，說明菌株B45對胃酸具有很強(qiáng)的耐受性（表5）。

2.7?拮抗菌B45和B6的鑒定

2.7.1?生理生化鑒定。

根據(jù)菌株B45和B6的理化指標(biāo)檢測結(jié)果（表6），結(jié)合文獻(xiàn)[10]，2株拮抗菌初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

2.7.2?16S rDNA的序列分析。

菌株B45和B6 PCR擴(kuò)增后得到1.48 kb左右的產(chǎn)物。后經(jīng)BLAST比對及Clustal W多重序列對比，2株拮抗菌與解淀粉芽孢桿菌菌株JF496388同源性可達(dá)98%，結(jié)合上述生理生化檢測指標(biāo)，將B45和B6鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

47卷20期杜立武等?玉米黃曲霉毒素污染拮抗菌的篩選·鑒定及控制效果

3?結(jié)論

黃曲霉毒素能夠嚴(yán)重污染農(nóng)產(chǎn)品及食品，威脅人畜健康，甚至導(dǎo)致死亡。目前，世界各國都在積極采取措施來消除農(nóng)產(chǎn)品中霉菌毒素污染問題，但難以用一般的加工處理方法去除[13-16]，化學(xué)方法又存在二次污染的危害，因此探索高效靈敏的霉菌毒素污染的治理措施勢在必行。農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素污染重在源頭治理，生物防控及生物降解毒素的方法由于綠色環(huán)保、生態(tài)安全而備受科學(xué)家的青睞[12，17-18]。該研究針對飼用玉米中黃曲霉毒素污染防控難題，采用對人體無害、對環(huán)境友好的生物防治技術(shù)，以期為我國玉米黃曲霉毒素污染治理探索一條有效途徑。該試驗(yàn)從350株菌中分離獲得對黃曲霉毒素具有較強(qiáng)拮抗能力的菌株2株，離體條件下對毒素的抑制率均在97%以上，活體條件下控毒效果也可達(dá)60%，其中菌株B45可達(dá)75.5%，效果顯著，具有極大的開發(fā)應(yīng)用潛力。代謝產(chǎn)物抑菌解毒試驗(yàn)表明，2株拮抗菌（B45、B6）培養(yǎng)液、上清液、過濾液及蛋白粗提液能顯著降低黃曲霉生長和毒素產(chǎn)生。另外研究發(fā)現(xiàn)，獲得的2株拮抗菌能夠顯著抑制黃曲霉菌絲生長，抑制和減輕黃曲霉侵染和毒素污染的發(fā)生。先期的研究中，國內(nèi)外已有利用微生物來降解黃曲霉毒素的報(bào)道，孔青等[19]發(fā)現(xiàn)海洋巨大芽孢桿菌對黃曲霉毒素的抑制率可達(dá)50.8%;Abbas 等[20]證明不產(chǎn)毒素的黃曲霉能夠抑制黃曲霉產(chǎn)毒，抑毒率可達(dá)65%。該試驗(yàn)篩選獲得的拮抗菌B45及B6具有更強(qiáng)的抑菌控毒效果，且發(fā)現(xiàn)消除黃曲霉毒素的物質(zhì)主要為蛋白類代謝物，具有廣闊的應(yīng)用前景。但2株拮抗菌對黃曲霉毒素的消除機(jī)制、微生態(tài)區(qū)系的影響及農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的影響有待于進(jìn)一步研究。

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