野生草莓種子高效萌發(fā)體系及離體再生體系的建立

趙映潔　徐煒　白本文　段可　朱開才

摘 要 以野生草莓YW種子及其無菌苗葉片為試驗材料，分別建立野生草莓種子高效萌發(fā)體系及葉片離體再生體系。結(jié)果表明：通過隔夜浸泡，旋渦振蕩儀清洗草莓種子，并用5%NaClO消毒5 min，春化7 d，草莓種子萌發(fā)率高達73%;葉片最適不定芽誘導植物生長調(diào)節(jié)劑配比為IBA 0.1 mg·L-1+6-BA 3.4 mg·L-1。

關(guān)鍵詞 野生草莓種子;高效萌發(fā);離體再生

中圖分類號：S668.4 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.21.001

草莓（Fragaria×ananassa Duchesne）屬薔薇科、草莓屬多年生草本植物，是十分美味的水果之一[1]。全世界草莓屬約24個種，主要分布在亞洲、歐洲和美洲[2]。我國地域遼闊，氣候類型多樣，有著豐富的草莓資源，是世界上野生草莓種類最豐富的國家[3]。野生草莓具有廣泛的適應性和多種優(yōu)良特性，有些野生草莓在風味、品質(zhì)、抗病蟲害等方面表現(xiàn)突出，可以作為改良栽培草莓的重要材料[4]。但國內(nèi)有關(guān)草莓離體再生的報道大多都為栽培草莓，野生草莓離體再生的研究在國內(nèi)報道較少[5-9]?；诖?，以野生草莓Yellow Wonder（YW）為試驗材料建立高效的無菌種子萌發(fā)體系及葉片離體再生體系，為提高栽培草莓的品質(zhì)和抗病蟲害能力等良種培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料

飽滿有活力的YW種子。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

種子萌發(fā)培養(yǎng)基及不定芽誘導培養(yǎng)基均添加7 g·L-1的瓊脂，pH為5.7～5.8，121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min備用。

除暗培養(yǎng)外，所有試驗材料的培養(yǎng)條件均為16 h（光）/8 h（暗），光強2 000～3 000 lx，溫度23～25 ℃。

1.1.3 試劑

1/2MS、MS、IBA、6-BA、瓊脂、蔗糖等，均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 YW種子消毒處理

YW種子浸泡過夜，隔天用旋渦振蕩儀清洗，用剪過的1 mL槍頭吸掉雜質(zhì)及癟種，直至上清液完全澄清;分別使用3% NaClO、4% NaClO、5% NaClO消毒5 min，期間用旋渦振蕩儀低速振蕩;立即吸掉消毒液，無菌水清洗6～8次，然后吸打在1/2MS平板上，晾干水分后封口;每個處理3個重復，4 ℃春化7 d，報紙遮光處理21 d后統(tǒng)計萌發(fā)率及污染率。

1.2.2 YW不定芽誘導

選取YW葉齡及生長狀態(tài)一致的繼代組培苗葉片，去掉葉緣，剪成0.3～0.5 cm2的小塊，正面朝下置于6-BA濃度梯度為3.0 mg·L-1、3.4 mg·L-1、3.8 mg·L-1的培養(yǎng)基上進行處理，每個處理3個重復，30 d統(tǒng)計愈傷，60 d統(tǒng)計不定芽。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS.17.0進行統(tǒng)計分析，WPS11.1進行作圖。

種子萌發(fā)率（%）=發(fā)芽種子粒數(shù)/萌發(fā)種子總粒數(shù)×100%

污染率（%）=污染外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

0級愈傷發(fā)生率（%）=0級愈傷發(fā)生外植體數(shù)/總接種外植體數(shù)×100%（1～4級愈傷發(fā)生率類推）

分化率（%）=出芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

根據(jù)愈傷發(fā)生面積將其分為0～4五個等級，如圖1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒液濃度確定

圖2結(jié)果表明，隨著NaClO濃度的升高，種子萌發(fā)率先升高后降低，最高可達90%。而污染率隨著NaClO濃度的升高而降低，當NaClO濃度達到5%時，污染率降到了0%，種子萌發(fā)率可達73%。

2.2 6-BA對YW葉片再生的影響

如圖3所示，用6-BA誘導愈傷組織的分化，當6-BA濃度達到3.4 mg·L-1時，YW的3級、4級愈傷相比3.0 mg·L-1

6-BA顯著增加，分別為44.0%和20.0%，且在該濃度下愈傷生長狀態(tài)良好。當6-BA濃度達到3.8 mg·L-1時，0級、1級愈傷均降至2.3%，4級愈傷增至34.1%。

圖4表明，YW在6-BA濃度達到3.4 mg·L-1時，相比其他兩個濃度不定芽分化率最高，達26.4%。

3 小結(jié)與討論

草莓種子小、種皮厚、吸水透氣性差且種子內(nèi)存在抑制物，導致種子發(fā)芽率極低，嚴重限制了草莓新品種雜交選育進程[7]?；诖?，通過消毒前浸泡種子，用旋渦振蕩儀創(chuàng)傷種皮的方法提高了消毒處理后草莓種子的萌發(fā)率，并得出了最佳的消毒條件：5%NaClO處理5 min。在該條件下消毒種子后春化7 d，種子萌發(fā)率可達73%，高于李文硯等[8]試驗中的70%。

有研究發(fā)現(xiàn)，在草莓葉片離體再生試驗中，細胞分裂素濃度高時會抑制不定芽的形成，促進愈傷組織的生長[9]。通過以上研究，發(fā)現(xiàn)隨著6-BA濃度的不斷升高，YW的愈傷再生率逐漸增大，當達到一定濃度時，愈傷誘導率可達100%，但不定芽誘導率卻隨著細胞分裂素濃度的增大呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢，這與前人研究結(jié)果一致。因此，葉片最適不定芽誘導植物生長調(diào)節(jié)劑的配比為：IBA 0.1 mg·L-1+6-BA 3.4 mg·L-1，不定芽發(fā)生率為26.4%。

參考文獻：

[1] Johnson AL， Govindarajulu R， Ashman TL. Bioclimatic evaluation of geographical range in Fragaria （Rosaceae）： consequences of variation in breeding system， ploidy and species age[J]. Botanical Journal of the Linnean Society，2014，176（1）：99-114.

[2] 雷家軍，薛莉，代漢萍，等.世界草莓屬（Fragaria）植物的種類與分布[A].中國園藝學會：草莓研究進展（IV）[C].2015.

[3] 雷家軍，代漢萍，譚昌華，等.中國草莓屬（Fragaria）植物的分類研究[J].園藝學報，2006（1）：1-5.

[4] 馬鴻翔，陳佩度.草莓屬低倍性野生資源在育種中利用的研究進展[J].果樹學報，2003，20（4）：305-309.

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[7] 梁中午，龐曉倩，馮彩蓮，等.3種浸種方法對草莓種子發(fā)芽率的影響[A].中國植物保護學會2018年學術(shù)年會論文集：綠色植保與鄉(xiāng)村振興[C].2018.

[8] 李文硯，孔方南，韋優(yōu)，等.草莓種子萌發(fā)成苗及高效離體再生體系的建立[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2016（10）：2463-2469.

[9] Landi L， Mezzetti B. TDZ， auxin and genotype effects on leaf organogenesis in Fragaria[J].Plant Cell Reports，2006，25（4）：281-288.

（責任編輯：趙中正）