內(nèi)源性甾體激素GC/MS分析中酮基衍生規(guī)律的研究

李 慧，付玉娟，焦麗麗，劉淑瑩，宋鳳瑞，吳 巍

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長春 130022)

甾體激素(steroid hormones)又稱類固醇激素，是一類四環(huán)脂肪烴化合物，在中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)中合成，被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)記物，在抗炎、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)性功能、促進機體發(fā)育等方面具有重要作用[1-2]。甾體激素的含量極低，檢測響應(yīng)值低，直接檢測難度較大，對檢測手段的靈敏度要求較高，是醫(yī)療、環(huán)境、畜牧業(yè)等領(lǐng)域研究的熱點和難點[3]。

甾體激素的檢測常采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)，該方法的靈敏度高，可實現(xiàn)多種成分同時檢測[4-7]。GC/MS應(yīng)用于甾體激素檢測時常需要對酮基和羥基進行衍生來提高樣品的揮發(fā)性，而酮基不含氫原子，是衍生反應(yīng)的難點。通常，酮基的衍生有烯醇化和肟化兩種方法，其中烯醇化的產(chǎn)物穩(wěn)定性較差，應(yīng)用范圍有限[8-10]；肟化反應(yīng)是將酮基在一定條件下與羥胺類物質(zhì)進行親核加成反應(yīng)，生成肟類物質(zhì)，產(chǎn)物穩(wěn)定性較好，同時N-的加成能夠提高樣品的信號強度。雖然肟化反應(yīng)應(yīng)用較早[11-12]，但是對甾體激素酮基肟化反應(yīng)的研究報道較少。甾體激素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同系物多，在衍生過程中易產(chǎn)生異構(gòu)化，衍生條件對衍生效果有較大影響[13]。因此，研究甾體激素的衍生過程具有重要意義。

本工作以12種內(nèi)源性甾體激素為研究對象，以甲氧胺(methoxyammonium chloride, MOX)和N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(N-methyl-N-trimethylsilyl trifluoroacetamide, MSTFA)為衍生化試劑，研究其肟化規(guī)律。通過GC/MS鑒定衍生物結(jié)構(gòu)，推測衍生反應(yīng)過程，考察衍生反應(yīng)條件，希望能夠建立一種甾體激素的GC/MS分析方法，為內(nèi)源性甾體激素的GC/MS分析提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TRACE1310氣相色譜儀，TSQ 8000三重四極桿質(zhì)譜儀：美國Thermo公司產(chǎn)品；MTN-2800D氮吹濃縮裝置：天津奧特賽斯儀器有限公司產(chǎn)品；SQP電子分析天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；H-2 BLENDER渦旋混合器：上海精勝儀器有限公司產(chǎn)品；HB120-S金屬?。荷虾Ｙ惒畼穬x器有限公司產(chǎn)品。

脫氫表雄酮(dehydroeppiandrosterone, DHEa)、雙氫睪酮(dihydrotestosterone, DHT)、雄酮(Androsterone, ADL)對照品：均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；表雄酮(epiandrosterone, Epian)、孕烯醇酮(pregnenolone, Preg)對照品：均為北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品；睪酮(testosterone, T)、雌酮(estrone, E1)、雄烯二酮(androstenedione, ASD)對照品：均為德國Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司產(chǎn)品；皮質(zhì)甾酮(corticosterone, B)、可的松(cortisone, E)對照品：均為梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；孕酮(progesterone, P)對照品：由中國食品藥品檢定研究院提供；別孕烯醇酮(Allopregnanolone, AP)對照品：加拿大TRC公司產(chǎn)品。

二氯甲烷(色譜純)：美國J.T. Baker公司產(chǎn)品；甲氧胺鹽酸鹽：梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺：北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品；甲醇(色譜純)：美國Tedia公司產(chǎn)品。

1.2 實驗過程

1.2.1色譜條件 色譜柱：Supelco SPBTM-5(15 m×0.53 mm×0.5 μm)；載氣為99.999%高純N2，流速1 mL/min；升溫程序：初始柱溫50 ℃，以10 ℃/min升至200 ℃，然后以5 ℃/min升至245 ℃，保持5 min，再以1.5 ℃/min升至248 ℃，保持1 min；進樣方式及進樣量：全掃描模式下分流比為20∶1，MRM檢測模式下不分流進樣，進樣量1 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件 EI離子源；MS傳輸管溫度280 ℃；離子源溫度280 ℃。從5 min起檢測，采用全掃描(Full Scan)模式鑒定衍生物結(jié)構(gòu)，質(zhì)量掃描范圍m/z50～800，定量分析時采用單反應(yīng)離子檢測(selective reaction monitoring mode, SRM)模式。

1.2.3樣品的衍生化方法 采用肟化結(jié)合硅烷化處理甾體激素。精密稱定各1 mg 12種標(biāo)準(zhǔn)對照品，用甲醇溶解后，精密量取100 μL，加入MOX的甲醇溶液，置于金屬浴中避光進行肟化反應(yīng)，氮氣吹干。在肟化反應(yīng)瓶中加入120 μL MSTFA，渦旋混合，置于70 ℃金屬浴中避光30 min進行硅烷化反應(yīng)，再次氮氣吹干，加入1 mL二氯甲烷渦旋復(fù)溶，過濾后待檢測。

1.2.4衍生條件的優(yōu)化 為獲得最佳的衍生條件，本實驗對肟化反應(yīng)過程中的衍生溫度、衍生化試劑用量和衍生時間等因素進行了考察。

衍生溫度：取100 μL濃度均為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入50 μL 10 g/L的MOX甲醇溶液，分別在25、40、60、80、100 ℃下衍生30 min；氮氣吹干后，加入200 μL MSTFA，于70 ℃反應(yīng)30 min，再次氮氣吹干，用1 mL二氯甲烷復(fù)溶，過濾，進樣。

衍生化試劑用量：取100 μL濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入30、50、60、70、80 μL濃度為10 g/L的MOX甲醇溶液，使MOX與酮基的比例分別為：10∶1，16∶1，20∶1，23∶1和27∶1，在80 ℃下反應(yīng)30 min；氮氣吹干后，加入200 μL MSTFA，于70 ℃下反應(yīng)30 min，用二氯甲烷復(fù)溶，過濾，進樣。

衍生時間：取100 μL 1 g/L的DHEA溶液，加入60 μL MOX溶液，于80 ℃下分別反應(yīng)30、40、50、60 min后，氮氣吹干，再加入200 μL MSTFA，于70 ℃反應(yīng)30 min，再次氮氣吹干，用二氯甲烷復(fù)溶，過濾，進樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 甾體激素衍生物的質(zhì)譜分析方法

肟化-硅烷化可以改變羥基和羰基的極性，提高樣品的揮發(fā)性。本實驗通過肟化-硅烷化兩步反應(yīng)對甾體激素進行衍生，肟化-硅烷化反應(yīng)的結(jié)構(gòu)通式示于圖1。

圖1 甾體激素衍生反應(yīng)結(jié)構(gòu)通式Fig.1 Reaction formula of Steroids with MOX and MSTFA

2.2 甾體激素衍生物的質(zhì)譜分析

采用1.2.2節(jié)方法對12種甾體激素進行衍生反應(yīng)，得到甾體激素衍生產(chǎn)物的色譜圖和質(zhì)譜圖，示于圖3。Preg(圖3a)、DHEA(圖3b)、AP(圖3c)、ADL(圖3d)、DHT(圖3e)和Epian(圖3f)的總離子流色譜圖中均只出現(xiàn)一個色譜峰，基線平整、峰形較好、待測物響應(yīng)信號強， 表明上述6種化合物經(jīng)衍生后均得到一種衍生產(chǎn)物。6種甾體激素中均存在羥基和酮基結(jié)構(gòu)，在質(zhì)譜圖中均檢測到[M+29+72]+質(zhì)譜峰，表明衍生產(chǎn)物為羥基和酮基分別發(fā)生肟化和硅烷化。同樣，在質(zhì)譜圖中觀測到[M-15]+、[M-31]+、[M-73]+、[M-90]+的質(zhì)譜峰，分別為肟化后和硅烷化后的特征峰，進一步確定其為肟化和硅烷化的產(chǎn)物。因此，上述6種甾體激素的酮基和羥基均發(fā)生衍生反應(yīng)，衍生效果較好。

圖2 Epian衍生產(chǎn)物(MO-TMS-Epian)的碎片離子及質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 Fragment ions and fragmentation pathways of derived Epian (MO-TMS-Epian)

注：a.Preg;b.DHEA;c.AP;d.ADL;e.DHT;f.Epian；g.P；h.ASD；i.T圖3 甾體激素衍生物的總離子流圖和碎片離子峰Fig.3 Total ion chromatograms and fragment ions of steroid hormone derivatives

P(圖3g)、ASD(圖3h)、T(圖3i)甾體激素的總離子流色譜圖中出現(xiàn)2個色譜峰。在質(zhì)譜圖中同樣觀測到[M-15]+、[M-31]+、[M-73]+、[M-90]+的碎片離子峰，表明它們也發(fā)生了肟化和硅烷化反應(yīng)，分別生成biMO-P、biMO-ASD、MO-TMS-T。三種化合物產(chǎn)生的衍生產(chǎn)物的碎片離子峰相同，它們各自的衍生產(chǎn)物為同分異構(gòu)體。通過對比這3種甾體激素發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)中均存在共軛雙鍵，該類化合物在與氮親核試劑發(fā)生加成反應(yīng)時，酮基中的π電子被拉向氧原子，酮基中的碳是缺電子中心，親核試劑從空間阻礙小的酮基平面上面或下面進攻碳原子，與酮基加成生成產(chǎn)物[5]，脫水后形成含有碳氮雙鍵的肟化產(chǎn)物。氮與酮基的碳生成碳氮雙鍵會影響幾何異構(gòu)的現(xiàn)象，形成順反異構(gòu)體，所以在總離子流色譜圖中出現(xiàn)雙峰，同時總離子流色譜圖中基線噪音較大，待測物信號較弱。

除上述9種甾體激素外，還有3種甾體E、B和E1相對復(fù)雜。E結(jié)構(gòu)中含有3個酮基，2個羥基，結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，理論上可以分別發(fā)生肟化和硅烷化反應(yīng)，同時酮基與苯環(huán)上的雙鍵形成共軛結(jié)構(gòu)。在E衍生產(chǎn)物的總離子流圖中檢測到6種衍生產(chǎn)物，示于圖4。色譜峰a和b的質(zhì)譜峰碎片相同，為同分異構(gòu)體(圖4a和圖4b)。圖4a中檢測到了連續(xù)失去碎片 —OCH3的m/z560、529、498和m/z470、439、408、377碎片離子，表明衍生結(jié)構(gòu)中存在3個肟化基團，即3個酮基均被衍生，即tR為40.92 min的這對同分異構(gòu)體是E中3個酮基和2個羥基完全衍生后的產(chǎn)物triMO-biTMS-E。衍生后其分子質(zhì)量為591 u，但在總離子流圖中并未檢測到m/z591質(zhì)譜峰，表明衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，發(fā)生了裂解。tR為42.06、42.14 min的2個衍生產(chǎn)物具有相同的碎片離子，在質(zhì)譜圖中均檢測到m/z562質(zhì)譜峰，表明二者是同分異構(gòu)體，示于圖4c，4d。m/z531是衍生產(chǎn)物失去一個—OCH3基團產(chǎn)生的碎片，同時質(zhì)譜圖中出現(xiàn)m/z441、351質(zhì)譜峰，表明其中含有2個硅烷化基團。結(jié)合E的結(jié)構(gòu)，推測tR為42.06、42.14 min的2個衍生產(chǎn)物為2個酮基和2個羥基發(fā)生衍生后的產(chǎn)物biMO-biTMS-E，而由于空間位阻的存在，推測其發(fā)生肟化反應(yīng)部位為C3和C11位連接的酮基。tR為43.14、43.39 min的化合物是一對同分異構(gòu)體(圖4e和圖4f)，其母離子為m/z490.13，在質(zhì)譜圖中檢測到m/z459、428、399質(zhì)譜峰，證實了衍生產(chǎn)物biMO-TMS-E是2個酮基和1個羥基分別發(fā)生肟化和硅烷化反應(yīng)得到的。同樣，由于受空間位阻的影響，推測衍生產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式示于圖4e、4f。

注：a.triMO-biTMS-E;b.triMO-biTMS-E;c.biMO-biTMS-E;d.biMO-biTMS-E;e.biMO-TMS-E；f.biMO-TMS-E圖4 甾體激素E衍生物的總離子流圖和碎片離子峰Fig.4 Total ion chromatograms and fragment ions of steroid bormone E derivatives

B結(jié)構(gòu)中含有2個酮基、2個羥基，酮基與苯環(huán)存在共軛結(jié)構(gòu)，共檢測到6種衍生產(chǎn)物，標(biāo)記為a～f，示于圖5。B結(jié)構(gòu)中存在共軛結(jié)構(gòu)，且質(zhì)譜圖5a、5b、5c、5d中母離子均為m/z548，比原分子質(zhì)量增加了202 u，表明衍生產(chǎn)物均為biTMS-biMO-B，這4種化合物為同分異構(gòu)體(tR分別為42.17、42.32、43.07、43.18 min)。圖5e和圖5f中分子離子峰為519 u，表明tR為43.37、43.62 min的化合物為MO-biTMS-B。

E1結(jié)構(gòu)中含有1個酚羥基及1個酮基，可以分別發(fā)生肟化和硅烷化反應(yīng)，在E1的衍生產(chǎn)物總離子流色譜圖中出現(xiàn)2個色譜峰，示于圖6，其中圖6a中母離子m/z371比衍生前的分子質(zhì)量增加101 u，同時質(zhì)譜圖中出現(xiàn)[M-31]+、[M-72]+峰，表明圖6a為肟化-硅烷化E1，即MO-TMS-E1。圖6b中母離子m/z299(tR為26.01 min)比衍生前的分子質(zhì)量增加 29 u，同時質(zhì)譜圖中出現(xiàn)[M-31]+峰，表明圖6b為肟化產(chǎn)物MO-E1，二者提取離子流峰面積比值為0.69∶1，表明E1結(jié)構(gòu)中的酮基由于受到苯環(huán)的吸電子作用，不易發(fā)生硅烷化反應(yīng)。

注：a.biMO-biTMS-B；b.biMO-biTMS-B；c.biMO-biTMS-B；d.biMO-biTMS-B；e.MO-biTMS-B；f.MO-biTMS-B圖5 甾體激素B衍生物的總離子流圖和碎片離子峰Fig.5 Total ion chromatograms and fragment ions of steroid hormone B derivatives

注：a.MO-TMS-E1;b.MO-E1圖6 甾體激素E1衍生物的總離子流圖和碎片離子峰Fig.6 Total ion chromatograms and fragment ions of E1 steroid hormone derivatives

甾體激素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，衍生反應(yīng)后產(chǎn)物較多，衍生產(chǎn)物的總離子流圖中均未能檢測到原型化合物。通過對衍生產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，所有硅烷化產(chǎn)物均生成m/z73碎片離子，該離子是三甲基硅烷衍生化后丟失的典型碎片—Si(CH3)3，可以作為硅烷化衍生產(chǎn)物的鑒定依據(jù)，同時出現(xiàn)[M-91]+峰。衍生產(chǎn)物質(zhì)譜圖中產(chǎn)生[M-31]+碎片離子，是丟失1個甲氧基產(chǎn)生的。在肟化-硅烷化產(chǎn)物中產(chǎn)生的m/z73碎片離子及[M-31]+碎片離子可以作為甾體激素肟化-硅烷化后衍生產(chǎn)物的鑒定依據(jù)。

2.3 衍生條件的考察

為獲得最佳的衍生條件，以DHEA為例，對衍生過程中關(guān)鍵的肟化反應(yīng)衍生溫度、反應(yīng)時間、衍生化試劑用量進行了考察。以不同條件下的提取離子流峰面積為縱坐標(biāo)，衍生條件為橫坐標(biāo)，得到的MO-TMS-DHEA關(guān)系曲線示于圖7。

在一定范圍內(nèi)，MO-TMS-DHEA的峰面積隨著MOX含量的增加而逐漸增加，持續(xù)增加MOX含量超過一定值后，會使峰面積下降，示于圖7a。表明增加MOX含量能夠提高衍生效率，但過量的MOX不利于反應(yīng)進行，需根據(jù)底物和衍生化試劑的用量換算，即酮基與衍生化試劑甲氧胺的比例在1∶20時的衍生反應(yīng)效率最高。隨著衍生時間的增長，衍生產(chǎn)物含量會發(fā)生變化，反應(yīng)時間在40 min時達到最大值，進一步延長反應(yīng)時間會導(dǎo)致衍生物降解，示于圖7b。在低溫條件下，衍生效果不佳，MO-TMS-DHEA的峰面積隨著溫度升高而增加，當(dāng)溫度達到80 ℃時，峰面積達到最大值，繼續(xù)升高溫度，峰面積值下降，這可能是溫度過高導(dǎo)致了衍生物降解，示于圖7c。因此，對于甾體激素中酮基肟化衍生化反應(yīng)，最佳條件為80 ℃反應(yīng)40 min，且酮基與MOX的摩爾比為1∶20。

2.4 甾體激素的線性范圍考察

在最佳衍生條件下，對12種標(biāo)準(zhǔn)對照品的線性關(guān)系進行初步考察。分別精密稱定各1 mg對照品，稀釋成濃度為10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.3節(jié)進行衍生，采用SRM掃描方式，以峰面積為指標(biāo)優(yōu)化掃描模式，得到衍生物的掃描離子對，結(jié)果列于表1。

注：a.衍生試劑體積；b.衍生時間；c.衍生溫度圖7 衍生條件對衍生產(chǎn)物生成量的影響Fig.7 Effect of conditions on the amount of derivatives

序號No.化合物Compounds分子式Molecular formula分子量MW離子對Ion pair(m/z)碰撞能量Collision energy/eV1DHEAC19H28O2288.21358/26882PregC21H32O2316.24386/31283APC21H34O2318.26419/32964ADLC19H30O2290.22391/27065EpianC19H30O2290.22391/27086DHTC19H30O2290.22391/27087PC21H30O2314.22372/28668EC21H28O5360.19441/282109TC19H28O2288.21389/269810E1C18H22O2270.16299/268611ASDC19H26O2286.19344/329612BC21H30O2346.21548/3616

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到含有異構(gòu)體的6種衍生后化合物triMO-triTMS-E、MO-TMS-T、MO-TMS-E1、MO-TMS-ASD、MO-TMS-P、biMO-biTMS-B的線性范圍為5～200 μg/L，而MO-TMS-DHEA、MO-TMS-Preg、MO-TMS-AP、MO-TMS-DHT、MO-TMS-ADL和MO-TMS-Epian的線性范圍為1～200 μg/L。表明上述12種衍生后甾體化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，在該反應(yīng)條件下的最低檢測限為1 μg/L。

3 結(jié)論

本實驗采用肟化-硅烷化方法研究了12種內(nèi)源性甾體激素酮基衍生反應(yīng)，結(jié)合GC/MS法分析衍生產(chǎn)物，系統(tǒng)研究了甾體激素酮基衍生規(guī)律。結(jié)果表明，肟化-硅烷化后可以顯著提高待測物的靈敏度，C3位含有羥基且C17(C20)位含有酮基的甾體激素(DHEA, Preg, AP, ADL, Epian, DHT)發(fā)生的肟化-硅烷化反應(yīng)完全，生成物的質(zhì)譜響應(yīng)高，雜質(zhì)生成量少，檢測靈敏度可以達到1 μg/L，這類甾體化合物采用GC/MS結(jié)合柱前衍生分析的效果較好。當(dāng)甾體激素中存在共軛結(jié)構(gòu)時易產(chǎn)生順反異構(gòu)體，產(chǎn)物復(fù)雜。通過優(yōu)化肟化反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)與甾體激素反應(yīng)的最佳條件是80 ℃反應(yīng)40 min，酮基與MOX的摩爾比為1∶20。該方法檢測甾體激素的靈敏度可達ng級，SRM掃描模式下的線性范圍可達1～200 μg/L，可為相關(guān)激素類成分的分析提供檢測技術(shù)支持。