高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血液中甲卡西酮及其代謝物卡西酮

劉冬嫻，張旭東，趙明明，賀江南

(1.湖南警察學院刑事科學技術(shù)系，湖南 長沙 410138；2.長沙市公安局禁毒支隊，湖南 長沙 410000)

甲卡西酮又稱“喪尸劑”、“浴鹽”、“喪尸藥”等，有強烈的興奮及致幻作用。濫用甲卡西酮會出現(xiàn)幻覺、鼻灼傷、惡心、嘔吐等癥狀，能夠造成高度的心理成癮，屬國家管制的第一類精神藥品。甲卡西酮進入生物體內(nèi)產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物為N位去甲基形成卡西酮[1]。甲卡西酮和卡西酮的化學結(jié)構(gòu)示于圖1。

圖1 甲卡西酮(a)和卡西酮(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of methcathinone (a) and cathinone (b)

在我國山西、廣東、黑龍江等地，甲卡西酮濫用的形勢嚴竣[2]，現(xiàn)已成為司法鑒定中常見的分析目標物之一。目前，檢測甲卡西酮的方法主要有非生物樣品的液相色譜法(LC)[3]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[4-5]及氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)[6-7]等，主要對禁毒實踐中查獲的疑似毒品甲卡西酮進行定性、定量分析。有報道利用GC/MS檢測血液[8]、尿液[9-11]中甲卡西酮，其中GC/MS法檢測血液中甲卡西酮定量限為0.1 mg/L，未涉及代謝物卡西酮的檢測；S?rensen[12]建立了LC-ESI-MS/MS法測定血樣中卡西酮、甲卡西酮等10多種毒品成分，檢出限分別為1.4、2.0 μg/L；Swortwood等[13]建立了LC-QQQ-MS/MS法檢測血清中甲卡西酮及其衍生物，定量限為10 μg/L，線性范圍為10～250 μg/L；Zhang等[14]建立了UPLC-MS/MS法檢測全血和尿液中安非他命、甲卡西酮等12種毒品成分，采用Oasis MCX柱進行固相萃取，萃取前樣品經(jīng)稀鹽酸預處理，上清液過柱，之后依次用稀鹽酸、甲醇、氨水洗柱，用5%氨水甲醇溶液洗脫，血液中甲卡西酮、卡西酮的線性范圍分別為0.1～10、0.5～50 μg/L。

本研究擬建立HPLC-MS/MS法檢測血液中甲卡西酮及其代謝物卡西酮，并應用該方法測定中毒家兔血液中甲卡西酮及卡西酮的含量。

1 實驗部分

1.1 儀器與設(shè)備

Agilent 1290/6470A HPLC-MS/MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；TG16-WS臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；BSM-3200.2電子天平：上海卓精電子科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

1 g/L甲卡西酮、卡西酮標準儲備液：由公安部禁毒局國家毒品實驗室提供，使用前用甲醇稀釋成所需濃度的標準工作液；鹽酸SKF525A(雙苯戊二氨酯，純度95%)：Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，稱取11.61 mg鹽酸SKF525A(折合10.00 mg SKF525A)溶于10 mL甲醇中，配制成0.1 g/L標準工作液；含50 μg/L內(nèi)標SKF525A的乙腈溶液的制備：準確吸取125 μL 0.1 g/L SKF525A內(nèi)標溶液于250 mL容量瓶中，加入50 mL乙腈，混勻，用乙腈定容至刻度，置于4 ℃冰箱冷藏；乙腈、甲醇、甲酸：均為色譜純；空白血液：健康、正常人體近期未服用過藥物的新鮮血液；實驗用水：去離子純凈水；一次性真空采血管(枸緣酸鈉1∶9)：山東省成武縣醫(yī)用制品廠產(chǎn)品；實驗家兔(許可證號SCXK(湘)2015-0004)：購于湖南太平生物科技有限公司。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Column Eclipse Plus C18柱(100 mm×3 mm×1.8 μm)；柱溫45 ℃；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～3 min(95%～90%A)，3～4 min(90%～40%A)，4～5 min(40%～5%A)，5～9 min(5%～95%A)，9～10 min(95%A)；流速0.3 mL/min；進樣量1 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)；離子源溫度：350 ℃；噴霧電壓：3.5 kV；檢測方式：多反應監(jiān)測模式(MRM)；每個化合物分別選擇兩個離子對作為定性離子對，其定性離子對、定量離子對、碰撞能量和保留時間列于表1。

表1 卡西酮、甲卡西酮和SKF525A的定性離子對、碰撞能量和保留時間Table 1 Qualitative ion pair, collision energy and retention time of cathinone, methcathinone and SKF525A

注：*為定量離子對

1.4 檢材處理

取1 mL待檢血液于10 mL離心管中，加入2 mL含50 μg/L內(nèi)標SKF525A的乙腈溶液，渦旋混勻5 min，振蕩提取20 min，以8 000 r/min離心15 min，分離上清液，過0.22 μm微孔有機濾膜于1.5 mL樣品瓶中,供LC-MS/MS分析，采用內(nèi)標法-標準曲線法定量分析。

1.5 動物實驗

取8只質(zhì)量為(2.0±0.2) kg的家兔，雌雄不限，分為4組：第1組3只，分別編號T2101、T2102、T2103；第2組1只(空白對照組)，編號T2100；第3組3只，分別編號T2401、T2402、T2403；第4組1只(空白對照組)，編號T2400。按家兔質(zhì)量，以20 mg/kg劑量，第1組靜脈注射10 g/L甲卡西酮氯化鈉溶液，第2組靜脈注射氯化鈉溶液，第3組灌胃10 g/L甲卡西酮氯化鈉溶液，第4組灌胃氯化鈉溶液。分別于給藥后1、2、4、6、8 h采集各組家兔的耳根靜脈血，按1.4節(jié)方法進行檢材處理，按1.3節(jié)方法進行LC-MS/MS檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)標物的選擇

檢測結(jié)果的準確性受樣品前處理過程及檢測方法定量重復性的影響，本研究采用添加內(nèi)標法消除這些影響，考察了SKF525A作為內(nèi)標物的提取行為及色譜行為。結(jié)果表明，SKF525A提取回收率穩(wěn)定，血液中添加50 μg/L內(nèi)標物，其提取回收率可達95.49%(RSD為5.0%，n=6)，與檢測目標物提取回收率同步；其色譜保留時間與分析目標物較接近，且對目標物無干擾，故選擇SKF525A作為內(nèi)標物。

2.2 色譜分離

按1.4節(jié)方法對空白血液及添加卡西酮(10 g/L)、甲卡西酮(10 g/L)的空白血液進行檢材處理，LC-MS/MS法檢測，空白血液的總離子流圖示于圖2，血液添加樣品總離子流圖及MRM色譜圖示于圖3。在該實驗條件下，卡西酮、甲卡西酮、SKF525A都得到分離，保留時間分別為4.604、5.175、5.735 min，檢材中內(nèi)源性雜質(zhì)對檢測目標物無干擾。

圖2 空白血液總離子流圖Fig.2 TIC chromatogram of blank blood

2.3 回歸方程與線性范圍

圖3 空白血液添加卡西酮和甲卡西酮的總離子流圖(a)及卡西酮(b)、>甲卡西酮(c)、SKF525A(d)的MRM色譜圖Fig.3 TIC chromatogram of blank blood added with cathinone and methcathinone (a), MRM chromatograms of cathinone (b),methcathinone (c) and SKF525A (d)

取適量的100.0 mg/L甲卡西酮、卡西酮標準工作液，用甲醇逐級稀釋，添加到空白血液中，渦旋5 min，分別配制成含0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 g/L甲卡西酮、卡西酮的血液樣品。血液樣品按1.4節(jié)方法處理，LC-MS/MS法檢測，以甲卡西酮、卡西酮與SKF525A色譜峰面積之比為y，以甲卡西酮、卡西酮濃度為x(g/L)進行線性回歸。結(jié)果表明，甲卡西酮在0.2～2 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.014 1x+0.140 6(r=0.999)；卡西酮在0.5～2 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.007 1x-0.023 1(r=0.999)。

分別以3倍和10倍信噪比確定檢出限和定量限，甲卡西酮檢出限為0.1 μg/L、定量限為0.2 μg/L；卡西酮檢出限為0.2 μg/L、定量限為0.5 μg/L，其MRM色譜圖示于圖4。

2.4 回收率及精密度

取適量的空白血液，按2.3節(jié)方法分別配制含0.5、5、50、500 μg/L甲卡西酮、卡西酮的質(zhì)量控制樣品各5份，按照回歸方程計算質(zhì)量控制樣品中甲卡西酮、卡西酮的含量，以質(zhì)控樣品中甲卡西酮、卡西酮的濃度與添加甲卡西酮、卡西酮濃度之比計算回收率，對4個濃度的血液樣品同日內(nèi)重復測定6次計算日內(nèi)精密度，5日內(nèi)重復測定5次計算日間精密度，結(jié)果列于表3。

圖4 甲卡西酮(a)、卡西酮(b)的定量限MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of LOQ of methcathinone (a) and cathinone (b)

表3 添加回收率及精密度Table 3 Recoveries and precision of this method

2.5 家兔血液樣品的測定

按1.4節(jié)方法和1.3節(jié)條件對家兔血液樣品進行處理及檢測，依據(jù)血液樣品中甲卡西酮及其代謝物卡西酮含量檢測結(jié)果分析其代謝規(guī)律，結(jié)果示于圖5。

由圖可見，家兔經(jīng)靜脈注射、灌胃方式給藥甲卡西酮后，血液中甲卡西酮及其代謝物卡西酮均在1 h達到峰值。靜脈注射給藥后血液中甲卡西酮峰值遠高于灌胃，代謝物卡西酮峰值受給藥方式影響不明顯，可能是靜脈注射甲卡西酮可以直接進入血液循環(huán)。靜脈注射給藥6 h后，血液中甲卡西酮含量降低至峰值的0.0%～1.6%，8 h后低于檢出限，卡西酮含量降低至峰值的2.6%～8.3%；灌胃給藥8 h后血液中甲卡西酮含量降低至峰值的0.8%～22.5%，卡西酮含量降低至峰值的6.8%～13.7%。靜脈注射給藥方式血液中甲卡西酮及其代謝物卡西酮消除速率明顯高于灌胃給藥方式。編號T2403在灌胃給藥6 h后，血液中甲卡西酮含量降低至峰值的4.9%，8 h后甲卡西酮含量上升至峰值的22.5%。二次峰值是個體差異所致還是其他原因則有待進一步研究。此外，給藥0～1 h后是否存在峰值、8 h后代謝規(guī)律如何、給藥劑量對代謝規(guī)律的影響等問題也有待進一步研究。

注：空白對照組T2100、T2400在1、2、4、6、8 h血液樣品中均未檢出甲卡西酮及其代謝物卡西酮圖5 家兔體內(nèi)甲卡西酮代謝規(guī)律Fig.5 Metabolism rule of methcathinone in rabbits

3 結(jié)論

本研究建立了LC-MS/MS法測定血液中甲卡西酮、卡西酮，應用該方法對實驗動物血液進行檢測，并推測了甲卡西酮的代謝規(guī)律。該方法操作簡便、檢測靈敏度高，可用于血液樣品中甲卡西酮、卡西酮的測定。